Хистологична техника. Методи и техники на микроскопия. Микроскопия - какво е това?

Микроскопски методи на изследване- начини за изследване на различни обекти с помощта на микроскоп. В биологията и медицината тези методи позволяват да се изследва структурата на микроскопични обекти, чиито размери са извън разделителната способност на човешкото око. Основата е светлинна и електронна микроскопия. В практическата и научната дейност лекарите от различни специалности - вирусолози, микробиолози, цитолози, морфолози, хематолози и др., В допълнение към конвенционалната светлинна микроскопия, използват фазово-контрастна, интерферентна, луминесцентна, поляризационна, стереоскопична, ултравиолетова, инфрачервена микроскопия. Тези методи се основават на различни свойства на светлината. В електронната микроскопия изображенията на изследваните обекти възникват поради насочен поток от електрони.

За светлинна микроскопия и други базирани на нея микроскопски методи за изследванеопределяне на стойност в допълнение към разделителната способност микроскопима характера и посоката на светлинния лъч, както и характеристиките на изследвания обект, който може да бъде прозрачен или непрозрачен. В зависимост от свойствата на обекта се променят физическите свойства на светлината - нейният цвят и яркост, свързани с дължината на вълната и амплитудата, фазата, равнината и посоката на разпространение на вълната. Въз основа на използването на тези свойства на светлината, различни микроскопски методи за изследване. За светлинна микроскопия биологичните обекти обикновено се оцветяват, за да се разкрият някои от техните свойства ( ориз. 1 ). В този случай тъканите трябва да бъдат фиксирани, т.к оцветяването разкрива определени структури само в убити клетки. В живата клетка багрилото е изолирано в цитоплазмата под формата на вакуола и не оцветява нейната структура. Светлинният микроскоп обаче може да изследва и живи биологични обекти, използвайки метода на виталната микроскопия. В този случай се използва кондензатор за тъмно поле, който е вграден в микроскопа.

Фазово-контрастната микроскопия се използва и за изследване на живи и неоцветени биологични обекти. Основава се на дифракцията на светлинен лъч в зависимост от характеристиките на излъчващия обект. В този случай дължината и фазата на светлинната вълна се променят. Обективът на специален фазово-контрастен микроскоп съдържа полупрозрачна фазова пластина. Живи микроскопични обекти или фиксирани, но не оцветени микроорганизми и клетки, поради своята прозрачност, практически не променят амплитудата и цвета на светлинния лъч, преминаващ през тях. причинявайки само фазово изместване на неговата вълна. Въпреки това, след преминаване през изследвания обект, светлинните лъчи се отклоняват от полупрозрачната фазова пластина. В резултат на това възниква разлика в дължината на вълната между лъчите, преминаващи през обекта, и лъчите на фоновата светлина. Ако тази разлика е най-малко 1/4 от дължината на вълната, тогава се появява визуален ефект, при който тъмен обект е ясно видим на светъл фон или обратно, в зависимост от характеристиките на фазовата пластина.

Интерферентната микроскопия решава същите проблеми като фазово-контрастната микроскопия. Но ако последното ви позволява да наблюдавате само контурите на обектите на изследване, тогава с помощта на интерферентна микроскопия можете да изучавате детайлите на прозрачен обект и да извършвате техния количествен анализ. Това се постига чрез разделяне на светлинния лъч в микроскоп: единият от лъчите преминава през частицата на наблюдавания обект, а другият минава през нея. В окуляра на микроскопа двата лъча са свързани и си взаимодействат. Получената фазова разлика може да бъде измерена чрез определяне на т.н. много различни клетъчни структури. Последователното измерване на фазовата разлика на светлината с известни показатели на пречупване позволява да се определи дебелината на живи обекти и нефиксирани тъкани, концентрацията на вода и сухо вещество в тях, съдържанието на протеини и др. Въз основа на данните от интерферентната микроскопия може косвено да се съди за пропускливостта на мембраните, ензимната активност и клетъчния метаболизъм на обектите на изследване.

Поляризационната микроскопия ви позволява да изучавате обекти на изследване в светлина, образувана от два лъча, поляризирани във взаимно перпендикулярни равнини, т.е. в поляризирана светлина. За целта се използват филмови поляроиди или призми на Николас, които се поставят в микроскоп между източника на светлина и образеца. Поляризацията се променя, когато светлинните лъчи преминават (или отразяват) през различни структурни компоненти на клетки и тъкани, чиито свойства са хетерогенни. В така наречените изотропни структури скоростта на разпространение на поляризирана светлина не зависи от равнината на поляризация; в анизотропни структури скоростта на нейното разпространение варира в зависимост от посоката на светлината по надлъжната или напречната ос на обекта. Ако коефициентът на пречупване на светлината по протежение на структурата е по-голям, отколкото в напречна посока, възниква положително двойно пречупване; в обратната връзка възниква отрицателно двойно пречупване. Много биологични обекти имат строга молекулярна ориентация, анизотропни са и показват положително двойно пречупване на светлината. Такива свойства имат миофибрилите, ресничките на ресничестия епител, неврофибрилите, колагеновите влакна и др.. Сравнението на естеството на пречупване на поляризираните светлинни лъчи и величината на анизотропията на даден обект позволява да се прецени молекулярната организация на неговата структура ( ориз. 2 ). Поляризационната микроскопия е един от хистологични методи на изследване,начин микробиологична диагностика,намира приложение в цитологични изследванияи т.н. В този случай както оцветени, така и неоцветени и нефиксирани, така наречените нативни препарати от тъканни срезове могат да бъдат изследвани в поляризирана светлина.

