Ifa резюме какъв анализ. Имуноензимен кръвен тест: интерпретация, методи. Видео: модерен ензимен имуноанализ

В практиката най-често се използват три варианта на твърдофазов имуноанализ - индиректен имуноанализ, директен имуноанализ и имуноанализ тип сандвич. Разликите между тези видове имуноанализи са следните. При косвената версия на имуноанализа, на първия етап, антигенът се адсорбира върху повърхността на ямките на полистиролова плака. След отстраняване на несвързаните антигенни молекули се добавя проба, съдържаща антитела, специфични за този антиген. Получените комплекси антиген-антитяло се откриват с помощта на анти-видови антитела, конюгирани с който и да е етикет (фиг. 1А). В директната версия на имуноанализа, откриването на сорбирания антиген се извършва директно с помощта на специфични антитела, конюгирани с етикет (фиг. 1В). При имуноанализ тип сандвич, на първия етап не антигенът, а антителата, специфични за изследвания антиген (субстратни антитела), се адсорбират върху повърхността на плаката. След отстраняване на несвързаните молекули на антитялото се добавя проба, съдържаща антигена. За откриване на получения субстратен комплекс антитяло-антиген се добавят втори антитела, които са специфични за друг, пространствено отдалечен, епитоп на антигена, конюгиран с който и да е етикет (фиг. 1В). Използването на сандвич тип имуноанализ на антитела, специфични към два различни епитопа на антиген, позволява да се постигне висока чувствителност и специфичност при определяне на антигена дори в такива хетерогенни проби като кръвна плазма.

Ориз. 1. Принцип на индиректен (A), директен (B) и сандвич тип имуноанализ (C)

Индиректен ензимен имуноанализ (индиректен ELISA)

Методът за индиректен имуноанализ се характеризира с 3-етапен процес, на първия етап от който антигенът се адсорбира върху специално подготвена пластмаса, на втория етап антитела, специфични за него, взаимодействат с антигена, а на третия етап антивидови антитела конюгирани с ензим се въвеждат в системата, предизвиквайки индикаторна ензимна реакция. В тази техника пероксидазата от хрян се използва като ензим. Реакцията се провежда в специални 96-ямкови плаки.

I. Сорбция на антиген

Ямките на 96-ямкова плака за имуноанализ сорбират 0,1-0,5 μg антиген на ямка в 100 μl фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Инкубацията се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча. Промиване (2-кратно) на несвързани антигенни молекули се извършва с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1% Tween-20 (PBS).

II. Ключалка

За да се блокират неспецифичните места на свързване, ямките на плаката се пълнят с PBST и се инкубират за 10-15 минути при стайна температура.

III. Титруване на специфични антитела

Титруването може да се извърши както в хоризонтални, така и във вертикални редове на таблетката. Трябва да се отбележи, че титруването на антителата се извършва, ако е необходимо да се избере оптималната концентрация на антитела или да се определи титърът. Ако се определи оптималната концентрация и/или титър на антитела, тогава се използва препоръчителното разреждане за тези специфични антитела.

При титруване към първата ямка от редицата се добавя готово разреждане на антитела - средно 1-10 μg на ямка, след което се извършва последователно разреждане на антителата в ямките. Инкубацията със специфични антитела се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча. Измиването се извършва с PBST 3 пъти.

IV. Добавяне на анти-видови антитела, конюгирани към ензимен маркер

Анти-видовите поликлонални антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян, се използват като детекторни (вторични) антитела. Най-често се използват кози или заешки антитела, специфични за цялата молекула или за Fc фрагментите на специфични антитела. Концентрацията на детекторните антитела обикновено се посочва от производителя като разреждане на основния разтвор (например 1:1000). Инкубацията с вторични антитела се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча. Измиването се извършва с PBST 5-6 пъти.

Пероксидазата от хрян катализира реакцията на окисление на субстрата с водороден пероксид. О-фенилендиамин (OPD) се използва като субстрат за пероксидаза от хрян. В резултат на реакцията се образува цветен окислителен продукт на OPD.

Субстратен разтвор: Към 10 ml субстратен буфер (0,1 M Na-цитратен буфер, pH 4,5) добавете 0,01 ml 30% водороден пероксид и 0,2 ml 50x OPD разтвор (340 mg OPD в 10 ml етилов алкохол; съхранявайте на – 20°C).

Инкубацията се провежда в продължение на 10 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча.

V. Спиране на ензимната реакция

VI. Измерване на оптична плътност

Директен ензимен имуноанализ (директен ELISA)

Техниката на директен имуноанализ има само малки разлики в сравнение с техниката на индиректен имуноанализ. По този начин етапи I и II са еднакви и при двата вида анализ. Разликата е, че в директната версия на имуноанализа, етап III използва специфични антитела, конюгирани с ензимен маркер. Ако е необходимо, също така е възможно да се титруват специфични антитела, конюгирани с ензимен маркер, подобно на описаното по-рано за неконюгирани антитела. Етап IV се пропуска и следващите етапи (V-VII) се провеждат подобно на описаните по-горе за индиректния вариант на имуноанализа.

Имуноанализ тип сандвич

Ориз. 2. Схематично представяне на сандвич имуноанализ. ATP - субстратно антитяло, ATD - детекторно антитяло, AG - антиген, M - етикет, ковалентно свързан с детекторното антитяло, P - субстрат, върху който се сорбира субстратното антитяло.

Тази версия на имуноанализа (фиг. 2) използва двойка антитела, специфични за пространствено отдалечени епитопи на антигена, който се изследва.

I. Сорбция на субстратни антитела

Субстратните антитела, 1-2 μg на ямка, се абсорбират в ямките на 96-ямкова плака за имуноанализ в 100 μl фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Инкубацията се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча. Промиване (2-кратно) на несвързани антигенни молекули се извършва с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1% Tween-20 (PBS).

II. Ключалка

За да се блокират неспецифичните места на свързване, ямките на плаката се пълнят с PBST и се инкубират за 10-15 минути при стайна температура.

III. Инкубация с антиген

50 µl от тестовия разтвор или стандартни разреждания на антигена се добавят към ямките на плаката с предварително адсорбирани антитела. Антигенните разреждания трябва да се приготвят с помощта на PBST, тъй като Tween-20 намалява неспецифичното свързване на протеинови молекули една към друга и към повърхността на плаката. Както тестовият разтвор, така и стандартните антигенни разреждания се добавят по двойки (или в 3 повторения), като се използват две (три) ямки за всяко протеиново разреждане. Инкубацията се извършва при стайна температура в продължение на 30 минути при непрекъснато разбъркване. Промиването се извършва с разтвор на PBST 3 пъти.

IV. Инкубация с антитела, конюгирани с ензимен маркер

100 μl от разтвор на специфични антитела, конюгирани с ензимен етикет, се добавят към ямките на плаката. Оптималната концентрация на конюгираните антитела обикновено се посочва от производителя (обикновено се използва концентрация от 2-4 μg/ml). Инкубирането с антитела, съдържащи ензимен маркер, се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча. Измиването се извършва с PBST 5-6 пъти.

V. Провеждане на ензимна реакция, придружена с появата на оцветен продукт

100 μl от субстратния разтвор се добавят към ямките и се инкубират за 10 минути при стайна температура и постоянно разбъркване.

VI. Спиране на ензимна реакция

Преди измерване на оптичната плътност цветната реакция се спира с 0,5 M H2SO4. След инкубиране към ямките с работния разтвор на OPD се добавят 50 μl разтвор на 0,5 М сярна киселина. След това можете веднага да започнете да измервате оптичната плътност.

VII. Измерване на оптична плътност

Оптичната плътност на разтвора на оцветения продукт се измерва при λ=490 nm с помощта на пластинков спектрофотометър.

печатна версия

Имуноанализ (ELISA)

Имуноанализ или метод (ELISA) — откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с маркерен ензим (пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза и/или алкална фосфатаза). След комбиниране на антигена с белязания с ензим имунен серум, субстратът/хромогенът се добавя към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и цветът на реакционния продукт се променя - интензитетът на цвета е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Компонентите се откриват чрез добавяне на белязани антитела или антигени. Ако резултатът е положителен, цветът на хромогена се променя.

