ІФА сумарний що за аналіз. Імуноферментний аналіз крові: розшифрування, методи. Відео: сучасне проведення імуноферментного аналізу

Найбільш часто на практиці використовуються три варіанти твердофазного імуноаналізу - непрямий імуноаналіз, прямий імуноаналіз та імуноаналіз сендвіч-типу. Відмінності між цими типами імуноаналізу полягають у наступному. У непрямому варіанті імуноаналізу на першій стадії поверхню лунок полістирольного планшета сорбується антиген. Після видалення молекул, що не зв'язалися, антигену додається зразок, що містить специфічні до даного антигену антитіла. Комплекси, що утворилися, антиген-антитіло детектуються за допомогою анти-видових антитіл, кон'югованих з якоюсь міткою (Рис. 1А). У прямому варіанті імунаналізу детекція сорбованого антигену здійснюється безпосередньо за допомогою специфічних антитіл, кон'югованих з міткою (рис. 1б). В імуноаналіз сендвіч-типу на першій стадії на поверхню планшета сорбується не антиген, а антитіла, специфічні до досліджуваного антигену (антитіла підкладки). Після видалення молекул антитіл, що не зв'язалися, додається зразок, що містить антиген. Для детекції комплексу антитіла, що утворився, підкладки-антиген додаються другі антитіла, специфічні до іншого, просторово віддаленого, епітопу антигену, кон'юговані з будь-якою міткою (Рис. 1В). Використання в імуноаналізі сендвіч-типу антитіл, специфічних до двох різних епітопів антигену, дозволяє досягти високої чутливості та специфічності щодо антигену навіть у таких гетерогенних зразках, як плазма крові.

Мал. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) та імуноаналізу сендвіч-типу (В)

Непрямий імуноферментний аналіз (indirect ELISA)

Метод непрямого імуноаналізу характеризується здійсненням 3-х стадійного процесу, на першій стадії якого антиген адсорбується на спеціально підготовленому пластику, на другій з антигеном взаємодіють специфічні до нього антитіла, а на третій в систему вводять антивидові антитіла, кон'юговані з ферментом, що зумовлює проведення інд . У даній методиці як фермент використовують пероксидазу хрону. Реакція проводиться у спеціальних 96-лункових планшетах.

I. Сорбція антигену

Влунки 96-лункового планшета для проведення імуноаналізу сорбують антиген 0,1-0,5 мкг в лунку 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання (2-х кратна) молекул антигену, що не зв'язалися, здійснюється фосфатно-сольовим буфером, що містить 0.1% Tween-20 (PBSТ).

ІІ. Блокування

Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST та інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.

ІІІ. Раститрування специфічних антитіл

Розтитрування можна проводити як горизонтальними, так і вертикальними рядами планшета. Необхідно відзначити, що раститровка антитіл проводиться у тому випадку, якщо необхідно підібрати оптимальну концентрацію антитіл або визначити титр. У тому випадку, якщо оптимальна концентрація та/або титр антитіл визначені, використовують рекомендоване для даних конкретних антитіл розведення.

При раститровке в першу лунку ряду вносять готове розведення антитіл - в середньому 1-10 мкг в лунку, далі проводять послідовне розведення антитіл в лунках. Інкубацію зі специфічними антитілами проводять протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 3 рази.

IV. Додавання антивидових антитіл, кон'югованих з ферментною міткою

Як детекторні (вторинні) антитіла використовуються антивидові поліклональні антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону. Найчастіше використовуються козячі або кролячі антитіла, специфічні до цілої молекули або до Fc-фрагментів специфічних антитіл. Концентрація детекторних антитіл зазвичай вказується виробником як розведення вихідного розчину (наприклад, 1:1000). Інкубація з вторинними антитілами проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.

Пероксидаза хрону каталізує реакцію окислення субстрату перекисом водню. Як субстрат пероксидази хрону використовується о-фенілендіамін (ОФД). В результаті проходження реакції утворюється забарвлений продукт окиснення ОФД.

Розчин субстрату: До 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратний буфер, рН 4,5) додати 0,01 мл 30% перекису водню та 0,2 мл 50х розчину ОФД (340 мг ОФД у 10 мл етилового спирту; зберігати при -20 ° С).

Інкубація проводиться протягом 10 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.

V. Зупинення ферментативної реакції

VI. Вимір оптичної щільності

Прямий імуноферментний аналіз (Direct ELISA)

Методика прямого імуноаналізу має лише невеликі відмінності в порівнянні з методикою непрямого імуноаналізу. Так, стадії I та II однакові в обох типах аналізу. Відмінність полягає в тому, що у прямому варіанті імуноаналізу на стадії III використовують специфічні антитіла, кон'юговані з ферментною міткою. При необхідності також можна проводити раститровку специфічних антитіл, кон'югованих з ферментною міткою, аналогічно описаному раніше для некон'югованих антитіл. Стадія IV опускається, а подальші стадії (V-VII) проводяться аналогічно описаному для непрямого варіанту імуноаналізу.

Імуноаналіз сендвіч-типу (Sandwich-type immunoassay)

Мал. 2. Схематичне зображення імуноаналізу сендвіч-типу. АТп – антитіло підкладки, АТд – детекторне антитіло, АГ – антиген, М – мітка, ковалентно пов'язана з детекторним антитілом, П – підкладка, на яку сорбується антитіло підкладки.

У даному варіанті імуноаналізу (Рис.2) використовується пара антитіл, специфічних до просторово віддалених епітопів антигену, що досліджується.

I. Сорбція антитіл підкладки

У лунки 96-лункового планшета для проведення імуноаналізу сорбують антитіла підкладки 1-2 мкг в лунку 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання (2-х кратна) молекул антигену, що не зв'язалися, здійснюється фосфатно-сольовим буфером, що містить 0,1% Tween-20 (PBSТ).

ІІ. Блокування

Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST та інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.

ІІІ. Інкубація з антигеном

У лунки планшета з преадсорбованими антитілами вносять по 50 мкл досліджуваного розчину або стандартних розведень антигену. Розведення антигену повинні бути приготовлені на основі PBST, оскільки Tween-20 знижує неспецифічне зв'язування білкових молекул одна з одною та поверхнею планшета. І досліджуваний розчин і стандартні розведення антигену вносять попарно (або по 3 повторності), використовуючи по дві (три) лунки на кожне розведення білка. Інкубацію проводять за кімнатної температури протягом 30 хв при постійному перемішуванні. Відмивання здійснюється розчином PBST тричі.

IV. Інкубація з антитілами, кон'югованими з ферментною міткою

У лунки планшета вносять по 100 мкл розчину специфічних антитіл, кон'югованих з ферментною міткою. Оптимальна концентрація кон'югованих антитіл зазвичай вказується виробником (зазвичай використовують концентрацію 2-4 мкг/мл). Інкубація з антитілами, що містять ферментну мітку, проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.

V. Проведення ферментативної реакції, що супроводжується появою забарвленого продукту

У лунки вносять по 100 мкл розчину субстрату та інкубують протягом 10 хв при кімнатній температурі та постійному перемішуванні.

VI. Зупинення ферментативної реакції

Перед вимірюванням оптичної густини проводять зупинку кольорової реакції за допомогою 0,5 М H2SO4. У лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0,5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної густини.

VII. Вимір оптичної щільності

Оптична щільність розчину забарвленого продукту вимірюється при =490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.

Версія для друку

Імуноферієнтний аналіз (ІФА)

Імуноферієнтний аналіз, або метод (ІФА) - Виявлення антигенів за допомогою відповідних їм антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, бета-галактозидазною і або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою суміш додають субстрат/хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом і змінюється колір продукту реакції - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися.

Компоненти виявляють додаванням мічених антитіл чи антигенів. За позитивного результату змінюється колір хромогену.

Твердофазний непрямий імуноферментний аналіз

Щоразу після додавання чергового компонента з лунок видаляють реагенти, що не зв'язалися шляхом промивання.
I. При визначенні антитіл у лунки планшеток із сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворого, антиглобулінову сироватку, мічену ферментом та субстрат/хромоген для ферменту.