Флуоресцентната микроскопия се използва широко. Основава се на свойството на някои вещества да произвеждат блясък - луминесценция в UV лъчите или в синьо-виолетовата част на спектъра. Много биологични вещества, като прости протеини, коензими, някои витамини и лекарства, имат собствена (първична) луминесценция. Други вещества започват да светят само когато към тях се добавят специални багрила - флуорохроми (вторична луминесценция). Флуорохромите могат да се разпределят дифузно в клетка или селективно да оцветяват отделни клетъчни структури или определени химични съединения на биологичен обект. Това е основата за използването на флуоресцентна микроскопия при цитологични и хистохимични изследвания (вж. Хистохимични методи на изследване). С помощта на имунофлуоресценция във флуоресцентен микроскоп се откриват вирусни антигени и тяхната концентрация в клетките, идентифицират се вируси, определят се антигени и антитела, хормони, различни метаболитни продукти и др. ( ориз. 3 ). В тази връзка флуоресцентната микроскопия намира приложение в лабораторната диагностика на инфекции като херпес, заушка, вирусен хепатит, грип и др., използва се при експресна диагностика на респираторни вирусни инфекции, изследване на отпечатъци от носната лигавица на пациенти и при диференциална диагноза на различни инфекции. В патоморфологията, използвайки флуоресцентна микроскопия, те разпознават злокачествени тумори в хистологични и цитологични препарати, определят области на исхемия на сърдечния мускул в ранните стадии на инфаркт на миокарда, откриват амилоид в тъканни биопсии и др.

Ултравиолетовата микроскопия се основава на способността на определени вещества, които са част от живи клетки, микроорганизми или фиксирани, но не оцветени, прозрачни тъкани, да абсорбират UV радиация с определена дължина на вълната (400-250 nm). Това свойство притежават високомолекулни съединения, като нуклеинови киселини, протеини, ароматни киселини (тирозин, триптофан, метилаланий), пуринови и пирамидинови бази и др. С помощта на ултравиолетова микроскопия се изяснява локализацията и количеството на тези вещества и в случай на изучаване на живи обекти, техните промени в процеса на живот.

Инфрачервената микроскопия ви позволява да изследвате обекти, които са непрозрачни за видима светлина и UV радиация, като абсорбират светлина с дължина на вълната 750-1200 от техните структури. nm. Инфрачервената микроскопия не изисква предварителна химическа обработка на препаратите. Този вид микроскопски методи за изследваненай-често се използва в зоологията, антропологията и други клонове на биологията. В медицината инфрачервената микроскопия се използва главно в невроморфологията и офталмологията.

Стереоскопичната микроскопия се използва за изследване на триизмерни обекти. Дизайнът на стереоскопичните микроскопи ви позволява да видите обекта на изследване с дясно и ляво око от различни ъгли. Те изследват непрозрачни обекти при относително ниско увеличение (до 120 пъти). Стереоскопичната микроскопия се използва в микрохирургия,в патоморфологията със специално изследване на биопсичен, хирургичен и секционен материал, в съдебномедицински лабораторни изследвания.

Електронната микроскопия се използва за изследване на структурата на клетките, тъканите на микроорганизмите и вирусите на субклетъчно и макромолекулно ниво. Този M.m.i. ни позволи да преминем към качествено ново ниво на изучаване на материята. Той намери широко приложение в морфологията, микробиологията, вирусологията, биохимията, онкологията, генетиката, имунологията.Рязкото увеличаване на разделителната способност на електронния микроскоп се осигурява от потока на електрони, преминаващи във вакуум през електромагнитни полета, създадени от електромагнитни лещи. Електроните могат да преминават през структурите на изследвания обект (трансмисионна електронна микроскопия) или да се отразяват от тях (сканираща електронна микроскопия), отклонявайки се под различни ъгли, което води до изображение на луминисцентния екран на микроскопа. С трансмисионна (трансмисионна) електронна микроскопия се получава планарно изображение на структури ( ориз. 4 ), при сканиране - обемно ( ориз. 5 ). Комбинация от електронна микроскопия с други методи, като авторадиография, хистохимични, имунологични методи за изследване,дава възможност за електронно радиоавтографско, електронно хистохимично и електронно имунологично изследване.

Електронната микроскопия изисква специална подготовка на обектите за изследване, по-специално химическа или физическа фиксация на тъкани и микроорганизми. След фиксация биопсичният материал и секционният материал се дехидратират, изсипват се в епоксидни смоли, нарязват се със стъклени или диамантени ножове на специални ултратоми, които позволяват да се получат ултратънки срезове от тъкан с дебелина 30-50 nm. Те се контрастират и след това се изследват под електронен микроскоп. В сканиращия (растиращ) електронен микроскоп се изследва повърхността на различни обекти, като върху тях във вакуумна камера се нанасят електронно-плътни вещества и се изследват т. нар. реплики, които следват контурите на пробата. Вижте също

МИКРОСКОПИЧЕСКИ МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНЕ- методи за изследване на микроскопичната структура на различни обекти, чиито размери са извън разделителната способност на окото. М. м. и. играят важна роля в бактериални, вирусол., цитол., хематол., хистол. и други изследвания; те се използват и във фармакологията, химията, минералогията, кристалографията и др. Наред с конвенционалната светлинна микроскопия широко се използват стереоскопична, тъмнополева, интерферентна, фазово-контрастна, поляризационна, ултравиолетова, електронна микроскопия и др.