Твърдофазов индиректен ензимно-свързан имуносорбентен анализ

Всеки път след добавяне на друг компонент несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез промиване.
I. При определяне на антитела, кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, маркиран с ензим, и субстрат/хромоген за ензима се добавят последователно към ямките на плаките със сорбиран антиген.

II. При определяне на антиген се добавя антиген към ямките със сорбирани антитела (например кръвен серум с желания антиген), добавя се диагностичен серум срещу него и вторични антитела (срещу диагностичния серум), маркирани с ензим, и след това субстрат/хромоген за ензима.

Конкурентна ELISA за откриване на антитела:желаните антитела и ензимно белязаните антитела се конкурират помежду си за антигени, адсорбирани върху твърдата фаза.

Определяне на пероксидазен етикет с помощта на усилена хемилуминесценция. Разработване на бързи методи за ензимен имуноанализ, извършвани с помощта на преносими устройства. Синергия и степен на подобрение. Интензивност и продължителност на светлинното излъчване.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ с усилена хемилуминесценция

ВЪВЕДЕНИЕ

Ензимният етикет може да бъде количествено определен с помощта на различни методи, например с помощта на колориметрия, флуориметрия, радиометрия и потенциометрия.

Напоследък за тази цел се използва и хемилуминесценция или биолуминесценция. Ензимните маркери, които могат да бъдат определени с помощта на реакции, придружени от излъчване на светлина, са представени в таблица. 1. Като цяло чувствителността на методите за химио- и биолуминесцентно откриване е много висока и ако се използва и усилване на сигнала от ензимен етикет, тогава чувствителността на съответните методи за имуноанализ трябва да бъде изключително висока.

Възможностите на биолуминесцентния метод наскоро бяха демонстрирани чрез примера за определяне на D-галактозидаза. Използвайки свързаната реакция на галактозна дехидрогеназа AOH:PMN оксидоредуктаза-бактериална луцифераза, беше възможно да се открият 2 * 10″22 mol /3-галактозидаза.

Пероксидазата от хрян се използва широко като маркер в ензимно-свързаните имуносорбентни анализи; методите за приготвяне и стабилизиране на конюгати, с които са добре проучени.

Най-често пероксидазата от хрян се определя колориметрично, но за тази цел могат да се използват и различни химио- и биолуминесцентни реакции.

Подробно е проучено определянето на пероксидаза с помощта на хемилуминесцентна реакция в системата луминол-водороден пероксид, усилена с фенолни съединения.

Този подход за определяне на ензимната активност има редица предимства в сравнение с други методи за определяне; основните му характеристики са изброени в табл. 2.

Усилватели. Различни съединения, включително 6-хидроксибензотиазоли, като луциферин, феноли, нафтоли и амини, имат способността да усилват светлинното излъчване в луминалната оксидационна реакция с водороден пероксид, катализирана от пероксидаза.

На фиг. Фигура 1 показва структурите на представители на вещества от всеки клас. Степента на усилване на светлинното излъчване зависи от концентрацията на реагентите. Типична зависимост на интензитета на луминесценция от концентрацията на усилвателя при реакцията на луминол с водороден пероксид, катализирана от пероксидаза и усилена от 6-хидрокси-бензотиазол, е показана на фиг.

Синергия и степен на подобрение. В системата пероксидаза - луминал - водороден прекис, син-

rgism, както се вижда от данните, дадени в табл. 3. Степента на усилване се влияе от много фактори; Въпреки това е постигнато увеличение на излъчването на светлина над 500 пъти.

При наличието на определени усилватели, излъчването на фонова светлина в системата луминол-водороден пероксид намалява. При определяне на активността на пероксидазата това позволява да се увеличи съотношението сигнал / шум с няколко порядъка само чрез използването на такива усилватели.

Повишената луминесценция е характерна за различни циклични диацилхидразиди, когато са изложени на окислители в присъствието на пероксиндаза. Усилването не се наблюдава при някои вещества с пероксидазна активност, като хемоглобин, който катализира само колориметрични реакции.

Този факт показва по-висока специфичност на подобрения хемилуминесцентен анализ в сравнение с колориметричните методи. Спектрите на излъчваната светлина са почти еднакви при усилени и неусилени реакции. Това „подсказва, че самият усилвател не излъчва светлина.

При липса на усилватели, хемилуминесценцията в системата пероксидаза-луминол-пероксид очевидно е ограничена от относително бавната реакция на пероксиндазата, под формата на така нареченото съединение II, с луминол, в резултат на което се образуват луминолови радикали и пероксидазата се регенерира.

Усилватели, способни да реагират бързо с такова съединение, могат да увеличат излъчването на светлина, ускорявайки превръщането на Съединение II в активна пероксидаза.

Продуктите на преобразуване на усилвателя могат след това да реагират бързо с луминола, за да образуват допълнителни луминолови радикали и по този начин допълнително да увеличат излъчването на светлина. Бустерите могат също така да са насочени към неактивни пероксидазни междинни продукти™, като Съединение III.

Реактиви

Важен фактор при определяне на пероксидазната активност с помощта на усилена хемилуминесценция е химическата чистота на цикличните диацилхидразиди.

Проучване на различни проби от луминол показа, че примесите влияят отрицателно на излъчването на светлина. В резултат на фотохимични и термични процеси луминолът се разлага частично и получените примеси влияят върху кинетиката и интензитета на светлинното излъчване.

В табл 4 представя резултатите от сравнение на чистотата и свойствата на някои налични в търговската мрежа луминолови препарати, както и натриевата сол на луминола, пречистена чрез прекристализация от разтвор на натриев хидроксид.

2. ПОДОБРЕН ХЕМИЛУМИНЕСЦЕНТЕН ИМУНОТЕСТ

Подобрен хемилуминесцентен имуноанализ с пероксидаза като ензимен маркер е използван за определяне на много съединения. Редица примери са дадени в табл. 5. Тези имуноанализи използват конкурентни и имунни комплексни методи за екстракция, както и най-често използваните твърди подложки.

съотношение сигнал/фон за хемилуминесцентно определяне на пероксидаза от хрян, усилена с 1-йодофенол; 6 TLC - тънкослойна хроматография.

ориз. Фигура 3 показва диаграма за определяне на фоликулостимулиращия хормон. При този метод границата на откриване на FSH върху микротитърна плака е около 0,01 ppm. Методът се характеризира с отлична възпроизводимост както в рамките на един анализ, така и между анализите.

Подобреният хемилуминесцентен метод също е успешно използван за откриване на пероксидазни етикети в изследвания на ДНК хибридизация.

МЕТОД ЗА ФЛУОРЕСЦИРАЩИ АНТИТЕЛА (FFA).

метод за количествено определяне с помощта на пластинков фотометър и качествен анализ с помощта на фотографско детектиране с чувствителност от няколко пикограма.

Устройства

Понастоящем промишлеността произвежда няколко вида луминометри, подходящи за измерване на светлината, излъчвана при усилени хемилуминесцентни реакции.

Някои от тези луминометри са модифицирани специално за подобрен хемилуминесцентен анализ. Интензитетът и продължителността на светлинното излъчване в реакциите за усилване на луминесценцията улесни разработването на прости луминометри, които използват силициеви фотодиоди или високоскоростен фотографски филм като детектори.

Такива луминометри са сравнително евтини, преносими и следователно могат да се използват извън лаборатории. В момента MAST Immunosystems произвежда специални камери за хемилуминесцентно откриване в метода ELISA на алерген-специфичен имуноглобулин Е. Може да се предположи, че в бъдеще ще бъдат създадени комплекти с фотографски запис на резултатите от ELISA и други съединения, чието определяне трябва да се извършват в клиники, болници или у дома.

Произвежда инструменти и комплекти реактиви.

Подобрените комплекти за хемилуминесцентен ензимен имуноанализ и свързаните с тях инструменти вече се предлагат на пазара под името Amerlite от Amersham International pic.

Анализът се извършва върху бели ленти за микротитърна плака, а измерванията на луминесценцията се извършват бързо и автоматично от специален луминометър за микроплака.