ІІ. При визначенні антигену в лунки з сорбованими антитілами вносять антиген (напр., сироватку крові з шуканим антигеном), додають діагностичну сироватку проти нього та вторинні антитіла (проти діагностичної сироватки), мічені ферментом, а потім субстрат/хромоген для ферменту.

Конкурентний ІФА для визначення антитіл:шукані антитіла та мічені ферментом антитіла конкурують один з одним за антигени, сорбовані на твердій фазі.

Визначення пероксидазної мітки за допомогою посиленої хемілюмінесценції. Розробка швидких методів імуноферментного аналізу, які виконуються за допомогою портативних приладів. Синергізм та ступінь посилення. Інтенсивність та тривалість випромінювання світла.

Імуноферментний аналіз із посиленою хемілюмінесценцією

ВСТУП

Визначати ферментну мітку кількісно можна різними методами, наприклад, за допомогою колориметрії, флуориметрії, радіометрії та потенціометрії.

Нещодавно для цієї мети почали застосовувати також хемілюмінесценцію або біолюмінесценцію. Ферментні мітки, які можна визначати за допомогою реакцій, що супроводжуються випромінюванням світла, представлені у табл. 1. У загальному випадку чутливість хемі- та біолюмінесцентних методів визначення дуже висока, а якщо використовувати ще й посилення сигналу від ферментної мітки, то чутливість відповідних методик імуноаналізу має бути надзвичайно високою.

Можливості біолюмінесцентного методу нещодавно продемонстрували на прикладі визначення Д-галак-тозидази. За допомогою сполученої реакції галактозо-дегідрогеназу АОН:РМ№оксидоредуктаза-бактеріальна люцифераза вдалося виявити 2 * 10 "22 моля /3-галактозидази.

Як мітки в імуноферментному аналізі широко застосовують пероксидазу хрону, методи отримання та стабілізації кон'югатів, з якою добре вивчені.

Пероксидазу хрону найчастіше визначають колориметрично, але з цією метою можна також використовувати різні хемі-і біолюмінесцентні реакції.

Детально вивчено визначення пероксидази за допомогою хемілюмінесцентної реакції в системі люмінол - пероксид водню, посиленої фенольними сполуками.

Такий підхід до визначення активності ферменту має низку переваг у порівнянні з іншими методами визначення; його основні характеристики перелічені у табл. 2.

Підсилювачі. Здатністю посилювати випромінювання світла реакції окислення люміналу пероксидом водню, що каталізується пероксидазою, володіють різні сполуки, в тому числі 6-гідроксибензотіазоли, наприклад люциферин, феноли, нафтоли і аміни.

На рис. 1 зображено структури представників речовин кожного класу. Ступінь посилення випромінювання світла залежить від концентрації реагентів. Типова залежність інтенсивності світіння від концентрації підсилювача реакції люміно-ла з пероксидом водню, що каталізується пероксидазою і посилюється 6-гидрокси-бензотиазолом, представлена ​​на рис.

Синергізм та ступінь посилення. У системі перокси-дазу - люмінал - пероксид водню спостерігається ефект синьо-

ргізму, про що свідчать дані, наведені у табл. 3. На ступінь посилення впливають багато чинників; проте досягнуто посилення випромінювання світла більш ніж 500 раз.

У присутності деяких підсилювачів фонове випромінювання світла у системі люмінол — пероксид водню зменшується. При визначенні активності пероксидази це дозволяє на кілька порядків підвищити ставлення сигналу до шуму лише за рахунок застосування таких підсилювачів.

Посилення свічення характерне для різних циклічних діацилгідразидів, при дії окислювачів у присутності пероксндази. Посилення не спостерігається у разі деяких речовин з пероксидазною активністю, наприклад, гемоглобіну, який каталізує тільки колориметричні реакції.

Цей факт свідчить про більш високу специфічність посиленого хемілюмінесцентного аналізу порівняно з колориметричними методами. Спектри випромінюваного світла практично однакові у посилених та непосилених реакціях. Це говорить про те, що сам по собі підсилювач не випромінює світло.

У відсутність підсилювачів хемілюмінесценція в системі пероксидазу-люмінол-пероксид, мабуть, лімітується відносно повільною реакцією пероксндази, що знаходиться у формі так званої сполуки II, з люмінолом, в результаті якої утворюються люмінольні радикали і регенерується пероксидаза.

Підсилювачі, здатні швидко реагувати з такою сполукою, можуть збільшувати випромінювання світла, прискорюючи перетворення сполуки II активну пероксидазу.

Продукти перетворення підсилювача можуть швидко реагувати з люмінолом, утворюючи додаткові люмінольні радикали і тим самим сприяючи подальшому посиленню випромінювання світла. Підсилювачі можуть впливати на неактивні пероксидазні інтермедіа™, наприклад, на з'єднання III.

Реагенти

Важливим фактором визначення пероксидазної активності за допомогою посиленої хемілюмінесценції є хімічна чистота циклічних діацилгідразидів.

Вивчення різних зразків люмінолу показало, що домішки негативно впливають випромінювання світла. В результаті фотохімічних і термічних процесів люмінол частково розкладається, а домішки, що утворюються, впливають на кінетику і інтенсивність випромінювання світла.

У табл. 4 представлені результати порівняння чистоти і властивостей деяких препаратів люмінолу, що надходять у продаж, а також натрієвої солі люмінолу, очищеної перекристалізацією з розчину гідроксиду натрію.

2. ПОСИЛЕНИЙ ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ ІМУНОАНАЛІЗ

Посилений хемілюмінесцентний імуноаналіз з пероксидазою як ферментну мітку застосовували для визначення багатьох сполук. Ряд прикладів наведено у табл. 5. У цих імуноаналізах застосовували конкурентні методи та методи з екстракцією імунного комплексу, а також більшість твердих носіїв, що зазвичай використовуються.

а Відношення сигнал/фон при хемілюмінесцентному визначенні пероксидази хрону з посиленням л-іодфенолом; 6 ТСХ - тонкошарова хроматографія.

Мал. 3 представлена ​​схема визначення фолікулстимулюючого гормону. У цьому методі межа виявлення FSH на мікротитрувальному планшеті дорівнює близько 0,01 м.од. Метод характеризується відмінною відтворюваністю як у одному аналізі, і між аналізами.

Метод посиленої хемілюмінесценції успішно застосовувався також для виявлення пероксидазної мітки щодо гібридизації ДНК.

МЕТОД ФЛУОРЕСЦІЙНИХ АНТИТІЛ (МФА).

метод кількісного визначення з використанням фотометра для планшетів та якісного аналізу із застосуванням фотографічного виявлення з чутливістю кілька пікограм.

Прилади

В даний час промисловість випускає кілька типів люмінометрів, придатних для вимірювання світла, що випромінюється в реакціях посиленої хемілюмінесценції.

Деякі з цих люмінометрів були модернізовані спеціально для посиленого хемілюмінесцентного аналізу. Інтенсивність і тривалість випромінювання світла в реакціях з посиленням люмінесценції полегшили створення простих люмінометрів, в яких як детектори використовуються кремнієві фотодіоди або високочутлива фотографічна плівка.

Такі люмінометри відносно недорогі, портативні, тому їх можна застосовувати і поза лабораторіями. В даний час фірма MAST Immunosystems випускає спеціальні фотокамери для хемілюмінесцентної детекції в методі ІФА алергенспецифічного імуноглобуліну Е. Можна припустити, що в майбутньому будуть створені набори з фотографічною реєстрацією результатів ІФА та інших з'єднань, визначення яких необхідно проводити в клініках.

Прилади, що випускаються, і набори реагентів.

Набори для посиленого хемілюмінесцентного імуноферментного аналізу та відповідні прилади зараз випускаються за назвою Amerlite фірмою Amersham International pic.

Аналіз виконується на стрипах мікротитрувальних планшетів білого кольору, а вимір люмінесценції швидко та автоматично виконує спеціальний люмінометр для мікропланшетів.

В даний час випускаються набори для визначення тироїдстимулюючого гормону, хоріогонадотропіну людини, карциноембріонального антигену, альфа-фетопротеїну, тироксину, триіодтироніну і для визначення індексу вільного тироксину. Ці аналізи мають високу відчутність і прекрасну відтворюваність.