Основата за развитието на М. м. и. Работата на Abbe (E.K. Abbe) се появява върху дифракционните свойства на електромагнитното излъчване. С помощта на теорията на Abbe се определя разделителната способност на микроскопите и се произвеждат лещи без хроматична и сферична аберация, обективи, дифракционни решетки, осветителни и чертожни апарати.

Дифракционната решетка на Abbe се използва за изследване на дифракционни явления и се състои от система от тънки прозрачни и непрозрачни редуващи се линии, които се изрязват със специален нож в дебелината на метално покритие, нанесено върху стъклена подложка.

Осветителният апарат на Abbe се използва в микроскопи за осветяване на обект в пропускаща светлина. Състои се от огледало (плоско или вдлъбнато) и кондензатор, през който светлинният поток се насочва в равнината на обекта под формата на събиращ се сноп от лъчи, което осигурява по-висока осветеност на образеца и подобрява разделителната способност на образа. микроскоп. Кондензаторът обикновено се състои от две или три лещи; Лещата, която е най-близо до обектива, се монтира така, че плоската й повърхност да е успоредна на равнината на предмета на микроскопа. Когато кондензаторът се отдалечи от равнината на обекта, яркостта на осветеността намалява, но контрастът на изображението се увеличава.

Чертожният апарат Abbe се използва за скициране на хистол и препарати. Състои се от система от стъклени призми, разположени над окуляра на микроскопа, чиито ръбове насочват към окото на изследователя светлинни лъчи, които са преминали през хистола, препарата и се отразяват с помощта на огледало от лист хартия, разположен близо до микроскопът. Благодарение на това наблюдателят вижда комбинирано изображение на лекарството и ръката си, очертавайки, например, с молив, контурите на детайлите на гистола, картината на лекарството.

При използване на M. m. и. Правилното инсталиране на осветлението става важно, което обикновено се извършва по метода на Köhler. За тази цел се използва независим осветител, напр. OI-19, се позиционира така, че равнината на ирисовата диафрагма на осветителя да е на разстояние 15-25 cm от центъра на огледалото на микроскопа. След това, през 1/2-1/3 затворена диафрагма, изображение на нишка от лампа с нажежаема жичка се проектира върху центъра на огледалото на микроскопа, покрито с лист бяла хартия, за да се улесни наблюдението. Чрез промяна на разстоянието между микроскопа и осветителя, изображението на нишката се фокусира и след това огледалото на микроскопа насочва изображението в неговата леща. В този случай размерът на осветеното петно ​​трябва да съвпада с диаметъра на диафрагмата на отвора на микроскопа; рязко изображение може да се получи чрез промяна на позицията на кондензатора и равнината на огледалото. Накрая апертурната диафрагма на микроскопа се отваря и с помощта на макро- и микроскопски винтове се получава ярко и ясно изображение на обекта.

При работа с малки увеличения на микроскопа този метод не винаги осигурява пълно и равномерно осветяване на зрителното поле. В тези случаи отстранете или преместете настрани предната леща на кондензатора и използвайте кондензатор с голямо фокусно разстояние. Когато апертурната диафрагма на микроскопа е широко отворена, изображението може да няма достатъчно контраст. В процеса на отваряне контрастът на изображението се увеличава и дълбочината на полето се увеличава, но разделителната способност на микроскопа може да намалее поради нарастващите дифракционни явления. При смяна на обектива изображението трябва да се фокусира отново във фокалната равнина със затворена бленда на осветителя. Ако оста на осветителя се отклони от оста на лещата на микроскопа, краищата на изображението могат да бъдат осветени по различен начин. За да се гарантира, че осветяването на краищата на изображението става еднакво и равномерно по цялата площ на зрителното поле, когато се наблюдава изображението през окуляра, осветителят се премества.

Инсталиране на осветление по метода на Кьолер се използва и при изследване на лекарства в т.нар. тъмно поле. В този случай заменете обичайния кондензатор с такъв с тъмно поле и, наблюдавайки през окуляра, бавно повдигнете кондензатора, докато се появи изображение в тъмно поле.

Обектите, изследвани под микроскоп, могат да бъдат прозрачни или непрозрачни, т.е. променящи амплитудните и фазовите свойства на насоченото към тях електромагнитно излъчване. В зависимост от свойствата на обекта се променят физическите свойства. свойства на светлината – цвят (дължина на вълната), яркост (амплитуда на вълната), фаза, равнина и посока на разпространение на вълната, които се използват в магнитния резонанс. Светлинният микроскоп се използва за микроскопско изследване на цветни предмети. Цветът на изображението и разликите в оцветяването често позволяват да се прецени химичните свойства. естеството на отделните структури на изследвания обект, но не дават възможност да се оцени неговата жизнена активност (движение, хемотаксис, сливане и др.), т.к. При боядисване често се използват химикали. или температурна фиксация, която убива биола, обекта, но осигурява ефективно оцветяване. За разлика от изследването на фиксирани биообекти, виталната микроскопия се основава на интравитално оцветяване, в резултат на което много структури на жива клетка се променят малко под въздействието на специални багрила. Виталната микроскопия може да се извърши без оцветяване, ако в конвенционален светлинен микроскоп се постави кондензатор с тъмно поле.