В момента се произвеждат комплекти за определяне на тиреостимулиращ хормон, човешки хориогонадотропин, карциноембрионален антиген, алфа-фетопротеин, тироксин, трийодтиронин и за определяне на свободния тироксин индекс. Тези анализи имат висока чувствителност и отлична възпроизводимост.

ИЗВОДИ

Определянето на пероксидазния маркер с помощта на подобрена хемилуминесценция е силно чувствително, специфично и просто и може да се използва като основа за разработването на удобни и бързи методи за ензимно-свързан имуносорбентен анализ, извършвани с помощта на евтини преносими устройства.

Принципи на имуноензимния анализ, основни видове ELISA, приложение в диагностиката

Методи за имуноанализ в медицинската практика, взаимодействието на антиген и антитяло в основата им.

Видове имуноанализ в зависимост от вида на етикета и условията на изследване. Характеристики на компонентите, използвани в ензимен имуноанализ.

резюме, добавено на 11/07/2011

Серологични реакции

Серологични реакции като реакции между антигени и антитела in vitro.

Класификация на серологичните реакции в зависимост от естеството и физическото състояние на антигена. Реакция на утаяване на гел съгласно Ouchterlony. Мактода на ензимен имуноанализ.

презентация, добавена на 03.06.2015 г

Спектрален анализ на електрокардиограмата

Инструменти за запис и анализ на електрокардиограми. Сравнение на аналогова и цифрова обработка на сигнали.

Изследване на електрокардиографски сигнали, получени с помощта на електрокардиограф със свръхвисока разделителна способност. Възможности за анализ с помощта на пакета MatLab.

резюме, добавено на 12/09/2011

Приложение на радиацията в медицината

Лечение на бронхиална астма с инфрачервено лъчение. Изкуствени източници на ултравиолетово (UV) лъчение в медицината. Озон и бактерицидни лампи без озон.

Дезинфекция на питейна вода чрез UV лъчение. Рентгенова диагностика, проектиране на апарати.

резюме, добавено на 27.08.2009 г

акромегалия

Акромегалията е заболяване, свързано с повишено производство на растежен хормон (соматотропен хормон). Клинична картина на заболяването. Характерен лабораторен показател за акромегалия по време на диагностика. Тест с тиреотропин-освобождаващ хормон. Рентгеново лечение.

презентация, добавена на 03.05.2012 г

Туморни маркери в клиничната практика

Използването на лабораторен анализ за диагностика на рак и постоперативно наблюдение на ефективността на хирургията и химиотерапията.

Определяне на туморни маркери чрез ензимен имуноанализ, имунолуминесцентни и радиоимуноанализни методи.

резюме, добавено на 10/09/2010

Физико-химични методи за анализ на лекарства

Класификация на физикохимичните методи за анализ. Молекулен абсорбционен спектрален анализ. Закони за поглъщане на радиация. Визуална колориметрия. Определяне на концентрация при фотоелектроколориметрия. Спектрофотометрия на лекарства.

резюме, добавено на 14.11.2010 г

Основни области на приложение на активираната хемилуминесценция

Механизмът на реакциите, придружени от блясък на живи организми, видими с просто око.

Използването на активирана хемилуминесценция и биолуминесценция като инструмент в биомедицинските изследвания на кръвен серум, урина, цереброспинална течност и слюнка.

курсова работа, добавена на 25.10.2011 г

Съвременни методи за диагностика на инфекциозни заболявания

Методи за диагностика на заразни болести по животните.

Полимеразна верижна реакция. Ензимен имуноанализ и неговите цели. Диагностика на инфекции, причинени от стафилококи, пневмококи и салмонелни инфекции. Причинителят на бруцелозата, нейната диагноза.

резюме, добавено на 26.12.2013 г

Луминесцентни етикети

Концепцията за луминесценция, нейната физическа природа и причини за възникване.

Правилото на Стокс. Видове луминесценция (фотолуминесценция, хемилуминесценция) и нейното излъчване. Основни закони на топлинното излъчване. Луминесцентни, качествени и количествени анализи на субстанции.

презентация, добавена на 05/05/2016

Сърдечна исхемия

1.1 Класификация на ИБС

ИБС включва няколко заболявания, които се различават значително по клинични прояви.

Клиника на хроничен пулпит: фиброзен, хипертрофичен, гангренозен

Класификация

Остър пулпит хиперемия на пулпа серозен ограничен серозен дифузен гноен травматичен Хроничен пулпит фиброзен гангренозен хипертрофичен (пролиферативен) Екзацербация на хроничен пулпит Хроничен...

Лактационен мастит

4.

Класификация

Хирургична класификация на мастита: I. По причина на заболяването: 1. Неспецифичен. 2. Специфични. II. Според функционалното състояние на гърдата: 1. Кърмене.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

2. Нелактационни. III. Според протичането на възпалителния процес: 1. Остър. 2. Хронична. IV...

Лечебни растения и лечебни растителни суровини, използвани в медицината при уролитиаза

1.1 Класификация

Уролитиазата може да се класифицира според местоположението на камъните: камъни в бъбреците и уретера (нефроуретеролитиаза), камъни в пикочния мехур. Възможно е уролитиазата да се раздели в зависимост от състава на камъните...

Рак на ларинкса

3.

Класификация

Според националната класификация на рака на ларинкса (Сборник инструкции на Министерството на здравеопазването) има 4 стадия: I стадий: туморът заема само част от една част на ларинкса и не прониква по-дълбоко от субмукозния слой...

Рак на пикочния мехур

2. Класификация

Неоплазмите на пикочния мехур са представени предимно от преходноклетъчен карцином.

Въпреки това, за да предотвратим диагностични грешки, не трябва да забравяме, че...

Карцином на хранопровода

Класификация

Международна хистологична класификация на езофагеалните тумори (1990): Епителни тумори. Доброкачествени тумори. Плоскоклетъчен папилом. Вирусна брадавица. Аденом. Злокачествени тумори.

Плоскоклетъчен карцином...

Рани, класификация на рани, механична антисептика при лечение на рани

Класификация на раните

Има няколко класификации на рани. Въз основа на естеството на увреждането на тъканите се разграничават рани: прободни, нарязани, нарязани, натъртени, разкъсани, ухапани, отровени, огнестрелни. Прободните рани се нанасят с прободно оръжие (щик, игла и др.)...

Растителни източници на танини и тяхното използване в медицината

2.

Класификация

Всички танини се разделят на танини: хидролизируеми и кондензирани. Хидролизираните танини под действието на разредени минерални киселини, основи и ензими танин ацил хидролаза се разграждат до въглехидрати и фенолкарбоксилни киселини...

Рехабилитация на деца с церебрална парализа

1.2 Класификация на церебралната парализа.

В момента в Руската федерация се използва класификацията на K.A.

Семенова (1974). - спастична диплегия - засягат се предимно краката - двойна хемиплегия - спастична тетрапареза, малко повече се засягат ръцете...

Ревматоиден полиартрит

1. Класификация

Ревматоидният артрит остава във фокуса на вниманието на ревматологичната наука от десетилетия, което е отражение на голямото значение на заболяването в общомедицински и социален план...

Ролята на немедикаментозното лечение на бронхиалната астма

1.1.1 Класификация

Бронхиалната астма (БА) е разделена на фаза на обостряне (разгара на заболяването) и ремисия (когато практически няма признаци на заболяването).

По време на астматичен пристъп има период на предупредителни признаци (кихане, хрема и др.)

Ролята на фелдшера в диагностиката, лечението и профилактиката на тетанус. Противоепидемични мерки при огнище на заразни болести. Динамика и сравнителен анализ на заболяванията от тетанус в Салска област за периода 2013-2014 г.

1.4 Класификация

Характеристиките на класификацията отчитат различни фактори - механизма на инфекцията, разпространението и тежестта на конвулсивния синдром и характеристиките на клиничното протичане.

Като се вземат предвид тези фактори, се разграничават следните форми на тетанус: 1...

Ролята на фелдшера в организирането и провеждането на диагностични, терапевтични и превантивни мерки за борба с хипертонията

1.2 Класификация

През целия период на изследване на заболяването е разработена повече от една класификация на хипертонията: според външния вид на пациента, причините за повишаване на налягането, етиологията, нивото на налягането и неговата стабилност, степента на органно увреждане , естеството на курса...