ВИСНОВКИ

Визначення пероксидазної мітки за допомогою посиленої хемілюмінесценції відрізняється високою чутливістю, специфічністю і простотою і може бути покладено в основу розробки зручних і швидких методів імуноферментного аналізу, що виконуються за допомогою недорогих портативних приладів.

Принципи імуноферментного аналізу, основні види ІФА, застосування у діагностиці

Методи імунного аналізу у медичній практиці, взаємодія антигену та антитіла в його основі.

Види імунного аналізу в залежності від типу мітки та умов постановки тесту. Характеристика компонентів, які у імуноферментному аналізі.

реферат, доданий 07.11.2011

Серологічні реакції

Серологічні реакції як реакції між антигенами та антитілами in vitro.

Класифікація серологічних реакцій залежно від характеру та фізичного стану антигену. Реакція преципітації у гелі по Оухтерлоні. Мктод імуноферментного аналізу.

презентація , доданий 03.06.2015

Спектральний аналіз електрокардіограми

Засоби реєстрації та аналізу електрокардіограм. Порівняння аналогової та цифрової обробки сигналів.

Дослідження електрокардіосигналів, отриманих за допомогою електрокардіографа надвисокої роздільної здатності. Можливості аналізу за допомогою пакета MatLab.

реферат, доданий 09.12.2011

Застосування випромінювання у медицині

Лікування бронхіальної астми інфрачервоним випромінюванням. Штучні джерела ультрафіолетового (УФ) випромінювання у медицині. Озонні та безозонні бактерицидні лампи.

Дезінфекція питної води за допомогою ультрафіолетового випромінювання. Рентгенодіагностика, влаштування апарату.

реферат, доданий 27.08.2009

Акромегалія

Акромегалія – захворювання, пов'язане з посиленою продукцією гормону росту (соматотропного гормону). Клінічна картина захворювання. Характерний лабораторний показник акромегалії під час діагностики. Проба з тироліберином. Лікування рентгенівським опроміненням.

презентація , доданий 03.05.2012

Онкомаркери у клінічній практиці

Використання лабораторного аналізу для діагностики онкологічних захворювань та післяопераційного моніторингу ефективності операції та хіміотерапії.

Визначення онкомаркерів методами імуноферментного, імунолюмінесцентного та радіоімунного аналізу.

реферат, доданий 09.10.2010

Фізико-хімічні методи аналізу лікарських засобів

Класифікація фізико-хімічних методів аналізу Молекулярно-абсорбційний спектральний аналіз Закони поглинання випромінювання. Візуальна колориметрія. Визначення концентрації у фотоелектроколориметрії. Спектрофотометрія лікарських засобів.

реферат, доданий 14.11.2010

Основні напрямки застосування активованої хемілюмінесценції

Механізм реакцій, що супроводжуються свіченням живих організмів, видимим простим оком.

Використання активованої хемілюмінесценції та біолюмінесценції як інструмента у медико-біологічних дослідженнях сироватки крові, сечі, ліквору та слини.

курсова робота , доданий 25.10.2011

Сучасні методи діагностики інфекційних хвороб

Методи діагностики інфекційних хвороб тварин.

Полімеразна ланцюгова реакція. Імуноферментний аналіз, його цілі. Діагностика інфекцій, що викликаються стафілококами, пневмококами та сальмонельозною інфекцією. Збудник бруцельозу, його діагностика.

реферат, доданий 26.12.2013

Люмінесцентні мітки

Поняття люмінесценції, її фізична природа та причини виникнення.

Правило Стокс. Типи люмінесценції (фотолюмінесація, хемілюмінесація) та її вихід. Основні закони теплового випромінювання. Люмінесцентний, якісний та кількісний аналізи речовин.

презентація , додано 05.05.2016

Ішемічна хвороба серця

1.1 Класифікація ІХС

ІХС включає кілька захворювань, що істотно різняться за клінічними проявами.

Клініка хронічних пульпітів: фіброзний, гіпертрофічний, гангренозний

Класифікація

Гострий пульпіт гіперемія пульпи серозний обмежений серозний дифузний гнійний травматичний Хронічний пульпіт фіброзний гангренозний гіпертрофічний (проліферативний) Загострення хронічного пульпіту Хронічний…

Лактаційний мастит

4.

Класифікація

Хірургічна класифікація маститів: I. Через захворювання: 1. Неспецифічний. 2. Специфічний. ІІ. За функціональним станом МР: 1. Лактаційний.

Імуноферментний аналіз (ІФА)

2. Нелактаційний. ІІІ. За перебігом запального процесу: 1. Гострий. 2. Хронічний. IV…

Лікарські рослини та лікарська рослинна сировина, що застосовуються в медицині при сечокам'яній хворобі

1.1 Класифікація

Сечокам'яну хворобу можна класифікувати за локалізації каменів: каміння нирок та сечоводів (нефроуретеролітіаз), каміння сечового міхура. Можливий підрозділ уролітіазу відповідно до складу конкрементів.

Рак гортані

3.

Класифікація

Відповідно до вітчизняної класифікації раку гортані (Збірник інструкцій Міністерства охорони здоров'я, розрізняють 4 стадії: I стадія: пухлина займає лише частину одного відділу гортані не проникає глибше підслизового шару.

Рак сечового міхура

2. Класифікація

Новоутворення сечового міхура здебільшого представлені перехідноклітинним раком.

Тим не менш, для запобігання діагностичних помилок не можна забувати про те.

Рак стравоходу

Класифікація

Міжнародна гістологічна класифікація пухлин стравоходу (1990): Епітеліальні пухлини. Доброякісні пухлини. Плоскоклітинна папілома. Вірусна бородавка. Аденома. Злоякісні пухлини.

Плоскоклітинний рак.

Рани, класифікація ран, механічна антисептика у лікуванні ран

Класифікація ран

Існує кілька класифікацій ран. За характером ушкодження тканин розрізняють рани: колоті, різані, рубані, забите, рвані, укушені, отруєні, вогнепальні. Колоті рани наносять колючою зброєю (штик, голка та ін).

Рослинні джерела таніну та їх застосування в медицині

2.

Класифікація

Усі таніни поділяють на дубильні речовини групи: гідролізуються та конденсовані. Таніни, що гідролізуються, при дії розведених мінеральних кислот, основ і ферменів танинацилгидролаз розпадаються на вуглеводи і фенолкарбонові кислоти.

Реабілітація дітей із ДЦП

1.2. Класифікація ДЦП.

Нині у Росії використовується класифікація К.А.

Семенової (1974). -спастична диплегія - спостерігається переважне ураження ніг -подвійна геміплегія - спастичний тетрапарез, руки уражені дещо більше.

Ревматоїдний поліартрит

1. Класифікація

Ревматоїдний артрит протягом десятиліть залишається в центрі уваги ревматологічної науки, що є відображенням великої значущості хвороби у загальномедичному та соціальному плані.

Роль немедикаментозних методів лікування бронхіальної астми

1.1.1 Класифікація

Бронхіальна астма (БА) ділиться на фазу загострення (розпалу захворювання) та ремісії (коли немає жодних ознак захворювання).

У нападі астми виділяють період провісників (чхання, нежить та ін.

Роль фельдшера у діагностиці, лікуванні та профілактиці правця. Протиепідемічні заходи у вогнищі інфекційних захворювань. Динаміка та порівняльний аналіз захворювань правця у Сальському районі за період 2013-2014 років.

1.4 Класифікація

У класифікаційних характеристиках враховуються різні фактори – механізм зараження, поширеність та вираженість судомного синдрому, особливості клінічного перебігу.

З урахуванням цих факторів виділяють такі форми правця: 1…

Роль фельдшера в організації та проведенні діагностичних, лікувальних та профілактичних заходів щодо боротьби з гіпертонічною хворобою

1.2 Класифікація

За весь час вивчення хвороби була розроблена не одна класифікація гіпертонії: на вигляд хворого, причин підвищення тиску, етіології, рівня тиску та його стабільності, ступеня ураження органів, характеру перебігу ...

Цукровий діабет

1.1 Класифікація

Існує кілька типів класифікації цукрового діабету, основою яких покладено клінічна картина, етіологія, ступінь компенсації вуглеводного обміну, тяжкість лікування, ускладнення…

Імуноферментний аналіз (ІФА)– сучасне лабораторне дослідження, під час якого ведеться пошук специфічних антитіл у крові чи антигенів до конкретних захворювань із єдиною метою виявлення як етіології, а й стадії хвороби.