Ултравиолетовата микроскопия се използва при цитолни и хистохимични изследвания. Тя ви позволява да изучавате локализацията и количественото разпределение на високомолекулни съединения (протеини, нуклеинови киселини) в клетките и тъканите и да наблюдавате тяхната динамика по време на живота. Този метод позволява да се изследва изследваният материал без предварително фиксиране и оцветяване на препарати, например с цел интравитално изследване на микрообекти.

Ултравиолетовата абсорбционна микроскопия се основава на способността на определени вещества, които изграждат тъкани и клетки, прозрачни във видимата светлина, да абсорбират ултравиолетови лъчи с определена дължина на вълната.

При изучаване на живи или неподвижни небоядисани обекти контрастът на изображението се увеличава поради селективното поглъщане на ултравиолетовите лъчи от високомолекулни съединения. По-специално, ултравиолетовата микроскопия е важна за изследване на разпределението в клетката на нуклеинови киселини, които абсорбират ултравиолетова радиация в спектралната област от прибл. 260 nm. Абсорбцията на ултравиолетовото лъчение от протеините зависи от ароматните аминокиселини, включени в техния състав (тирозин, триптофан, фенилаланин), които дават максимална абсорбция в спектралната област от прибл. 280 nm. За да се получи визуално представяне на разпределението на веществата в препарата, изследваната зона се фотографира в ултравиолетова светлина с различни дължини на вълната. След това снимките се заснемат отново на цветен филм в хромоскоп, в който син филтър се поставя пред снимката, направена в късовълнови лъчи, зелен филтър в средно дълги лъчи и червен филтър в дълговълнови лъчи . С помощта на специално устройство тези изображения се комбинират на екрана и изображението става видимо, предавайки във фалшиви цветове разликите в абсорбцията на ултравиолетовите лъчи от отделните клетъчни структури.

Ултравиолетовата флуоресцентна микроскопия, подобно на абсорбционната микроскопия, се използва за цитохимични изследвания на живи или фиксирани неоцветени обекти, поради факта, че ултравиолетовите флуоресцентни спектри на веществата се различават един от друг.

Инфрачервената микроскопия позволява да се определи структурата на обекта по естеството на абсорбцията на светлина с дължина на вълната 800-1000 nm. Изследването в инфрачервена светлина на вещества, които са частично или напълно непрозрачни в ултравиолетовата и видимата област на спектъра, е широко разпространено. За инфрачервена микроскопия биол, обектите не се подлагат на допълнителни химикали. обработка. С помощта на инфрачервен микроскоп се изследва импрегнирана нервна тъкан и капиляри в гистол, срезове и се разпознава увреждане на ретината и ириса.

За да се увеличи разделителната способност на М. м. и. създават оптични системи, базирани на електромагнитни лещи, използвайки поток от електрони като източник на радиация, например за електронна микроскопия (виж) се използва лъч от бързи електрони, а ролята на лещите се играе от електрически и магнитни полета на определен конфигурация. Вид електронна микроскопия е сканиращата (растерна) микроскопия, която позволява да се получи триизмерно изображение на обект поради излъчваните от него вторични електрони.

В някои микроскопи плавното, безстепенно увеличение без смяна на обектива позволява в широк диапазон да се установят детайлите на обекта на интерес, например динамиката на биолите, процесите, протичащи в тъканните култури.

Библиография: Appelt G. Въведение в методите за микроскопско изследване, прев. от немски, М., 1959, библиогр.; Биофизични методи на изследване, изд. Ф. Хуберт, прев. от англ., М., 1956; D e Robertis E., Novinsky V. и Saus F. Cell Biology, прев. от английски, стр. 94, М., 1973; Ditchburn R. Физическа оптика, прев. от англ., М., 1965; Илин П. С., Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторни оптични инструменти, М., 19 66, библиогр.; L и l l и R. Патохистологични техники и практическа хистохимия, прев. от английски, стр. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопи, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевски.

Светлинна микроскопия

Когато използва този метод, изследователят оперира със следните понятия:

Нараства– физическо свойство на лещите на обектива и окуляра. Увеличението на микроскопа се оценява като произведение от увеличението на обектива и увеличението на окуляра.

Минимален размер на наблюдавания обект(d) и резолюция на микроскопа– стойности, които зависят от характеристиките на лещите на обектива, дължината на вълната и индекса на пречупване на средата, разделяща обекта на изследване от обектива или кондензаторните лещи. Разделителната способност на микроскопа се увеличава чрез използване на течни среди (имерсионни среди), т.к индексът им на пречупване е по-голям от този на въздуха. При микроскопията се използват маслена, глицеринова и водна имерсионна среда. Теоретично възможно ограничение на резолюциятасветлинен микроскоп – 0,2 µm (минималното разстояние, на което се различават два обекта).

Специални видове микроскопия

Тъмно поле. Специален кондензатор се използва за подчертаване на контрастиращите структури на небоядисания материал. Микроскопията с тъмно поле ви позволява да наблюдавате живи обекти. Наблюдаваният обект изглежда осветен на тъмно поле. В този случай лъчите от осветителя падат върху обекта отстрани и само разпръснати лъчи влизат в лещите на микроскопа.

Фазов контраст Микроскопията позволява изследване на живи и неоцветени обекти. Когато светлината преминава през боядисани обекти, амплитудата на светлинната вълна се променя, а когато светлината преминава през небоядисани обекти, фазата на светлинната вълна се променя, което се използва за получаване на изображения с висок контраст при фазово-контрастна и интерферентна микроскопия.

Поляризация микроскопия - изобразяване на неоцветени анизотропни структури (например колагенови влакна и миофибрили).