Диабет

1.1 Класификация

Има няколко вида класификация на захарния диабет, които се основават на клиничната картина, етиологията, степента на компенсация на въглехидратния метаболизъм, тежестта на лечението, усложненията.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)– съвременен лабораторен тест, който търси специфични антитела в кръвта или антигени към определени заболявания, за да се установи не само етиологията, но и стадия на заболяването.

Резултатите от ELISA могат да бъдат дадени качествено и количествено.

В момента ELISA се използва в следните ситуации:

1) Търсене на специфични антитела към всяко инфекциозно заболяване;
2) търсене на антигени на всякакви заболявания (инфекциозни, венерологични);
3) изследване на хормоналния статус на пациента;
4) изследване за туморни маркери;
5) изследване за наличие на автоимунни заболявания.

Предимства на метода ELISA:

1) Висока специфичност и чувствителност на метода ELISA (повече от 90%).
2) Възможността за определяне на заболяването и проследяване на динамиката на процеса, т.е. сравняване на броя на антителата в различни периоди от време.
3) Наличие на ELISA диагностика във всяка медицинска институция.

Относителен недостатък:

1) Откриване на имунния отговор (антитела), но не и на самия патоген.

Основни понятия

Преди да изясним същността на метода ELISA, нека накратко разберем някои понятия.
Антитела (или имуноглобулини - Ig)- специфични протеини, произведени от B -
лимфоцити (имунни клетки) в отговор на всеки инфекциозен патоген (вируси, бактерии, гъбички и др.), навлизащ в тялото.

Има имуноглобулини А (IgA), имуноглобулини Е (IgE), имуноглобулини М (IgM), имуноглобулини G (IgG), имуноглобулини D (IgD). Те се различават помежду си по молекулна форма и тегло, полуживот, участие/неучастие в инфекциозни процеси и време на откриване от момента на заразяване. Ако вземем предвид молекулното тегло, тогава IgM има най-голямо тегло - това е пентамер (950 000 далтона) за разлика от други Ig (от 150 до 200 000 Da), поради което IgM просто не може да премине през плацентарната бариера.

Следователно откриването на IgM при дете на 1 година винаги е признак за наличие на инфекция в плода. В кръвния серум по-голямата част от имуноглобулините е представена от IgG (75-85%), а най-ниската е IgE (0,003%). В инфекциозния процес пряко участват само IgA, M, G. IgE е признак на алергични реакции и заболявания, а IgD се намира само в тъканта на лимфните възли и сливиците и играе роля при формирането на локален имунитет.

Класове имуноглобулини

Антигени– високомолекулни вещества от органичен произход, по-специално патогени на инфекциозни и други заболявания, както и вещества от различни променени клетки, образувани по време на определено заболяване (автоимунни заболявания, онкология).

Имунен комплекс– комплекс антиген-антитяло, участващ в имунния процес.

На какво се основава методът ELISA?

Има няколко вида ELISA (директен, индиректен, блокиращ метод, конкурентен), но в практиката най-често се използва хетерогенният твърдофазов имуноанализ или ELISA (enzyme linked imunosorbent assay).

Основата на ензимния имуноанализ е имунната реакция на антиген и антитяло с образуването на имунен комплекс: антиген-антитяло, което води до промяна в ензимната активност на специфични белези на повърхността на антителата.

Същността на метода ELISA

С прости думи този процес може да бъде разделен на няколко етапа:

1) На повърхността на ямките на таблетката на лекаря, провеждащ изследването, има пречистен антиген на определен патоген.

Когато се добави биологичен материал (кръвен серум) от пациента, възниква специфична реакция между този антиген и желаното антитяло (имуноглобулин). Това съединение ще действа като „специален антиген“ в следващата стъпка.

2) На този етап възниква образуването на IC (имунни комплекси) - реакция между „специален антиген“ и конюгат (това е имуноглобулин, маркиран с ензима пероксидаза). Добавя се специален хромоген. Резултатът от тази ензимна реакция е образуването на оцветено вещество в гнездото на таблетката, чийто интензитет на цвета зависи от количеството имуноглобулини (антитела), съдържащи се в материала на пациента.

3) След това се оценява резултатът: фотометрия с помощта на многоканален спектрофотометър, сравнение на оптичната плътност на изследвания материал с оптичната плътност на контролните проби, математическа обработка на резултатите.

Количеството антитела в пациента зависи пряко от височината на оптичната плътност на дадено гнездо.

Обикновено в практиката се използват 96-ямкови плаки.

При измерване на оптичната плътност (ОП) на тестваната течност се изчислява количеството (или концентрацията) на антителата в определена единица обем.

След това резултатът се сравнява с контролна проба.

Трябва да запомните:За всяка тестова система са разработени индивидуални индикатори за записване на резултатите, показатели за нормалност и патология (т.е. „референтни стойности“). Това трябва да се има предвид при оценката на резултатите от всяко конкретно изследване. Неправилно е резултатите от една лаборатория да се тълкуват въз основа на „референтните стойности“ на друга лаборатория.

Също така е некоректно да се сравняват резултатите от различни лаборатории една с друга.

При извършване на ELISA реакции концепцията за авидитет на антитела също е важна.
Авидност на антитела- това е силата на връзката между антитялото и антигена и количеството антиген, което е във връзка с имуноглобулини (антитела).

Авидността е от голямо значение при оценката на очакваната продължителност на инфекцията, което е изключително важно при диагностицирането на първична инфекция при бременни жени.

Основата на теста за авидност на антитялото се състои в третиране на имунния комплекс (антиген-антитяло) с разтвор на урея за унищожаване на протеина.

Връзките с висока авидност остават непокътнати, докато връзките с ниска авидност се разрушават. Резултатът е даден като индекс на авидитет, изразен като процент (%).

Какви заболявания се откриват чрез ELISA диагностика?

Маркери на автоимунни заболявания и показатели на човешкия имунитет (общ IgE, общ IgG, общ IgA, общ IgM, общ IgD, секреторен IgA, IgG 2, IgG4, CEC-циркулиращи имунни комплекси, IgA и IgG към глиадин и други)

3. Онкологични маркери (TNF - тумор некротизиращ фактор, CEA - карциноембрионален антиген, PSA - простатоспецифичен антиген, hCG - човешки хорионгонадотропин, СА 125, алвеомуцин и много други)

Репродуктивни нарушения (естрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, AFP-алфафетопротеин, FSH - фоликулостимулиращ хормон и други)

5. Заболявания на щитовидната жлеза (свободен и свързан Т3, Т4, тиреоглобулин, тиреоидна пероксидаза - ТПО, тиреостимулиращ хормон - TSH).

Този списък не представя всички заболявания, които се диагностицират с помощта на ензимен имуноанализ.

Материал за ELISA анализ и правила за събирането му

Най-честият материал за реакцията ELISA е кръвният серум на пациента, взет на празен стомах.

Материалът може да бъде също цереброспинална течност, амниотична течност, съдържание на стъкловидното тяло, слуз от цервикалния канал и уретрата, цитонамазки.

Подготовка на пациентите за предаване на материал за ELISA

Кръвта се взема на празен стомах. Не е необходимо да приемате никакви лекарства преди кръводаряване.

Ензимният имуноанализ на материала се извършва бързо, в рамките на 24 часа.

Възможно е забавяне в различни лаборатории поради натрупване на определено количество серум.

Възможни резултати от ELISA диагностика

При оценката на резултатите за специфични инфекции класът на откритите антитела и тяхното количество са важни.

Не само въпросът за етиологията на инфекцията (дали съществува или не), но и очакваният стадий на заболяването (остър, хроничен), както и наличието на активна инфекция (остра или екзацербация на хронична) при времето за преглед зависи от това.

Какъв е приблизителният срок за появата на антитела (имуноглобулини - Ig)?

Най-ранните антитела са IgM.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Те могат да бъдат открити 1-3 седмици след евентуална инфекция, което характеризира острата фаза на инфекциозния процес. Втората ситуация за появата на IgM антитела е активирането (или обострянето) на хроничен процес. IgM антителата циркулират средно около 3 месеца, след което броят им постепенно изчезва. Въпреки това, при някои пациенти следи от IgM могат да бъдат открити в рамките на 1-2 години след инфекцията.