Результати ІФА можуть видаватися якісно та кількісно.

В даний час ІФА застосовується в таких ситуаціях:

1) Пошук специфічних антитіл до будь-якого інфекційного захворювання;
2) пошук антигенів будь-яких захворювань (інфекційних, венерологічних);
3) дослідження гормонального статусу пацієнта;
4) обстеження на онкомаркери;
5) обстеження щодо наявності аутоімунних захворювань.

Переваги методу ІФА:

1) Висока специфічність та чутливість методу ІФА (понад 90%).
2) Можливість визначення захворювання та відстеження динаміки процесу, тобто порівняння кількості антитіл у різних часових проміжках.
3) Доступність ІФА-діагностики в будь-якій медичній установі.

Відносний недолік:

1) Виявлення імунної відповіді (антитіл), але не самого збудника.

Основні поняття

Перед тим, як прояснити суть методу ІФА, коротко розберемося у деяких поняттях.
Антитіла (або імуноглобуліни - Ig)- Специфічні білки, що виробляються B -
лімфоцитами (імунні клітини) у відповідь на потрапляння в організм будь-якого інфекційного патогену (віруси, бактерії, гриби та ін.).

Виділяють імуноглобуліни А (IgA), імуноглобуліни Е (IgE), імуноглобуліни М (IgM), імуноглобуліни G (IgG), імуноглобуліни D (IgD). Відрізняються вони один від одного молекулярною формою та масою, періодом напіврозпаду, участю/неучастью в інфекційних процесах, термінами виявлення з моменту інфікування. Якщо розглянути молекулярну вагу, то найбільше вона у IgM – це пентамер (950 000 дальтон) на відміну від інших Ig (від 150 до 200 000 Так), завдяки чому IgM просто не можуть проходити через плацентарний бар'єр.

Тому виявлення IgM у дитини 1 року життя завжди є ознакою інфекції у плода. У сироватці крові переважна більшість імуноглобулінів представлена ​​саме IgG (75-85%), а найнижча — IgE (0,003%). В інфекційному процесі безпосередню участь беруть лише IgA, M, G. IgE є ознакою алергічних реакцій та захворювань, а IgD – можна виявити лише у тканині лімфовузлів та мигдаликів, що відіграє роль у формуванні місцевого імунітету.

Класи імуноглобулінів

Антигени- Високомолекулярні речовини органічного походження, зокрема збудників інфекційних та інших захворювань, а також речовини різних змінених клітин, що утворюються при тій чи іншій хворобі (аутоімунні захворювання, онкологія).

Імунний комплекс- Комплекс антиген-антитіло, що бере участь в імунному процесі.

На чому ґрунтується метод ІФА.

Виділяють кілька різновидів ІФА (прямий, непрямий, метод блокування, конкурентний), проте на практиці найчастіше використовується гетерогенний твердофазний імунний аналіз або ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу імуноферментного аналізу становить імунна реакція антигену та антитіла з утворенням імунного комплексу: антиген-антитіло, в результаті якого відбувається зміна ферментативної активності специфічних міток на поверхні антитіл.

Суть методу ІФА

Простою мовою цей процес можна розділити на кілька етапів:

1) На поверхні лунок планшета лікаря, який проводить обстеження, знаходиться очищений антиген певного збудника.

При додаванні біологічного матеріалу (сироватки крові) пацієнта відбувається специфічна реакція між цим антигеном та шуканим антитілом (імуноглобуліном). Ця сполука виступатиме «особливим антигеном» у наступному етапі.

2) На даному етапі йде утворення ІЧ (імунних комплексів) – реакція між «особливим антигеном» та кон'югатом (це імуноглобулін, мічений ферментом пероксидазою). Додається спеціальний хромоген. Результатом такої ферментативної реакції є утворення забарвленої речовини в лунці планшета, інтенсивність забарвлення якого залежить від кількості імуноглобулінів, що містяться в матеріалі пацієнта (антитіл).

3) Далі відбувається оцінка результату: фотометрування за допомогою багатоканального спектрофотометра, порівняння оптичної густини досліджуваного матеріалу з оптичною густиною контрольних проб, математична обробка результатів.

Кількість антитіл у пацієнта залежить від висоти оптичної щільності даної лунки.

Зазвичай практично використовують 96 лункові планшети.

При вимірі оптичної густини (ОП) досліджуваної рідини підраховується кількість (або концентрація) антитіл у певній одиниці об'єму.

Потім результат порівнюється з контрольним зразком.

Потрібно пам'ятати:для кожної тест-системи розробляються індивідуальні показники для обліку результатів, показники норми та патології (тобто «референтні значення»). Це необхідно враховувати в оцінці результатів кожного конкретного дослідження. Некоректно інтерпретувати результати однієї лабораторії щодо «референтних значень» іншої лабораторії.

Також некоректно порівнювати результати різних лабораторій між собою.

При постановці реакцій ІФА має значення таке поняття як авидність антитіл.
Авидність антитіл– це міцність зв'язку антитіла з антигеном та кількість антигену, що перебуває у взаємозв'язку з іммноглобулінами (антитілами).

Авидність має велике значення в оцінці передбачуваного терміну інфікування, що дуже важливо під час діагностики первинного інфікування у вагітних.

Основа тесту на авидність антитіл складається з обробки імунного комплексу (антиген-антитіло) розчин сечовини з метою руйнування білка.

Високовидні зв'язки залишаються цілими, а низьковидні руйнуються. Результат видається як індексу авидності, що виражається у відсотках (%).

Які захворювання виявляються за допомогою ІФА-діагностики?

Маркери аутоімунних захворювань та показники імунітету людини (загальний IgE, загальний IgG, загальний IgA, загальний IgM, загальний IgD, секреторний IgA, IgG 2, IgG4, ЦВК-циркулюючі імунні комплекси, IgA та IgG до гліадину та інші)

3. Онкологічні маркери (ФНП – фактор некрозу пухлини, РЕА – раково-ембріональний антиген, ПСА – простатспецифічний антиген, ХГ – хоріонічний гонадотропін, СА 125, альвеомуцин та багато інших)

Репродуктивні порушення (естрадіол, прогестерон, пролактин, тестостерон, АФП-альфафетопротеїн, ФСГ – фолікулостимулюючий гормон та інші)

5. Захворювання щитовидної залози (вільні та пов'язані Т3, Т4, тиреоглобулін, тиреопероксидаза – ТПО, тиреотропний гормон – ТТГ).

Цей список представлений далеко не всіма захворюваннями, які діагностуються за допомогою імуноферментного аналізу.

Матеріал для ІФА аналізу та правила його паркану

Найпоширеніший матеріал для реакції ІФА – це сироватка крові пацієнта, взята натще.

Матеріалом також можуть служити спинномозкова рідина, навколоплідні води, вміст склоподібного тіла, слиз цервікального каналу та уретри, мазки.

Підготовка пацієнтів до здачі матеріалу для ІФА

Кров забирається натще. Перед здаванням крові не потрібно приймати жодних препаратів.

Імуноферментний аналіз матеріалу проводиться швидко протягом доби.

Затримки можуть бути у різних лабораторіях через накопичення певної кількості сироваток.

Можливі результати ІФА-діагностики

Оцінюючи результатів на конкретні інфекції має значення клас виявлених антитіл та його кількість.

Від цього залежить як питання етіології інфекції (є вона чи ні), а й передбачувана стадія захворювання (гостра, хронічна), і навіть наявність активної інфекції (гострої чи загострення хронічної) на даний момент обстеження.

Якими є приблизні терміни появи антитіл (імуноглобулінів — Ig)?

Найранішими антитілами є IgM.

Імуноферментний аналіз (ELISA)

Виявити їх можна за 1-3 тижні після можливого інфікування, що характеризує гостру фазу інфекційного процесу. Друга ситуація появи антитіл IgM – активація (або загострення) хронічного процесу. Антитіла IgM циркулюють в середньому близько 3 місяців, потім їх кількість поступово зникає. Однак у деяких пацієнтів слідові кількості IgM можуть виявлятися протягом 1-2 років з моменту інфікування.