Намеса Микроскопията съчетава принципите на фазовия контраст и поляризационната микроскопия и се използва за получаване на контрастни изображения на неоцветени обекти.

Луминесцентни микроскопията се използва за наблюдение на флуоресцентни (луминисцентни) обекти. Във флуоресцентния микроскоп светлината от мощен източник преминава през два филтъра. Един филтър спира светлината пред пробата и пропуска светлина с дължина на вълната, която възбужда флуоресценцията от пробата. Друг филтър позволява на светлината с дължината на вълната, излъчвана от флуоресцентния обект, да премине. Така флуоресцентните обекти абсорбират светлина с една дължина на вълната и излъчват в друга област на спектъра.

Флуоресцентните багрила (флуоресцеин, родамин и др.) селективно се свързват със специфични макромолекули.

Електронна микроскопия

Теоретичната разделителна способност на предавателната ЕМ е 0,002 nm. Реалната разделителна способност на съвременните микроскопи се доближава до 0,1 nm. За биологични обекти ЕМ резолюцията на практика е 2 nm.

Полупрозрачен ЕМ се състои от колона, през която електроните, излъчени от катодна нишка, преминават във вакуум. Сноп от електрони, фокусиран от пръстеновидни магнити, преминава през подготвената проба. Естеството на разсейването на електрони зависи от плътността на пробата. Електроните, преминаващи през пробата, се фокусират, наблюдават се на флуоресцентен екран и се записват с помощта на фотографска плака.

Сканиране на EM използва се за получаване на триизмерно изображение на повърхността на обекта, който се изследва.

Чипов метод (замразяване-разцепване) се използва за изследване на вътрешната структура на клетъчните мембрани. Клетките се замразяват при температура на течен азот в присъствието на криопротектор и се използват за направата на чипове. Равнините на разцепване преминават през хидрофобната среда на липидния двоен слой. Откритата вътрешна повърхност на мембраните се оцветява с платина и получените реплики се изследват в сканиращ електронен микроскоп.

В зависимост от свойствата на обекта светлината променя своите физически свойства – цвят (дължина на вълната), яркост (амплитуда на вълната), фаза и се използва в съвременните микроскопи за създаване на контраст.

Ориз. 1. Микроскоп MBI-3: 1 - крак или обувка; 2 - ламбда за грубо движение на тръбата; 3 - държач на тръбата; 4 - окуляри; 5 - приставка за бинокъл; 6 - глава за закрепване на револвер със седалка за смяна на тръби; 7 - винт за закрепване на приставката за бинокъл; 8 - револвер на шейна; 9 - лещи; 10 - предметна маса; 11 - агнешко за надлъжно движение на държача на лекарството; 12 - агне за напречно движение на държача на лекарството; 13 - апланатичен кондензатор на пряко и наклонено осветление; 14 - центриращи винтове за маса; 15 - глава на винта, фиксиращ горната част на сцената; 16 - скоба на кондензатора; 17 - микромеханизъм крило; 18 - огледало; 19 - кутия с микромеханизъм.

Фиксираните умъртвени препарати се оцветяват най-лесно. Такива стационарни препарати могат да бъдат изследвани и фотографирани с висока точност през микроскоп, но те не позволяват да се оценят различните форми на жизнена активност на микроскопичния обект (движение, сливане, фагоцитоза и др.). Известни са бои, които се свързват с живите клетки, без да нарушават жизнените им функции.

жизненоважен(интравитална) микроскопия показва, че много структури на жива клетка се променят относително малко с умела фиксация и последващо оцветяване. Това потвърждава високата научна стойност на информацията, получена чрез микроскопия на цветни обекти. Виталната микроскопия е възможна без оцветяване, ако в обикновен микроскоп се постави така нареченият кондензатор с тъмно поле. Той осветява обекта по такъв начин, че само онези лъчи, които се разпръскват върху частиците на обекта и по този начин променят посоката на тяхното разпространение, влизат в окото на наблюдателя. Лъчите, които преминават през фона, без да се разсейват, не достигат до окото. Поради това частиците на обекта светят и се открояват ярко на тъмен фон (тъмно поле). Частиците на обекта са ясно видими, дори ако размерите им са по-малки от разрешеното разстояние.

Тъмно полемикроскопията осигурява най-високия възможен контраст на изображението, но неговата яснота и полезно увеличение са значително по-ниски, отколкото при конвенционалната микроскопия. Микроскопията с тъмно поле се използва успешно за изследване на спирохети, лептоспири и други слабо оцветяващи микроорганизми. Не е приложим при работа с хистологични препарати.

Технически независим вариант на микроскопия в тъмно поле е ултрамикроскопия, при който най-малките изследвани частици се осветяват от мощен страничен лъч светлина и се виждат като точки на черен фон. Ултрамикроскопията ви позволява да преброите частиците, да оцените техните размери и други свойства. Използва се за изследване на колоидни разтвори, аерозоли и суспензии.

През последните години тъмнополевата микроскопия се използва все по-рядко, тъй като се появиха два нови вида контрастни устройства със значително по-добри характеристики - фазово-контрастни (фиг. 2, а и б) и амплитудно-контрастни микроскопи. Те са технически сходни, но използват различни промени в светлинния лъч в обекта. Лъчът, преминаващ през фона на пробата, в идеалния случай не претърпява никакви промени. Преминава през точно определени зони на лещата. Лъч, преминаващ през обект, претърпява дифракция, т.е. той се разпада на лъчи с намаляващ интензитет, които излизат от обекта под различни ъгли. Други свойства на лъча (амплитуда, дължина на вълната, фаза) варират в различна степен в зависимост от характеристиките на обекта.