Съвременните тест системи са силно чувствителни, което води до неспецифични фалшиво положителни резултати (често при бременни жени).

Ето защо при тази група пациенти трябва да се провери повторно положителните IgM!

IgA антителата се появяват 2-4 седмици след инфекцията, но в количества, достатъчни за откриване в рамките на един месец. Серумният IgA се синтезира от плазмените клетки на далака, лимфните възли и лигавиците.Секреторният IgA се концентрира върху лигавиците, за да изпълнява своята защитна функция - те участват в локалния имунитет.

От 4-та седмица след инфекцията започват да се появяват IgG антитела.

При повечето инфекции техният титър постепенно се увеличава с максимум в различно време (средно след 1,5-2 месеца), след което титърът остава на ниско ниво и показва имунитет. При някои заболявания (микоплазмоза, хламидия, трихомониаза) нивото на IgG не е високо и намалява значително поради липсата на имунитет при тези инфекции.

Опции за откриване на антитела от различни класове:

— Изолирано откриване на IgM антитела предполага наличието на първичен
инфекция.
— Едновременното откриване на IgM и IgG в кръвта е характерно за първичната инфекция
в предходните 2-3 месеца, както и при обостряне на хронично заболяване.

Следователно по време на бременност наличието на IgM не винаги е признак на първична инфекция.
- Откриването на изолиран IgG може да показва имунитет към това заболяване,
както и при хронична инфекция. Във втората ситуация е важно както количеството антитела (титър), така и промяната в този титър във времето. Обикновено изследванията се провеждат на интервали от 2-4-6 седмици.
— Откриването на IgA изолиран или с IgM показва първична инфекция. При
Появата на IgA заедно с IgG предполага активиране на хронична инфекция (средно 2 седмици от момента на обостряне).

Определянето на авидността на IgG антителата е отлична допълнителна стъпка при диагностицирането на първична инфекция от дългогодишна инфекция, която има своето клинично значение, преди всичко, когато се оценява рискът от вътрематочна инфекция на плода.

Откриването на нискоавиден IgG показва първична инфекция и се открива средно 4-6 месеца след заразяването, рядко по-дълго. IgG с нисък авидит изисква друго лабораторно потвърждение на първична инфекция (IgM).

Антителата с висока авидност са признак или на хронично заболяване и неговото обостряне, или на формиран имунитет.

Характеристики при кърмачета:при деца до една година, а понякога дори на 1,5 години, майчиният IgG към различни инфекции циркулира в кръвта (т.е. те са проникнали през плацентата от майката на плода по време на вътрематочно развитие).

Те сами по себе си не са признак за наличие на инфекция в настоящето. Ако IgM се открие на тази възраст (не забравяйте, че майчиният IgM не може да проникне през плацентата), това е признак на вътрематочна инфекция или инфекция, придобита след раждането.

Количествен ELISA метод

Резултатът от ELISA диагностика (използвайки анализатор на ензимен имуноанализ) се дава в определени мерни единици:
— Оптична плътност (ОП) на проба – концентрацията на специфични антитела за единица обем.

Колкото по-висока е OD на пробата, толкова по-висока е концентрацията на антитела. Някои резултати се отнасят до коефициента на положителност (CP), който също е оптичната плътност на пробата.
— Единици за концентрация на антитела (нанограм/милилитър или ng/ml).

— Под формата на серумни титри: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и т.н. Диагностичните титри (при които се поставя диагнозата на заболяването, а не фактът на инфекцията) са различни за различните заболявания.
— Под формата на символи – „+“, „-“, „?“ (+, ++, +++, ++++).
— Под формата на качествена оценка по даден критерий (положителен или отрицателен).

Само лекарят може правилно да прецени броя на антителата, възможността за класово откриване на имуноглобулини и следователно да определи стадия на заболяването и необходимостта от лечение.

Не трябва да забравяме, че за всяка тестова система се разработват собствени „референтни стойности“ (варианти на нормата), когато се превишат, се диагностицира определено заболяване (варианти на патология).

За различните тестови системи „референтните стойности“ са различни.

Правилното сравнение на резултатите от ELISA, направени във времето, е възможно само ако са произведени в една и съща лаборатория.

Лекар по инфекциозни заболявания Н. И. Бикова

Анализът ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) е съвременна диагностична процедура, насочена към идентифициране на специфични антитела в кръвта срещу патогени на редица заболявания, определяне на етапа на развитие на патологията и нейната етиология. Използва се като метод за наблюдение на лечебния процес и неговата ефективност. В процеса на изследване се анализират качествени и количествени показатели.

Методът ELISA е много информативен, точността на резултатите е повече от 96%. Диагностиката се предлага в почти всяка лаборатория и лечебно заведение.

Основни показания

Предписва се ензимен имуноанализ, за ​​да се потвърди наличието на полово предавани инфекциозни заболявания:

• трихомониаза;
• хламидия;
• уреаплазмоза;
• сифилис и др.

ELISA се използва и за диагностициране на вирусни заболявания:

• херпес;
• херпес тип 4 (вирус на Epstein-Barr);
• вирусен хепатит;
• цитомегаловирусна инфекция.

Как да се подготвим за изследване

Биологичният материал за изследване е кръвта. Няколко дни преди теста не трябва да приемате лекарства. Антибиотиците, противоглистните и антивирусните лекарства се спират в рамките на 14 дни.

Материалът се събира сутрин на празен стомах. Един час преди процедурата е позволено да изпиете чаша негазирана вода, приемането на храна е изключено.

Характеристики на анализа

За провеждане на изследването се взема венозна кръв в обем най-малко 5 ml. В някои случаи като биоматериал се използва цереброспиналната течност, амниотичната течност или съдържанието на стъкловидното тяло.

Вземането на кръв се извършва с помощта на инжекционна игла, строго на празен стомах, за да се избегнат фалшиви положителни резултати. Трябва да спрете да пушите и да пиете алкохолни напитки 12 часа преди това. При използване на наркотични вещества резултатите от анализа се изкривяват.

Ако заключението показва отрицателни стойности на имуноглобулини G, A, M, това показва началната фаза на развитие на патологичния процес или неговото отсъствие. Този резултат се записва при пълно възстановяване след терапия.

Отрицателният резултат от IgM и IgA и положителният резултат от IgG показват формиране на имунитет след инфекциозно заболяване или ваксинация.

Положителен резултат от IgM и отрицателен или положителен резултат от IgG, IgA показват наличието на остра инфекциозна патология.

ELISA анализът се извършва доста бързо, резултатите са готови в рамките на един ден след събирането на материала.

Съдържание

За да се оцени способността на тялото да устои на инфекциозни заболявания или да се определи фазата на патология, се използва кръвен тест. Методът ELISA заема важно място сред лабораторните изследвания, помага за цялостно изследване на активността на защитната функция на кръвта, определяне на имунодефицит при инфекциозни заболявания, кръвни заболявания, хормонални и автоимунни процеси.

Какво е ензимен имуноанализ на кръвен тест?

Този метод се отнася до лабораторни изследвания, които определят наличието на защитни кръвни фактори от протеинова природа (антитела) към определени патогенни агенти (антигени). Имуноензимен тест открива имуноглобулини, които могат да бъдат открити под формата на имунокомплекси. Те се появяват, когато се появят сложни неврохуморални реакции на човешката имунна защита, които се превръщат в отговор на въвеждането на чужди антигени.

Тялото произвежда специфични антитела срещу всеки тип патоген. След това патологичният микроорганизъм или антиген се свързва и се образува сложно съединение "антиген-антитяло". След това се неутрализира, настъпва ензимен лизис, възниква реакция на фагоцитоза и процесът завършва с отстраняване от тялото. Наличието на специфични комплекси, определени чрез ELISA, показва вида на патогена или вредното вещество в пациента.

Класове имуноглобулини

Учените са открили и изследвали 5 вида имуноглобулини: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA. Има и други класове, но те все още са в етап на изследване и ролята им не е напълно разбрана. В практическата медицина са важни A, M, G. Информационното съдържание и точността на определяне се основават на интервалите от време, през които се появяват, достигат максимум и изчезват.