Сучасні тест-системи мають високу чутливість, внаслідок чого зустрічаються неспецифічні хибнопозитивні результати (нерідко у вагітних).

Тому у цієї групи пацієнтів позитивні IgM потрібно перевіряти ще раз!

Антитіла IgA з'являються через 2-4 тижні після інфікування, але в кількості, достатній для виявлення через місяць. Сироваткові IgA синтезуються плазматичними клітинами селезінки, лімфовузлів та слизових оболонок, Секреторні IgA концентруються на слизових оболонках для виконання своєї захисної функції – беруть участь у місцевому імунітеті.

З 4-го тижня після інфікування починають з'являтися антитіла IgG.

При більшості інфекцій титр їх поступово збільшується з максимумом у різні терміни (в середньому через 1,5-2 місяці), далі титр залишається на невисокому рівні і вказує на імунітет. При деяких захворюваннях (мікоплазмоз, хламідіоз, трихомоніаз) рівень IgG не буває високим, знижується суттєво через відсутність імунітету при цих інфекціях.

Варіанти виявлення антитіл різних класів:

- Ізольоване виявлення антитіл IgM передбачає наявність первинного
інфікування.
— Одночасне виявлення у крові IgM та IgG характерне для первинного інфікування
у попередні 2-3 місяці, а також загострення хронічного захворювання.

Отже, при вагітності наявність IgM не є ознакою первинного інфікування.
- Виявлення ізольовано IgG може вказувати як на імунітет до цього захворювання,
і на хронічну інфекцію. У другій ситуації має значення кількість антитіл (титр), і зміна цього титру в динаміці. Зазвичай дослідження проводять з інтервалом 2-4-6 тижнів.
- Виявлення IgA ізольовано або з IgM вказують на первинну інфекцію. При
Поява IgA разом з IgG передбачається активація хронічної інфекції (в середньому 2 тижні від моменту загострення).

Визначення авидності антитіл IgG є прекрасним доповнюючим етапом діагностики первинної інфекції від давнього зараження, що має своє клінічне значення, перш за все, в оцінці ризику внутрішньоутробного зараження плода.

Виявлення низькоавидних IgG вказує на первинну інфекцію та виявляються в середньому через 4-6 місяців після інфікування, рідше довше. Низьковидні IgG вимагають інших лабораторних підтверджень первинного інфікування (IgM).

Високовидні антитіла є або ознакою хронічного захворювання та його загострення, або сформованого імунітету.

Особливості у дітей грудного віку:у дітей до року, а іноді і 1,5 років у крові циркулюють материнські IgG до різних інфекцій (тобто відбулося їхнє проникнення через плаценти від матері до плода в період внутрішньоутробного розвитку).

Вона є самі собою ознакою наявності інфекції у теперішньому. Якщо ж у такому віці виявляються IgM (нагадаємо, що материнські IgM проникнути через плаценту не можуть), це ознака внутрішньоутробного інфікування або набутої після народження інфекції.

Кількісний ІФА-метод

Результат ІФА-діагностики (за допомогою імуноферментного аналізатора) видається у певних одиницях виміру:
- Оптична густина (ОП) проби - концентрація специфічних антитіл в одиниці об'єму.

Чим вище ВП проби, тим вище концентрація антитіл. У деяких результатах йдеться про коефіцієнт позитивності (КП) – це також оптична густина зразка.
- Одиниці концентрації антитіл (нанограм/мілілітр або нг/мл).

— У вигляді титрів сироваток: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 і таке інше. Діагностичні титри (у яких ставиться діагноз саме хвороби, а чи не факт інфікування) різні захворювання.
- У вигляді символів - "+", "-", "?" (+, ++, +++, ++++).
- У вигляді якісної оцінки за заданим критерієм (позитивно чи негативно).

Правильно оцінити кількість антитіл, варіант класового виявлення імуноглобулінів, а отже, виставити стадію хвороби та необхідність лікування може лише лікар.

Не можна забувати, що з будь-якої тест-системи розробляються свої «референтні значення» (варіанти норми), при перевищенні яких діагностується те чи інше захворювання (варіанти патології).

Для різних тест-систем "референтні значення" різні.

Коректне порівняння результатів ІФА, взятих у динаміці, можливе лише у разі їх виготовлення в одній і тій самій лабораторії.

Лікар інфекціоніст Бикова Н.І.

Аналіз ІФА (імуноферментне дослідження) – сучасна діагностична процедура, спрямована на виявлення в крові специфічних антитіл до збудників низки захворювань, визначення стадії розвитку патології та її етіології. Застосовується як метод контролю над процесом лікування та його ефективністю. У процесі дослідження аналізуються якісні та кількісні показники.

Метод ІФА має високу інформативність, точність результатів становить понад 96%. Діагностика доступна практично в будь-якій лабораторії та медичній установі.

Основні свідчення

Імуноферментне дослідження призначається з метою підтвердження наявності інфекційних захворювань, що передаються статевим шляхом:

• трихомоніазу;
• хламідіозу;
• уреаплазмозу;
• сифілісу та ін.

Також ІФА застосовується для діагностики вірусних захворювань:

• герпесу;
• герпесу 4 типу (вірус Епштейна-Барра);
• вірусного гепатиту;
• цитомегаловірусної інфекції.

Як підготуватися до дослідження

Біологічним матеріалом дослідження служить кров. За кілька днів до її здавання виключається прийом медикаментозних препаратів. За 14 днів зупиняється прийом антибіотиків, протигельмінтних та противірусних засобів.

Забір матеріалу здійснюється вранці натще. За годину до процедури дозволяється випити склянку води без газу, їду виключається.

Особливості аналізу

Для проведення дослідження береться венозна кров, обсягом щонайменше 5 мл. В окремих випадках як біоматеріал використовується спинномозковий ліквор, амніотична рідина або вміст склоподібного тіла.

Забір крові здійснюється за допомогою ін'єкційної голки, строго натщесерце, з метою уникнення хибнопозитивних результатів. За 12 годин слід відмовитися від куріння та прийому алкогольних напоїв. При вживанні наркотичних речовин результати аналізу спотворюються.

Якщо у висновку вказані негативні значення імуноглобулінів G, А, М, це говорить про початкову фазу розвитку патологічного процесу або про його відсутність. Такий результат реєструється за повного одужання на тлі проведеної терапії.

Негативний результат IgM та IgA та позитивний IgG говорять про формування імунітету після інфекційного захворювання або вакцинації.

Позитивний результат IgM та негативний або позитивний результат IgG, IgA свідчать про наявність гострої інфекційної патології.

Аналіз ІФА проводиться досить швидко, результати готові через добу після забору матеріалу.

Зміст

Для оцінки здатності організму чинити опір інфекційним хворобам або визначення фази патології застосовують аналіз крові. Метод ІФА займає важливе місце серед лабораторних досліджень, він допомагає всебічно вивчити діяльність захисної функції крові, визначити імунодефіцит при інфекційних захворюваннях, недугах крові, гормональних, аутоімунних процесах.

Що таке імуноферментний аналіз крові

Цей метод відноситься до лабораторних досліджень, що визначає наявність захисних факторів крові білкової природи (антитіл) до певних хвороботворних агентів (антигенів). Імуноферментний аналіз крові визначає імуноглобуліни, які можуть виявлятися як імунокомплекси. З'являються вони у разі виникнення складних нейрогуморальних реакцій імунного захисту людини, які стають відповіддю використання чужорідних антигенів.

Проти кожного виду хвороботворного агента виробляються в організмі специфічні антитіла. Далі відбувається зв'язування патологічного мікроорганізму або антигену, утворюється комплексна сполука «антиген-антитіло». Потім воно нейтралізується, відбувається ферментативний лізис, реакція фагоцитозу і закінчується процес виведенням з організму. Наявність конкретних комплексів, що визначається ІФА, говорить про вид збудника, шкідливу речовину у хворого.

Класи імуноглобулінів

Вченими виявлено та вивчено 5 видів імуноглобулінів: IgE, IgD, IgG, IgM, IgА. Існують і інші класи, але вони знаходяться ще на стадії дослідження, і не до кінця з'ясовано їхню роль. У практичній медицині важливе значення мають А, М, G. Інформативність, точність визначення базується на тимчасових проміжках, за які вони з'являються, досягають максимуму та зникають.