Ориз. 2. Микроскоп MBI-3 (a) с фазово-контрастно устройство KF-1 (b): 1 - кондензатор на въртящата се система; d - набор от лещи и пръстеновидни диафрагми; 3 - спомагателен микроскоп.

Почти всички живи микроскопични обекти изглеждат едва забележими и прозрачни в конвенционален микроскоп, тъй като почти не променят нито амплитудата, нито цвета на лъча, преминаващ през тях.

Те променят само фазата на вълната му, но тази промяна не се улавя нито от окото, нито от фотоплаката. Сноп от лъчи, дифрагиран от обект и изместен във фаза от него, преминава през тези области на лещата, където директните, недифрактирани фонови лъчи не могат да преминат. На практика не е трудно да се определи къде точно ще преминат тези лъчи. Ако покриете тази област на една от лещите на обектива с полупрозрачна пластина, която може да промени фазата, интензитета, цвета или всичките три свойства заедно, тогава фоновото изображение ще промени фазата си, яркостта му ще намалее или цветът му ще се промени. Лъчите, които преминават през обекта и се отклоняват (дифрагират) от него, ще заобиколят пластината, поставена в лещата и следователно няма да придобият същите свойства, които придобиват фоновите лъчи след преминаване през пластината. В резултат на това разликата между лъчите на фона и обекта ще се увеличи. Ако фазовата разлика между лъчите на фона и обекта достигне 1/4 от дължината на вълната, тогава в крайното изображение се появява контраст, забележим за окото и фотографската плака: тъмен обект на светъл фон или, обратно, в зависимост от структурата на плочата, която в този случай се нарича "фаза". Ако плочата променя главно яркостта и цвета на фона, тогава такъв микроскоп трябва да се нарича амплитудно-контрастен (по-краткото, макар и не съвсем правилно, наименование „аноптрал“ стана широко разпространено). По този начин разликата между фазово-контрастния и амплитудно-контрастния микроскоп се определя от свойствата на пластината в лещата, която променя свойствата на недифрактираните фонови лъчи. Изображенията, произведени от тези микроскопи, са много по-ярки и по-богати на детайли (фиг. 3 и 4) от изображенията в тъмно поле.

Ориз. 3. Култура на многоклетъчната бактерия Caryophanon latum Peshkoff. Амплитудна контрастна микроскопия.
Ориз. 4. Микроколонии от вас. мегатериум, заразен с фаг. Амплитудна контрастна микроскопия.

С появата на фазово- и амплитудно-контрастни микроскопи жизнената микроскопия получи отлична техническа и методологична основа, чиито възможности са близки до ограничаващите за светлинната оптика. Тези устройства не изискват фиксиране или боядисване на обекта. Съвременната витална микроскопия значително разшири познанията ни за поведението и динамиката на живите микрообекти в естествени и лабораторни условия на живот и експерименти. Ускореното (бързо) и забавеното (забавено) микрофилмиране направи достъпни за изследване процеси, чиято скорост на потока е твърде висока или твърде ниска за визуално наблюдение.

Индустриално произведените фазово-контрастни и амплитудно-контрастни (аноптрални) устройства са евтини и могат лесно да се монтират на търговски микроскопи; използването им не е трудно. Тези устройства несъмнено ще намерят нови области на приложение както в научните изследвания, така и в медицинската практика.

Ултравиолетова микроскопиявъз основа на способността на определени вещества да абсорбират избирателно ултравиолетовите лъчи с определена дължина на вълната. Това дава възможност ясно да се демонстрира и изследва, включително количествено, разпределението на веществата в живи клетки или фиксирани препарати. Например протеините и нуклеиновите киселини са еднакво прозрачни за видимата светлина; Чрез гледане на неоцветена клетка във видима светлина е невъзможно да се определи къде се намира протеинът или нуклеиновата киселина. Но нуклеиновата киселина абсорбира ултравиолетовите лъчи с определена дължина много по-силно от протеина. Следователно в ултравиолетов микроскоп зоната, съдържаща нуклеиновата киселина, изглежда много по-тъмна. Тъй като ултравиолетовите лъчи не се възприемат директно от окото, трябва да се използват специални преобразуватели на светлина. Ултравиолетовата микроскопия е технически много по-сложна от конвенционалната светлинна микроскопия, нейното оборудване е по-скъпо и техниката й е по-сложна. Въпреки това използването му е оправдано, тъй като научното значение на бързото топографско описание на химичния състав на живата клетка е много голямо.

Много по-достъпна и обещаваща е флуоресцентната микроскопия (виж), която сега се използва широко в изследователски и клинични диагностични лаборатории. В този случай жив обект се третира със специални багрила, които при осветяване със синя, виолетова или ултравиолетова светлина започват да светят, излъчвайки по-дълги вълни (зелено, жълто). Цветът на възбуденото вторично сияние зависи от химичните свойства на обекта и багрилото, въведено в него.

Поляризационна микроскопиясе основава на промяна в равнината на вибрация на светлинна вълна след преминаване през кристали. Не се използва в практическата медицина.