Показания за кръвен тест с помощта на ELISA

С помощта на този анализ можете да оцените ефективността на лечението, да проведете цялостно проучване преди операции по трансплантация, да определите състоянието на имунодефицит и антитела към повече от 600 вида алергени. Като допълнителен начин за откриване на ракови клетки се използва кръвен тест с помощта на ELISA. Анализът се предписва, ако е необходимо да се открият антитела срещу микроби, които провокират полово предавани патологии:

• трихомониаза;
• сифилис;
• токсоплазмоза;
• микоплазмоза;
• уреаплазмоза.

В случай на хелминтни инвазии, ELISA анализът ще покаже увеличение на количеството имуноглобулини. Извършват се изследвания, за да се потвърди дали пациентът има:

• вирус на Epstein-Barr;
• херпесни инфекции;
• цитомегаловирус;
• група вирусни хепатити.

Кръвен тест по метода ELISA

Ензимният имуноанализ на кръвта не е единствената възможност за определяне на имуноглобулини. Понякога за това изследване се събират цереброспинална течност, стъкловидна тъкан и амниотична течност. Когато се използва кръв, тя се събира от антекубиталната вена с помощта на инжекционна игла. Тестът трябва да се вземе на празен стомах, преди ELISA не се препоръчва да се приемат лекарства, които могат да повлияят на резултата. Трябва да се откажете от алкохола, пушенето и употребата на наркотици, преди да дарите биоматериал. Опции за резултатите от теста:

1. Ако имуноглобулините IgG, IgM, IgA са отрицателни, лекарите казват, че няма патология или начален стадий. Същият резултат (отрицателен) ще бъде след пълно възстановяване след дълъг период.
2. Ако IgG е положителен, но IgM и IgA не се откриват, това показва формирането на имунитет след ваксинация или инфекциозно заболяване.
3. При високи титри на IgM и отрицателни IgA, IgG се поставя диагноза остро инфекциозно заболяване.
4. Ако IgG, IgM, IgA са положителни, лекарите говорят за острата фаза на рецидив на съществуващо хронично заболяване.
5. При хронична инфекция, която е в стадий на отслабване (ремисия), тестът ELISA показва отрицателни титри на IgM, докато IgA и IgG ще бъдат положителни.

Предимства и недостатъци на ELISA анализа

Основният отрицателен аспект на това изследване е възможността за получаване на фалшиво положителни или фалшиво отрицателни резултати. Причината за ненадеждността е използването на медикаменти и технически дефекти в лабораторията. Процесът на метаболитни нарушения в организма може да фалшифицира анализа. Основните предимства на ELISA анализа са:

• точност, диагностична специфичност;
• ниска цена на анализа;
• скорост на получаване на резултати;
• възможността за динамично наблюдение на етапа на патология и ефективността на лечението;
• лекота на изследване;
• възможност за извършване на масови изследвания на огнища на инфекция;
• безболезненост, безопасност за пациента;
• приложение в обработката на информационните технологии.

Видео

Открихте грешка в текста?
Изберете го, натиснете Ctrl + Enter и ние ще поправим всичко!

Свързан имуносорбентен анализ(или накратко ELISA) е лабораторен тест, който помага да се направи точна диагноза, да се идентифицират скрити заболявания, да се определи предразположението към определени заболявания, както и да се наблюдава ефективността на предписаната терапия. По време на изследването в кръвния серум на пациента се откриват антигени, характерни за специфични патогени и антитела към тях.

Какъв е смисълът

За да разберете принципа на ELISA, е необходимо да запомните как работи имунната система на тялото, какво представляват „антигенът“ и „антителата“ и какви функции изпълняват.

Антигенът е молекула, която носи определена информация за клетката. Ако в тялото попадне чужд антиген, антителата (или имуноглобулини (Ig), в отговор на появата на чужд микроорганизъм в тялото, се свързват с него и разпознават дали е собствен или чужд. При получаване на „чужд“ сигнал, антителата започват да унищожават потенциално опасния обект. Това взаимодействие "антиген" - антитяло" се нарича имунен комплекс. На него се основава методът ELISA.

Показания

Анализът се използва широко за диагностициране на различни видове заболявания. И което е особено ценно е, че това изследване доста точно диагностицира заболявания, които протичат в организма латентно, безсимптомно.

С негова помощ можете да идентифицирате:

• инфекциозни заболявания, предавани по полов път (хламидия, уреаплазмоза, микоплазмоза, сифилис, херпес, ХИВ и др.);
• токсоплазмоза, туберкулоза, хепатит, морбили и др.;
• автоимунни проблеми;
• онкология;
• полови хормони;
• хормони на щитовидната жлеза;
• алергии.

ELISA може дори да открие маркери за сърдечно заболяване. Освен това е предписано да се оцени ефективността на курса на лечение, както и преди някои видове хирургични интервенции.

Подготовка

Кръвта за изследване се взема от вената на празен стомах, за предпочитане сутрин.

Предния ден трябва да се въздържате от алкохол, сладки напитки, кафе и обилна вечеря. В допълнение, резултатите от показателите могат да бъдат повлияни от употребата на определени лекарства, така че е необходима консултация с Вашия лекар.

Пушенето трябва да се избягва 4 часа преди процедурата.

Имуноензимен кръвен тест в ОН КЛИНИК

Международният медицински център ON CLINIC разполага със собствена лаборатория, притежаваща международен сертификат за контрол на качеството. Тук опитни и квалифицирани специалисти извършват различни видове анализи (повече от 1000 точки).

Сред предимствата на този метод може да се подчертае фактът, че той го открива още в най-ранните етапи от развитието на болестта. Чувствителността на теста е 90%. Проучването точно показва динамиката на инфекциозния процес, което позволява на специалиста да следи ефективността на терапията. Целият процес е напълно автоматизиран, което елиминира влиянието на така наречения „човешки фактор“.

В допълнение, високо прецизното оборудване ви позволява да получите надеждни резултати от изследванията за минимално кратък период от време.

Можете да дешифрирате резултатите в същия ден с Вашия лекар. Въз основа на тях лекарят ще избере тактика на лечение, която е подходяща за вас.

ЗА КЛИНИКАТА: За повече от 25 години работа милиони хора ни избраха. Присъедини се към нас!

лекари

Администраторът ще се свърже с Вас за потвърждение на Вашия час. ИМЦ "ОН КЛИНИК" гарантира пълна конфиденциалност на Вашата заявка.

ОБЩА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТИЯ

Въвежда се за първи път

Тази обща фармакопейна монография се отнася за метода на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Методът ELISA е високочувствителен и високоспецифичен имунодиагностичен метод, който се използва за качествено и количествено определяне на различни вещества, които имат свойствата на антиген, хаптен (непълен антиген) или антитяло. Методът ELISA се използва широко за диагностика на инфекциозни и неинфекциозни заболявания на хора и животни и може да се използва и за потвърждаване на качеството на имунобиологични лекарствени продукти (IBP).

Принципът на метода е специфичното взаимодействие на антиген с антитяло с образуването на имунен комплекс и последващо откриване на получения комплекс с помощта на спектрофотометрия, хемилуминесценция и други подходящи техники. Откриването може да бъде директно (когато самото тествано вещество има ензимна активност или е белязано с ензимен етикет), или непряко или непряко (когато тестваното вещество, свързано с антитела, имобилизирани върху твърдата фаза, се инкубира с ензимно белязан антитела). Качественият анализ ви позволява да получите информация за съдържанието на антиген или антитяло в изследвания материал на принципа „да/не“. При извършване на количествен анализ концентрацията на антиген или антитяло в тестовия материал се определя с помощта на калибровъчна графика.

ОБЩИ ПОЛОЖЕНИЯ

Методът ELISA включва 3 основни етапа: 1) образуване на имунен комплекс „антиген (тествано вещество) – специфично за него антитяло” или обратно; 2) образуването на връзка между конюгата и имунния комплекс, образуван на предишния етап или със свободни места на свързване (детерминанти); 3) трансформация на субстрата под действието на ензимен маркер в записан сигнал в резултат на биохимична реакция.

Всички методи за извършване на имуноензимни анализи се класифицират като хомогенни или хетерогенни.