Показання до дослідження крові методом ІФА

За допомогою цього аналізу можна оцінювати ефективність лікування, проводити комплексне дослідження перед трансплантологічними операціями, визначати стан імунодефіциту та антитіла до понад 600 видів алергенів. Дослідження крові методом ІФА використовує як додатковий спосіб виявлення онкологічних клітин. Призначають аналіз при необхідності виявлення антитіл до мікробів, які провокують венеричні патології:

• трихомоніаз;
• сифіліс;
• токсоплазмоз;
• мікоплазмоз;
• уреаплазмоз.

При глистних інвазіях в аналізі ІФА буде відмічено зростання кількості імуноглобулінів. Проводиться дослідження для підтвердження наявності у хворого:

• вірусу Епштейна-Барра;
• герпетичних інфекцій;
• цитомегаловірусу;
• групи вірусних гепатитів

Аналіз крові методом ІФА

Імуноферментне дослідження крові не єдиний варіант визначення імуноглобулінів. Іноді для цього дослідження роблять паркан спинномозкової рідини, тканини склоподібного тіла, навколоплідних вод. При використанні крові набирають її із ліктьової вени за допомогою ін'єкційної голки. Здавати аналіз необхідно натще, перед ІФА не рекомендується приймати медичні препарати, які можуть вплинути на результат. Слід відмовитись від алкоголю, куріння, вживання наркотичних речовин перед здаванням біоматеріалу. Варіанти результатів тесту:

1. При негативних показниках імуноглобулінів IgG, IgM, IgA лікарі говорять про відсутність патології або початкової стадії. Такий же результат (негативний) буде після повного одужання після тривалого періоду.
2. Якщо IgG проявляється позитивно, а IgM та IgA не виявлено, це вказує на утворення імунітету після щеплення чи інфекційної хвороби.
3. При високих титрах IgM та негативних IgA, IgG ставлять діагноз гострого інфекційного захворювання.
4. При позитивному показнику IgG, IgM, IgA лікарі говорять про гостру фазу рецидиву вже наявної хронічної недуги.
5. При хронічній інфекції, що знаходиться на стадії стихання (ремісії), аналіз ІФА показує негативні титри IgM, а IgA та IgG будуть позитивними.

Переваги та недоліки ІФА аналізу

Основним негативним моментом цього дослідження є ймовірність отримання хибнопозитивних або хибнонегативних результатів. Причиною недостовірності стає прийом медикаментів, технічні недоліки лабораторії. Фальсифікувати аналіз може процес порушення метаболізму в організмі. Головними перевагами аналізу ІФА є:

• точність, діагностична специфічність;
• невисока собівартість аналізу;
• швидкість одержання результатів;
• можливість динамічного контролю за стадією патології, ефективності лікування;
• простота дослідження;
• можливість виконувати масові обстеження осередків інфекції;
• безболісність, безпека для хворого;
• застосування для обробки інформаційних технологій.

Відео

Знайшли у тексті помилку?
Виділіть її, натисніть Ctrl+Enter і ми все виправимо!

Імуноферментний аналіз(або скорочено ІФА) – це лабораторне дослідження, яке допомагає поставити точний діагноз, виявити приховані хвороби, визначити схильність до тих чи інших захворювань, а також контролювати ефективність призначеної терапії. Під час дослідження у сироватці крові пацієнта виявляються антигени, характерні для конкретних збудників, та антитіла до них.

В чому суть

Щоб зрозуміти принцип проведення ІФА, необхідно згадати, як працює імунна система організму, що таке «антиген» і «антитіла», і які функції вони виконують.

Антиген – це молекула, яка несе певну інформацію про клітину. Якщо в організм потрапляє чужорідний антиген, антитіла (або імуноглобуліни (Ig) у відповідь на появу в організмі чужорідного мікроорганізму зв'язуються з ним і упізнають, чи це свій чужий. При сигналі «чужий», антитіла починають знищувати потенційно небезпечний об'єкт. Така взаємодія «антиген -антитіло» називається імунним комплексом. На ньому і ґрунтується метод ІФА.

Показання

Аналіз широко застосовується для діагностики різноманітних захворювань. І що особливо цінно, це дослідження досить точно діагностує захворювання, які протікають в організмі приховано, без симптомів.

З його допомогою можна виявити:

• інфекційні захворювання, що передаються статевим шляхом (хламідіоз, уреаплазмоз, мікоплазмоз, сифіліс, герпес, ВІЛ тощо);
• токсоплазмоз, туберкульоз, гепатити, кір тощо;
• аутоімунні проблеми;
• онкологію;
• статеві гормони;
• гормони щитовидної залози;
• алергію.

ІФА дозволяє виявити навіть маркери серцевих захворювань. Крім того, його призначають і для оцінки ефективності курсу лікування, що проводиться, а також перед деякими видами хірургічних втручань.

Підготовка

Кров для дослідження береться з вени натще, бажано, вранці.

Напередодні слід утриматися від алкоголю, солодких напоїв, кави та великої вечері. Крім того, на результати показників може вплинути прийом певних лікарських засобів, тому необхідна консультація з лікарем.

За 4 години до проведення слід виключити куріння.

Імуноферментний аналіз крові в ВІН КЛІНІК

Міжнародний медичний центр ВІН КЛІНІК оснащений власною лабораторією з міжнародним сертифікатом контролю якості. Тут досвідчені та кваліфіковані фахівці проводять різноманітні аналізи (понад 1000 найменувань).

Серед переваг даного методу можна виділити те, що він вже на ранніх етапах розвитку хвороби виявляє її. Чутливість тесту складає 90%. Дослідження точно показує динаміку інфекційного процесу, що дозволяє фахівцеві відстежувати ефективність терапії. Весь процес проведення повністю автоматизований, що унеможливлює вплив так званого «людського фактора».

Додатково до того, високоточне обладнання дозволяє отримати достовірні результати дослідження за мінімально короткий проміжок часу.

Розшифрувати результати Ви зможете того ж дня із лікарем. На основі їх лікар вибере тактику лікування, яка підходить саме Вам.

ВІН КЛІНІК: За понад 25 років роботи нас обрали мільйони людей. Приєднуйтесь!

Лікарі

Адміністратор зв'яжеться з Вами для підтвердження запису. ММЦ «ВІН КЛІНІК» гарантує повну конфіденційність Вашого звернення.

ЗАГАЛЬНА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ

Вводиться вперше

Ця загальна фармакопейна стаття поширюється на метод імуноферментного аналізу (ІФА). Метод ІФА є високочутливим і високоспецифічним імунодіагностичним методом, за допомогою якого проводять якісне та кількісне визначення різних речовин, що мають властивості антигену, гаптену (неповноцінного антигену) або антитіла. Метод ІФА широко використовується для діагностики інфекційних та неінфекційних захворювань людини та тварин і може також застосовуватись для підтвердження якості імунобіологічних лікарських препаратів (ІЛП).

Принцип методу полягає у реакції специфічної взаємодії антигену з антитілом з утворенням імунного комплексу та подальшої детекції отриманого комплексу за допомогою спектрофотометрії, хемілюмінесценції та інших адекватних методик. Детекція може бути як прямою (коли досліджувана речовина сама має ферментативну активність, або вона позначена ферментною міткою), так і непрямою або непрямою (коли досліджувана речовина, що зв'язалося з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, інкубується з антитілами, міченими ферментом). Якісний аналіз дозволяє отримати інформацію про вміст антигену або антитіла у досліджуваному матеріалі за принципом «є/ні». При проведенні кількісного аналізу визначають концентрацію антигену або антитіла у досліджуваному матеріалі з використанням калібрувального графіка.

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

Метод ІФА включає 3 основні етапи: 1) утворення імунного комплексу "антиген (досліджувана речовина) - специфічне до нього антитіло" або навпаки; 2) формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом, що утворився на попередньому етапі, або з вільними місцями зв'язування (детермінантами); 3) перетворення субстрату під дією ферментної мітки в сигнал, що реєструється в результаті біохімічної реакції.

Усі методики виконання імуноферментного аналізу класифікуються як гомогенні чи гетерогенні.