Съвременната микроскопия изисква използването на разнообразно спомагателно оборудване. Нагревателните маси и термостатите ви позволяват да поддържате и наблюдавате обект за дълго време при дадена температура. За дългосрочно култивиране на микроби или тъканни култури в зрителното поле на силна леща се използват различни микрокамери. Окулярните и обективните микрометри правят възможни прецизни измервания на микрообекти. Индустрията произвежда микроманипулатори (виж) за операции върху микрообекти. Бинокулярните лупи (виж) и стереомикроскопите (фиг. 5) са предназначени за получаване на стереоскопични изображения при увеличения до 100 пъти. Широко се произвежда и използва оборудване за микрофотография и микрокино (фиг. 6). Вижте също Микроскопска техника.

Ориз. 5. Стереоскопичен микроскоп MBS-1.

Ориз. 6. Микрокино инсталация MKU-1.

Светлинна микроскопия. Светлинната микроскопия се основава на различните свойства на светлината. Светлинната микроскопия осигурява увеличение до 2-3 хиляди пъти, цветно и движещо се изображение на жив обект, възможност за микрофилмиране и дългосрочно наблюдение на същия обект, оценка на неговата динамика и химия. Съвременните светлинни микроскопи са доста сложни инструменти, които са били подобрявани през 400-те години от създаването на първия прототип на микроскоп.

Осветлението играе много важна роля в микроскопията. Неправилното или недостатъчно осветление няма да ви позволи да използвате напълно възможностите на микроскопа.

Доброто осветление се постига чрез инсталиране на светлина по метода на Келер. За да направите това, инсталирайте осветителя на разстояние 30-40 cm от микроскопа и, като преместите гнездото с електрическата крушка или целия осветител, постигнете ясен образ на нажежаемата жичка на лампата върху напълно затворената диафрагма на кондензатора, така че това изображението запълва изцяло отвора на кондензатора. След като затворите диафрагмата на осветителя, отворете диафрагмата на кондензатора и, като преместите кондензатора, постигнете рязко изображение на диафрагмата на осветителя в зрителното поле на микроскопа. За да предотвратите заслепяването на очите от ярка светлина, първо намалете интензитета на нишката на лампата с помощта на реостат. И накрая, с помощта на огледало, изображението на отвора на блендата се поставя в центъра на зрителното поле и диафрагмата на осветителя се отваря, така че цялото видимо зрително поле да бъде осветено. Няма нужда да отваряте допълнително блендата, тъй като това няма да увеличи осветеността, а само ще намали контраста поради разсеяната светлина.

Видове светлинна микроскопия:

1) Имерсионна светлинна микроскопия. Имерсионните обективи се използват за изследване на обекти, които са невидими или слабо видими през сухи микроскопски системи. 2) Микроскопията с фазов контраст е предназначена за получаване на изображения на прозрачни и безцветни обекти, които са невидими, когато се наблюдават с помощта на метода на светлото поле. 3) Аноптралната микроскопия е тип фазово-контрастна микроскопия, при която лещи със специални пластини, нанесени върху една от лещите под формата на затъмнен пръстен 4) Методът на интерферентен контраст (интерферентна микроскопия) се състои в това, че всеки лъч се раздвоява, когато влезе в микроскопа. Единият от получените лъчи се насочва през наблюдаваната частица, а другият - покрай нея по същия или допълнителен оптичен клон на микроскопа. В окулярната част на микроскопа двата лъча отново са свързани и си взаимодействат. Един от лъчите, преминавайки през обект, се забавя във фазата (придобива разлика в пътя в сравнение с втория лъч).5) Поляризационната микроскопия е метод за наблюдение в поляризирана светлина за микроскопско изследване на препарати, съдържащи оптично анизотропни елементи (или състоящи се изцяло от такива елементи) .6) Микроскопия в тъмно поле. При микроскопията с тъмно поле образецът се осветява отстрани с наклонени снопове лъчи, които не влизат в лещата. В лещата влизат само лъчи, които се отклоняват от частиците на лекарството в резултат на отражение, пречупване или дифракция. Поради това микробните клетки и други частици изглеждат светещи ярко на черен фон (картинката прилича на мигащо звездно небе). 7) Луминесцентна микроскопия- метод за наблюдение под микроскоп на луминесцентното сияние на микрообектите, когато са осветени със синьо-виолетова светлина или ултравиолетови лъчи Луминесцентна микроскопия.Методът се основава на способността на определени вещества да светят, когато са изложени на светлинни лъчи с къса дължина на вълната. В този случай дължината на вълната на светлината, излъчвана по време на луминесценцията, винаги ще бъде по-голяма от дължината на вълната на светлината, възбудена от луминесценцията. Така че, ако осветите обект със синя светлина, той ще излъчва червени, оранжеви, жълти и зелени лъчи. Препаратите за флуоресцентна микроскопия се оцветяват със специални луминесцентни луминесцентни багрила - флуорохроми (акридин оранжево, флуоресцеин изотиоцианат и др.). Светлинните лъчи от силен източник (обикновено живачна лампа със свръхвисоко налягане) преминават през синьо-виолетов филтър. Когато са изложени на това късовълново лъчение, оцветените с флуорохром клетки или бактерии започват да светят в червено или зелено. За да се гарантира, че синята светлина, която причинява луминесценция, не пречи на наблюдението, над окуляра е поставен блокиращ жълт филтър, който блокира сините лъчи, но пропуска жълтите, червените и зелените лъчи. В резултат на това, когато се наблюдават под флуоресцентен микроскоп, клетките или бактериите ще бъдат видими на тъмен фон, светещи в жълто, зелено или червено. Например, когато се оцвети с акридиново оранжево, ДНК на клетката (ядрената материя) ще свети ярко зелено. Методът на флуоресцентна микроскопия дава възможност за изследване на живи, нефиксирани бактерии, оцветени със силно разредени флуорохроми, които не увреждат клетките на света. По естеството на сиянието могат да се разграничат отделни химични вещества, които изграждат микробната клетка. Микроскопия в тъмно поле.При микроскопията с тъмно поле образецът се осветява отстрани с наклонени снопове лъчи, които не влизат в лещата. Само лъчите влизат в лещата и се отклоняват от частиците на лекарството в резултат на отражение, пречупване или дифракция. Поради това микробните клетки и други частици изглеждат светещи ярко на черен фон (картинката прилича на мигащо звездно небе).