Методите, при които всичките 3 етапа на ELISA протичат в разтвор, а между основните етапи няма допълнителни етапи на разделяне на образуваните имунни комплекси от нереагиралите компоненти, принадлежат към групата на хомогенните ELISA методи. Основата на хомогенния ELISA, използван като правило за определяне на нискомолекулни вещества, е процесът на инхибиране на активността на ензима, когато той се комбинира с антиген или антитяло. В резултат на реакцията антиген-антитяло се възстановява ензимната активност. Когато се образува имунен комплекс антиген-антитяло, съдържащ ензимен маркер, ензимната активност се инхибира с 95% по отношение на субстрата с високо молекулно тегло, което се дължи на пространственото изключване на субстрата от активния център на ензима. С нарастването на концентрацията на антигена се свързват все повече и повече антитела и остават все повече и повече свободни конюгати антиген-ензим, способни да хидролизират субстрата с високо молекулно тегло. Хомогенният ELISA метод е много бърз. Анализът на едно определение отнема 1 минута. Чувствителността на метода е доста висока. Може да се използва за определяне на вещество на ниво пикомол.

Хетерогенните методи се характеризират с анализ в двуфазна система с участието на твърда носителна фаза и задължителен етап на отделяне на имунните комплекси от нереагиралите компоненти (промиване), които са в различни фази (формираните имунни комплекси са върху твърдо вещество). фаза и нереагиралите комплекси са в разтвор). Хетерогенните методи, при които образуването на имунни комплекси на първия етап се извършва в твърдата фаза, се наричат ​​твърдофазни методи.

Методите се класифицират като хомогенни-хетерогенни, ако етап 1 - образуването на специфични комплекси - протича в разтвор и след това се използва твърда фаза с имобилизиран реагент за разделяне на компонентите.

Хетерогенният метод ELISA се състои от 3 основни стъпки:

• имобилизиране на антиген или антитяло върху твърда фаза, полученият комплекс се нарича имуносорбент;
• отстраняване на несвързан реагент и блокиране на местата на свързване върху твърда подложка с помощта на блокиращи протеини, като албумин, казеин; инкубиране на анализираното лекарство с имуносорбент, така че да настъпи тяхното свързване;

3) откриване поради ензимната активност на самото изпитвано вещество или поради ензимен етикет, свързан с анализираното лекарство (директна версия). В някои случаи се извършва допълнителна инкубация на комплекса "имуносорбент-тествано вещество" с вторични антитела, конюгирани с ензимен етикет (индиректен вариант).

Количественото определяне на тестваното вещество се извършва чрез добавяне на субстрат, подходящ за използвания детектор, и сравняване на сигнала на тестваното вещество със стандартна проба.

Хетерогенният ELISA метод се разделя на неконкурентен ELISA и конкурентен ELISA. Схемите за анализ могат да бъдат модифицирани по време на процеса на разработване на лекарството в съответствие с необходимите изисквания. Промените трябва да бъдат посочени във фармакопейната монография или нормативната документация. Изборът на метод ELISA зависи от естеството на тестваното вещество и неговото количество, тъй като различните видове ELISA имат различна чувствителност. За да се оцени качеството на веществата, съдържащи антитела, е възможно да се използват специфични антиидиотипни антитела.

Неконкурентен метод ELISA

Неконкурентният ELISA метод се разделя на няколко вида според вида на откриване (директно конкурентно, индиректно (индиректно) конкурентно) и според вида на веществото, имобилизирано върху твърдата фаза (антиген или антитяло).

Опция за директен ELISA

Може да се направи по 2 начина. В първия случай тестваното вещество (антиген) се имобилизира директно върху твърдата фаза; тогава белязаното антитяло, свързано с антигена, е детектор. При извършване на теста по различен начин се използват антитела, имобилизирани върху твърдата фаза. В този случай детекторът е тестваното вещество, белязано с ензим.

Индиректна (индиректна) версия на ELISA

При извършване на индиректната версия на ELISA антигенът се имобилизира върху твърдата фаза. След блокиране към антигена се добавя разтвор на антитела, специфични за него. След инкубиране, полученият комплекс антиген-антитяло се промива от несвързаните антитела и се добавя ензимно белязан анти-имуноглобулин (anti-Ig), който действа като детектор. Анти-Ig детектори се предлагат в търговската мрежа за специфични Ig класове и подкласове, което прави този формат на анализ удобен за изотипиране на антитела. В допълнение, използването на белязани анти-Ig подобрява сигнала в сравнение с метода на директен ензимно-свързан имуносорбентен анализ, като по този начин повишава чувствителността на анализа.

Методът "сандвич" като опция за извършване на ELISA

Най-често срещаният несъстезателен метод е методът на сандвич. Когато се извършва, първичните антитела се имобилизират върху твърдата фаза и впоследствие се блокират. След това към тях се добавя изследваното вещество, съдържащо антигена, и се инкубира. След инкубацията комплексът антиген-антитяло се отмива от несвързания антиген и се добавят вторични антитела, белязани с ензим, и се извършва откриване.

Конкурентен ELISA метод

Конкурентният метод ELISA се разделя на няколко вида: според вида на откриване (директно конкурентно, индиректно (индиректно) конкурентно) и според вида на веществото, имобилизирано върху твърдата фаза (антиген или антитяло).

Директен конкурентен ELISA

За откриване или количествено определяне на разтворими антигени се използва директна конкурентна версия на ELISA с антиген, имобилизиран върху твърдата фаза. За да направите това, използвайте антиген-специфични антитела, конюгирани с подходящ детектор (например пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, рутений или флуоресцеин). Стандартен антиген се имобилизира върху твърдата фаза, последвано от блокиране. Антитялото, конюгирано с ензимен маркер, се инкубира с тестваното вещество (разтворим антиген). След това тази смес се добавя към имобилизирания антиген, инкубира се и след това се промива, за да се отстрани несвързаният комплекс антиген-антитяло. Следващата стъпка е да добавите подходящ субстрат за ензима, който се използва като етикет. Инхибирането на реакцията поради наличието на 2 антигена в системата, в сравнение с контролна проба без конкурентен разтворим антиген, е обратно пропорционално на количеството на тестваното вещество.

Директният конкурентен ELISA на твърдофазно антитяло е подобен на директния конкурентен ELISA на твърд антиген, но се използва за откриване или количествено определяне на антитела.

Индиректен (индиректен) конкурентен вариант на ELISA

Този метод ELISA е подобен на директната конкурентна версия, но вместо белязано антитяло или антиген, за откриване се използват съответно белязан анти-Ig реагент или белязани вторични антитела.

Общи условия за провеждане на методаELISA

Като твърда фаза за ензимен имуноанализ се използват различни материали: силикон, нитроцелулоза, полиамиди, полистирен, поливинилхлорид, полипропилен, акрил и др. Твърдата фаза може да бъде стените на епруветка, 96-ямкови и други плаки, топки, перли, както и нитроцелулоза и други мембрани, които активно абсорбират протеини. Принципът на имобилизация (хидрофобно, хидрофилно, ковалентно взаимодействие) зависи от избора на твърда фаза. Най-често като твърда фаза се използват 96-ямкови пластмасови микротитърни плаки. Броят на ямките в плаката може да варира. Таблетката може да бъде прозрачна (колориметрично откриване) или матова (хемилуминесцентно откриване, флуориметрия).

Имобилизирането трябва да се извърши без въздушни мехурчета в ямката, тъй като тяхното присъствие променя отчитането на оптичната плътност. Възможно е да се използват биотинилирани имобилизирани реагенти. В този случай реакцията използва стрептавидин и биотинилиран ензимен маркер. Този метод се използва за усилване на сигнала. Времето и температурата на имобилизация, в зависимост от кинетичната природа, стабилността и концентрацията на реагента, трябва да бъдат посочени във фармакопейната монография и нормативната документация.

Всички етапи на ензимния имуноанализ, разтворите за промиване и блокиране, интервалите от време и температурните условия за всеки етап, броят на оборотите в минута за инкубиране на шейкър, условията за откриване също трябва да бъдат посочени във фармакопейната монография и нормативната документация.