Методики, в яких всі 3 стадії ІФА проходять в розчині, і між основними стадіями немає додаткових етапів поділу імунних комплексів, що утворилися, від непрореагованих компонентів, відносяться до групи гомогенних методів ІФА. В основі гомогенного ІФА, що застосовується, як правило, для визначення низькомолекулярних субстанцій, лежить процес пригнічення активності ферменту при його з'єднанні з антигеном або антитілом. В результаті реакції антиген-антитіло активність ферменту відновлюється. При утворенні імунного комплексу антиген-антитіло, що містить ферментну мітку, відбувається пригнічення активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярного субстрату, що обумовлено стеричним винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену відбувається зв'язування дедалі більше антитіл і зберігається дедалі більше вільних кон'югатів «антиген-фермент», здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат. Гомогенний метод ІФА проводиться дуже швидко. На аналіз одного визначення потрібно 1 хв. Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомолів.

Для гетерогенних методів характерно проведення аналізу у двофазній системі за участю твердої фази – носія і обов'язкова стадія поділу імунних комплексів від компонентів, що не прореагували (відмивання), які знаходяться в різних фазах (утворені імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а непрореагували) комплекси – в розчині. Гетерогенні методи, у яких формування імунних комплексів першої стадії протікає на твердої фазі, називають твердофазними методами.

Методи відносяться до гомогенно-гетерогенних, якщо 1 стадія – утворення специфічних комплексів – відбувається у розчині, а потім для поділу компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованим реагентом.

Метод гетерогенного ІФА складається із 3 основних етапів:

• іммобілізація антигену або антитіла на твердій фазі, одержаний комплекс називається імуносорбентом;
• видалення незв'язаного реагенту та блокування сайтів зв'язування на твердій підкладці за допомогою блокуючих білків, таких, наприклад, як альбумін, казеїн; інкубація аналізованого препарату з імуносорбентом для того, щоб відбулося їхнє зв'язування;

3) детекція завдяки ферментативної активності самої досліджуваної речовини або завдяки пов'язаній з аналізованим препаратом ферментативної мітці (прямий варіант). У деяких випадках проводиться додаткова інкубація комплексу «імуносорбент-досліджувана речовина» з вторинними антитілами, кон'югованими з ферментативною міткою (непрямий варіант).

Кількісне визначення досліджуваної речовини здійснюється шляхом додавання відповідного для детектора субстрату і порівняння сигналу досліджуваної речовини зі стандартним зразком.

Метод гетерогенного ІФА поділяють на неконкурентний ІФА та конкурентний ІФА. Схеми аналізу можуть бути модифіковані в процесі розробки лікарського засобу відповідно до необхідних вимог. Зміни мають бути зазначені у фармакопейній статті чи нормативній документації. Вибір способу постановки ІФА залежить від природи досліджуваної речовини та її кількості, так як різні види ІФА мають різну чутливість. Для оцінки якості речовин, що містять антитіла, можливе використання специфічних антиідіотипних антитіл.

Неконкуретний метод ІФА

Неконкурентний метод ІФА поділяється на кілька видів за типом детекції (прямий конкурентний, непрямий конкурентний) і за типом іммобілізованої на твердій фазі речовини (антиген або антитіло).

Прямий варіант ІФА

Може виконуватись 2 способами. У першому випадку досліджувана речовина (антиген) безпосередньо іммобілізована на твердій фазі; тоді мічене антитіло, що зв'язалося з антигеном, є детектором. При виконанні тесту в інший спосіб використовують іммобілізовані на твердій фазі антитіла. У цьому випадку детектором є досліджувана речовина, мічена ферментом.

Непрямий (непрямий) варіант ІФА

За виконання непрямого варіанта ІФА антиген іммобілізований на твердій фазі. Після блокування антигену додають розчин специфічних до нього антитіл. Після інкубації комплекс антиген-антитіло, що утворився, відмивають від нез'єднаних антитіл і додають мічений ферментом анти-імуноглобулін (анти-Ig), що виступає в ролі детектора. Анти-Ig детектори комерційно доступні для конкретних класів та підкласів Ig, що робить цей формат аналізу зручним для ізотипування антитіл. Крім того, використання міченого анти-Ig посилює сигнал у порівнянні з прямим методом імуноферментного аналізу, тим самим збільшуючи чутливість аналізу.

Метод «сендвіча» як варіант постановки ІФА

Найбільш поширеним неконкурентним методом є «сендвіч» метод. При його виконанні на твердій фазі іммобілізують первинні антитіла з їх подальшим блокуванням. Потім до них додають досліджувану речовину, що містить антиген, і інкубують. Після інкубації комплекс антиген-антитіло відмивають від антигену, що не зв'язався, і додають вторинні антитіла, мічені ферментом, і проводять детекцію.

Конкурентний метод ІФА

Конкурентний метод ІФА поділяється на кілька видів: на кшталт детекції (прямий конкурентний, непрямий (непрямий) конкурентний) і на тип іммобілізованої на твердій фазі речовини (антиген або антитіло).

Прямий конкурентний варіант ІФА

Для виявлення або кількісного визначення розчинних антигенів застосовують прямий конкурентний варіант ІФА з іммобілізованим антигеном на твердій фазі. Для цього використовують антиген-специфічні антитіла, кон'юговані з відповідним детектором (наприклад, пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, рутеній або флуоресцеїн). На тверду фазу іммобілізують стандартний антиген з наступним блокуванням. Кон'юговане з ферментативною міткою антитіло інкубують з досліджуваною речовиною (антигеном, що розчиняється). Потім цю суміш додають до іммобілізованого антигену, інкубують, а потім відмивають від комплексу, що не зв'язався антиген-антитіло. Наступний крок полягає в додаванні відповідного субстрату для ферменту, що використовується як мітка. Інгібування реакції, обумовлене наявністю 2 антигенів у системі, порівняно з контрольним зразком без конкурентного розчинного антигену, є обернено пропорційним значенню кількості досліджуваної речовини.

Виконання прямого конкурентного варіанту ІФА з іммобілізованим антитілом на твердій фазі аналогічно прямому конкурентному ІФА з іммобілізованим на твердій фазі антигеном, однак використовується для виявлення або кількісного визначення антитіл.

Непрямий (непрямий) конкурентний варіант ІФА

Цей спосіб постановки ІФА аналогічний прямому конкурентному варіанту, проте замість міченого антитіла або антигену при детекції використовується мічений анти-Ig реагент або мічені вторинні антитіла відповідно.

Загальні умови проведення методуІФА

Як тверду фазу для проведення імуноферментного аналізу застосовують різні матеріали: силікон, нітроцелюлоза, поліаміди, полістирол, полівінілхлорид, поліпропілен, акрил та інші. Твердою фазою можуть служити стінки пробірки, 96-лункові та інші планшети, кульки, намистини, а також нітроцелюлозні та інші мембрани, що активно сорбують білки. Від вибору твердої фази залежить принцип іммобілізації (гідрофобна, гідрофільна, ковалентна взаємодія). Найчастіше як тверда фаза використовують 96-лункові пластикові планшети для мікротитрування. Кількість лунок у планшеті може змінюватись. Планшет може бути прозорим (колориметрична детекція) та матовим (хемілюмінесцентна детекція, флуориметрія).

Іммобілізацію необхідно проводити без бульбашок повітря в лунці, оскільки їхня присутність змінює показання оптичної щільності. Можливе використання біотинілованих іммобілізованих реагентів. У цьому випадку реакції використовують стрептавідин і біотинильовану ферментативну мітку. Цей метод використовується для посилення сигналу. Час і температура іммобілізації, що залежать від кінетичної природи, стабільності та концентрації реагенту, мають бути зазначені у фармакопейній статті та нормативній документації.

Усі стадії імуноферментного аналізу, промивні та блокуючі розчини, часові проміжки та температурні умови для кожної стадії, кількість обертів за хвилину для інкубації на шейкері, умови детекції також повинні бути зазначені у фармакопейній статті та нормативній документації.

Приклади методик для деяких видів ІФА

Непрямий неконкурентний метод ІФА

1. Сорбція антигену.У кожну лунку 96-лункового планшета вносять 0,1-0,5 мкг антигену і 100 мкл 0,05 М карбонат-бікарбонатного буферного розчину (рН 9,6), якщо немає інших вказівок у фармакопейній статті або нормативної документації, і далі проводять сорбцію при температурі 4 Про протягом 16 год. Можливе використання інших буферних розчинів з високими значеннями pH. Інкубація проводиться під час струшування на горизонтальному шейкері для планшетів.