Примери за методи за някои видове ELISA

Индиректен неконкурентен ELISA метод

1. Сорбция на антиген.Добавете 0,1-0,5 μg антиген и 100 μl 0,05 М карбонат-бикарбонатен буферен разтвор (рН 9,6) към всяка ямка на 96-ямкова плака, освен ако не е посочено друго във фармакопейната монография или нормативната документация, и след това извършете сорбция при температура от 4 ° C за 16 ч. Възможно е да се използват други буферни разтвори с високи стойности на pH. Инкубацията се извършва чрез разклащане върху хоризонтална клатачна плоча.

Промиване (двукратно) на несвързани антигенни молекули се извършва с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 9,0), съдържащ 0,1% Tween-20 (300 μl на ямка), освен ако не е посочено друго във фармакопейната монография или нормативната документация.

1. Блокиране.За да се блокират местата на неспецифично свързване на антигени или антитела, ямките на таблетката се пълнят с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (pH 9,0) или друг буферен разтвор, посочен във фармакопейната монография или в нормативната документация, съдържащ 1% разтвор на говежди серум албумин или други протеини (казеин, желатин, мляко на прах и др.) и се инкубират за 10-15 минути при стайна температура (освен ако не е посочено друго във фармакопейната монография или нормативната документация).

III. Титруване на специфични антитела.Ако е необходима количествена оценка, изпитваното вещество (антиген или антитяло) се титрува в серийни разреждания успоредно със стандартната проба (RM).

Титруването може да се извърши както в хоризонтални, така и във вертикални редове на плаката. Трябва да се отбележи, че титруването на антителата се извършва, ако е необходимо да се избере оптималната концентрация на антитела или да се определи техният титър. Ако се определи оптималната концентрация и/или титър на антитела, тогава се използва препоръчителното разреждане за тези антитела (серум).

При титруване към първата ямка от серията се добавя готово разреждане на антитела - средно 1-10 μg на ямка, след което се извършва последователно разреждане на антителата в ямките. Инкубацията със специфични антитела се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура с разклащане на хоризонтална шейкърна плоча.

Промиването се извършва най-малко 3-4 пъти с помощта на буфериран с фосфат физиологичен разтвор рН 9,0, съдържащ 0,1% Tween-20.

1. Добавяне на антивидови (антиглобулинови) антитела, конюгирани към ензимен маркер.Анти-видовите поликлонални антитела, конюгирани с ензимен маркер, се използват като детекторни (вторични) антитела. Най-често се използват кози или заешки антитела, специфични за цялата молекула или за Fc фрагментите на специфични антитела. Концентрацията на детекторните антитела обикновено се определя от производителя като разреждане на основния разтвор (например 1:1000).

Инкубирането с белязани вторични антитела се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура с разклащане на хоризонтална шейкърна плоча.

Промиването се извършва най-малко 3-4 пъти с помощта на фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 9,0), съдържащ 0,1% Tween-20.

Инкубацията се провежда в продължение на 10 минути при стайна температура и разклащане на хоризонтална шейкърна плоча.

1. 100 μl от субстратния разтвор се добавят към ямките и се инкубират за 10 минути при стайна температура и постоянно разбъркване. За спиране на ензимната реакция се използва „стоп реагент”, който се добавя към всички тестови и контролни проби в равни количества. Сярната киселина най-често се използва като "стоп реагент".

Директен несъстезателен ELISA метод

Директният метод ELISA има само малки разлики от индиректния неконкурентен метод ELISA. По този начин етапи I и II са еднакви и при двата вида анализ. Разликата е, че в директната версия на ELISA, в етап III, се използват антитела, специфични за тестовия антиген, конюгирани с ензимен етикет, и те директно взаимодействат с тестовото вещество. Ако е необходимо, титруването на конюгатите може също да се извърши подобно на принципа, описан по-рано за неконюгирани антитела. Етап IV на директния неконкурентен ELISA не се извършва.

Метод "сандвич". ELISA

Тази версия на ELISA използва двойка антитела (първични и вторични), специфични за пространствено отдалечени епитопи на антигена, който се изследва.

1. Сорбция на антитела върху твърдата фаза.Техниката за сорбция на антиген е подобна на техниката за сорбция на антитела в раздела „Индиректен неконкурентен ELISA метод“.
2. Блокиране.Техниката за блокиране на неспецифични места на свързване върху субстрата (твърда фаза) е подобна на техниката на блокиране, описана в раздела „Индиректен неконкурентен ELISA метод“.

III. Инкубация с антиген. 50 μl от тестваното вещество и стандартни разреждания на антигена се добавят към ямките на плаката с предварително адсорбирани антитела, освен ако не е посочено друго във фармакопейната монография или нормативната документация. Антигенните разреждания трябва да се приготвят във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 9,0), съдържащ 0,1% Tween-20, тъй като Tween-20 намалява неспецифичното свързване на протеинови молекули една към друга и към повърхността на плаката. Както тестваното вещество, така и стандартните разреждания на антигена се добавят по двойки към съседни ямки в хоризонтален ред (или в 3 повторения), като се използват 2 (3) ямки за всяко протеиново разреждане.

Инкубацията се извършва при стайна температура в продължение на 30 минути при непрекъснато разбъркване. Промиването се извършва най-малко 3-4 пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 9,0), съдържащ 0,1% Tween-20, или друг буферен разтвор, посочен във фармакопейната монография или нормативната документация.

1. Инкубация с антитела, конюгирани с ензимен маркер. 100 μl от разтвор на специфични антитела, конюгирани с ензимен етикет, се добавят към ямките на плаката. Оптималната концентрация на конюгираните антитела обикновено е посочена във фармакопейната монография или нормативната документация (обикновено се използва концентрация от 2–4 μg/ml).

Инкубирането с антитела, съдържащи ензимен маркер, се извършва в продължение на 30 минути при стайна температура с разклащане на хоризонтална шейкърна плоча.

Промиването се извършва най-малко 3-4 пъти с помощта на фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 9,0), съдържащ 0,1% Tween-20, или друг буферен разтвор, посочен във фармакопейната монография или нормативната документация.

1. Провеждане на ензимна реакция, придружена от появата на оцветен продукт.Техниката за провеждане на ензимната реакция е подобна на техниката, описана в раздела: „Индиректен неконкурентен ELISA метод“.

Откриване

Както е посочено по-горе, за откриване се използват антитела, белязани с ензимен маркер или друг реагент. Ензимният маркер може да бъде, например, пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза или галактозидаза. Антитела или антигени с други етикети могат да се използват като детектор. Изборът на детекторен реагент зависи от вида на етикета, конюгиран с антитялото или антигена, и от метода на откриване.

Спектрофотометрия, хемилуминесценция, флуориметрия и други методи могат да се използват като методи за откриване въз основа на избора на етикет.

Резултати от количествения метод ELISA

Количествените резултати от ELISA се изчисляват от линейна калибровъчна крива с обратна регресия или чрез комплексен метод, използващ нелинейна калибрационна крива с обратна регресия. Методът за тълкуване на резултатите зависи от използвания метод ELISA. Например, резултатите от теста могат да се използват за оценка на концентрацията на неизвестна проба, полумаксималната концентрация на инхибиране или ефективната концентрация с помощта на калибровъчна крива. Това позволява количеството на тестваното вещество или неговата активност да бъдат определени в сравнение с референтен/калибрационен стандарт (RM). Обикновено видът на калибрационната крива при извършване на количествен ELISA метод, характеризиращ концентрацията на анализираното лекарство, зависи нелинейно от изчислената средна стойност. В тази връзка се препоръчва използването на различни математически модели за анализ на получената крива. В други случаи методът ELISA се използва като качествен метод, който позволява да се оцени наличието на конкретно изпитвано вещество в проба в рамките на границите на чувствителност на техниката.

Забележка.

Приготвяне на карбонатно-бикарбонатен буферен разтвор (pH 9,6). Добавете 1,59 g натриев карбонат (безводен) или 4,29 g натриев карбонат 10-воден и 2,93 g натриев бикарбонат в мерителен цилиндър с вместимост 1000 ml, разтворете в 800 ml пречистена вода, коригирайте рН до 9,6, разбъркайте , след това доведете обема на разтвора до марката с пречистена вода и разбъркайте отново.