Відмивання (дворазове) молекул антигену, що не зв'язалися, здійснюється фосфатно-сольовим буферним розчином (pH 9,0), що містить 0,1 % твін-20 (по 300 мкл на лунку), якщо немає інших вказівок у фармакопейній статті або нормативної документації.

1. Блокування.Для блокування місць неспецифічного зв'язування антигенів або антитіл лунки планшета заповнюють фосфатно-сольовим буферним розчином (pH 9,0) або іншим буферним розчином, зазначеним у фармакопейній статті або в нормативній документації, що містить 1% розчин бичачого сироваткового альбуміну або інших білків , сухого молока та ін.), і інкубують протягом 10-15 хв при кімнатній температурі (якщо немає інших вказівок у фармакопейній статті чи нормативній документації).

ІІІ. Титрування специфічних антитіл.При необхідності кількісної оцінки досліджувану речовину (антиген або антитіло) титрують у серійних розведеннях паралельно зі стандартним зразком (СО).

Титрування можна проводити як у горизонтальних, так і вертикальних рядах планшета. Слід зазначити, що титрування антитіл проводиться у разі, якщо необхідно підібрати оптимальну концентрацію антитіл чи визначити їх титр. У разі, якщо оптимальна концентрація та/або титр антитіл визначені, то використовують рекомендоване для даних антитіл (сироватки) розведення.

При титруванні в першу лунку ряду вносять готове розведення антитіл - в середньому 1-10 мкг на лунку, далі послідовне розведення антитіл в лунках. Інкубацію зі специфічними антитілами проводять протягом 30 хв. при кімнатній температурі при струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.

Відмивання здійснюється не менше 3-4 разів за допомогою фосфатно-сольового буферного розчину pH 9,0, що містить 0,1% твін-20.

1. Додавання антивидових (антиглобулінових) антитіл, кон'югованих із ферментною міткою.Як детекторні (вторинні) антитіла використовуються антивидові поліклональні антитіла, кон'юговані з ферментативною міткою. Найчастіше використовуються козячі або кролячі антитіла, специфічні до цілої молекули або до Fc-фрагментів специфічних антитіл. Концентрація детекторних антитіл зазвичай вказується виробником у вигляді розведення вихідного розчину (наприклад, 1:1000).

Інкубація з вторинними міченими антитілами проводиться протягом 30 хв. при кімнатній температурі при струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.

Відмивання здійснюється не менше 3-4 разів за допомогою фосфатно-сольового буферного розчину (pH 9,0), що містить 0,1% твін-20.

Інкубація проводиться протягом 10 хв при кімнатній температурі та струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.

1. У лунки вносять по 100 мкл розчину субстрату та інкубують протягом 10 хв при кімнатній температурі та постійному перемішуванні. Для зупинення ферментативної реакції застосовують «стоп реагент», який додають у всі досліджувані та контрольні проби в рівних кількостях. Найчастіше як «стоп реагенту» застосовують сірчану кислоту.

Прямий неконкурентний метод ІФА

Методика прямого ІФА має лише невелику відмінність від методики непрямого неконкурентного ІФА. Так, І та ІІ стадії однакові в обох типах аналізу. Відмінність полягає в тому, що в прямому варіанті ІФА на стадії III використовують специфічні антигену досліджуваного антитіла, кон'юговані з ферментною міткою, і вони прямо взаємодіють з досліджуваною речовиною. При необхідності можна проводити титрування кон'югатів аналогічно принципу, описаному раніше для некон'югованих антитіл. Стадія IV у межах прямого неконкурентного ІФА не проводиться.

«Сендвіч» метод ІФА

У даному варіанті ІФА використовується пара антитіл (первинні та вторинні), специфічних до просторово віддалених епітопів антигену, що досліджується.

1. Сорбція антитіл на твердій фазі.Методика сорбції антигену аналогічна методиці сорбції антитіл у розділі «Непрямий неконкурентний метод ІФА».
2. Блокування.Методика блокування місць неспецифічного зв'язування на підкладці (твердій фазі) аналогічна методиці блокування, описаної в розділі «Непрямий неконкурентний метод ІФА».

ІІІ. Інкубація із антигеном.У лунки планшета з преадсорбованими антитілами вносять по 50 мкл досліджуваної речовини та стандартних розведень антигену, якщо немає інших вказівок у фармакопейній статті чи нормативній документації. Розведення антигену повинні бути приготовлені на основі фосфатно-сольового буферного розчину (pH 9,0), що містить 0,1% твін-20, оскільки твін-20 знижує неспецифічне зв'язування білкових молекул один з одним і поверхнею планшета. І досліджувана речовина, і стандартні розведення антигену вносять попарно в сусідні горизонтальному ряду лунки (або по 3 повторності), використовуючи по 2 (3) лунки на кожне розведення білка.

Інкубацію проводять за кімнатної температури протягом 30 хв при постійному перемішуванні. Відмивання здійснюється не менше 3-4 разів фосфатно-сольовим буферним розчином (pH 9,0), що містить 0,1% твін-20, або іншим буферним розчином, зазначеним у фармакопейній статті або нормативній документації.

1. Інкубація з антитілами, кон'югованими з ферментною міткою.У лунки планшета вносять по 100 мкл розчину специфічних антитіл, кон'югованих із ферментною міткою. Оптимальна концентрація кон'югованих антитіл зазвичай вказується у фармакопейній статті або нормативній документації (зазвичай використовують концентрацію 2–4 мкг/мл).

Інкубація з антитілами, що містять ферментну мітку проводиться протягом 30 хв при кімнатній температурі при струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.

Відмивання здійснюється не менше 3-4 разів за допомогою фосфатно-сольового буферного розчину (pH 9,0), що містить 0,1% твін-20, або іншим буферним розчином, зазначеним у фармакопейній статті чи нормативній документації.

1. Проведення ферментативної реакції, що супроводжується появою забарвленого продукту.Методика проведення ферментативної реакції аналогічна до методики, описаної в розділі: «Непрямий неконкурентний метод ІФА».

Детекція

Як було зазначено вище, для детекції використовуються мічені ферментною міткою або іншим реагентом антитіла. Як ферментну мітку можуть виступати, наприклад, пероксидаза хрону, лужна фосфатаза або галактозидаза. Як детектор можуть бути використані антитіла або антигени з іншими мітками. Вибір реагенту-детектора залежить від типу мітки, кон'югованої з антитілом або антигеном та способу детекції.

Як методи детекції можуть бути використані спектрофотометрія, хемілюмінесценція, флуориметрія та інші методи, виходячи з вибору мітки.

Результати кількісного методу ІФА

Результати кількісного методу ІФА розраховують за лінійною кривою калібрувальної зі зворотною регресією або за допомогою комплексного методу, що використовує нелінійну калібрувальну криву зі зворотною регресією. Методика інтерпретації результатів залежить від використовуваного способу постановки ІФА. Наприклад, за результатами випробування за допомогою кривої калібрування можна оцінювати концентрацію невідомого зразка, проводити оцінку напівмаксимальної концентрації інгібування або ефективної концентрації. Це дозволяє визначати кількість досліджуваної речовини або її активність у порівнянні з стандартним еталонним/калибровочным зразком (СО). Зазвичай вид калібрувальної кривої під час виконання кількісного методу ІФА, що характеризує концентрацію аналізованого препарату, залежить від розрахованого середнього значення нелінійно. У зв'язку з цим рекомендується використовувати різні математичні моделі для аналізу отриманої кривої. В інших випадках метод ІФА використовують як якісний метод, що дозволяє оцінити наявність тієї чи іншої досліджуваної речовини у пробі в межах чутливості методики.

Примітка.

Приготування карбонат-бікарбонатного буферного розчину (pH 9,6). У мірний циліндр місткістю 1000 мл вносять 1,59 г натрію карбонату (безводного) або 4,29 г карбонату натрію 10-водного і 2,93 г натрію гідрокарбонату, розчиняють у 800 мл води очищеної, доводять pH до 9,6, перемішують, далі доводять об'єм розчину до мітки очищеною водою і знову перемішують.