За микроскопия в тъмно поле се използват специален кондензатор (параболоиден кондензатор или кардиоиден кондензатор) и конвенционални обективи. Тъй като хардуерът на потапящия обектив е по-голям от апертурата на кондензатора на тъмното поле, специална тръбна диафрагма е вмъкната вътре в потапящия обектив, за да се намали неговата апертура.

Този метод на микроскопия е удобен за изследване на живи бактерии, спирохети и тяхната подвижност.

Фазова контрастна микроскопия.Обикновените цветни препарати поглъщат част от преминаващата през тях светлина, в резултат на което амплитудата на светлинните вълни намалява, а частиците на препарата изглеждат по-тъмни от фона. Когато светлината преминава през неоцветен препарат, амплитудата на светлинните вълни не се променя, променя се само фазата на светлинните вълни, преминаващи през частиците на препарата. Въпреки това, човешкото око не е в състояние да открие тази промяна във фазата на светлината, така че неоцветен образец ще бъде невидим в микроскоп, ако осветлението е правилно инсталирано.

Устройството за фазов контраст позволява промените във фазата на лъчите, преминаващи през частиците на неоцветено лекарство, да бъдат преобразувани в промени в амплитудата, забележими за човешкото око, и по този начин прави неоцветените лекарства ясно видими.

Устройството за фазово-контрастна микроскопия включва кондензатор с набор от пръстеновидни диафрагми, които осигуряват осветяване на образеца с пълен конус от светлина, и фазово-контрастни обективи, които се различават от конвенционалните по това, че в основния им фокус има полупрозрачен фазова плоча под формата на пръстен, предизвиквайки фазово изместване на светлината, преминаваща през нея. Осветлението е инсталирано така, че цялата светлина, преминаваща през пръстеновидната диафрагма на кондензатора, впоследствие преминава през фазовия пръстен, разположен в лещата.

Когато изследвате препарат, цялата светлина, преминаваща през области на препарата, в които няма обекти, ще премине през фазовия пръстен и ще даде ярко изображение на фона. Светлината, преминаваща през присъстващи в препарата частици, например бактериални клетки, ще получи някаква фазова промяна и освен това ще бъде разделена на два лъча - недифрагиран и дифрагиран. Недифрактираните лъчи, след като преминат през пръстеновидната фазова пластина в лещата, ще получат допълнително фазово изместване. Дифрактираните лъчи ще преминат през фазовата плоча и тяхната фаза няма да се промени. В равнината на полевата диафрагма на окуляра ще възникне интерференция (суперпозиция) на дифрактирани и недифрактирани лъчи и тъй като тези лъчи се движат в различни фази, ще настъпи взаимното им частично премахване и намаляване на амплитудата. Това ще направи микробните клетки да изглеждат тъмни на светъл фон.

Съществени недостатъци на фазово-контрастната микроскопия са ниският контраст на получените изображения и наличието на светещи ореоли около обектите. Фазово-контрастната микроскопия не увеличава разделителната способност на микроскопа, но помага да се идентифицират подробности за структурата на живите бактерии, етапите на тяхното развитие, промените в тях под въздействието на различни агенти (антибиотици, химикали и др.).

Електронна микроскопия.Електронната микроскопия се използва за изследване на структурата на клетките на субклетъчно и молекулярно ниво, както и за изследване на вируси. Стойността на електронната микроскопия се крие в нейната способност да разделя обекти, които не се разрешават от оптичен микроскоп във видима или ултравиолетова светлина. Малката дължина на вълната на електроните, която намалява правопропорционално на приложеното ускоряващо напрежение, позволява резолюция, т.е. разграничават като отделни обекти, разделени само от 2A (0,2 nm или 0,0002 µm) или дори по-малко, докато границата на разделителна способност на светлинната оптика е около 0,2 µm (зависи от дължината на вълната на използваната светлина) .

Електронната микроскопия, при която изображение се получава чрез преминаване (предаване) на електрони през проба, се нарича трансмисионна микроскопия. При сканираща (растерна) или тунелна електронна микроскопия лъч от електрони бързо сканира повърхността на пробата, причинявайки радиация, която през катодно-лъчева тръба формира изображение върху светлинен микроскопски екран, подобно на формирането на телевизионно изображение.

Основният оптичен дизайн на електронния микроскоп е подобен на този на светлинния микроскоп, в който всички оптични елементи са заменени със съответните електрически: източникът на светлина е заменен с електронен източник, стъклените лещи са заменени с електромагнитни лещи. В трансмисионните електронни микроскопи се разграничават три системи: електронно-оптична, вакуумна и захранваща.

Източникът на електрони е електронна пушка, състояща се от V-образен волфрамов термичен катод, който при нагряване до 2900 ° C и прилагане на постоянно напрежение до 100 kV, в резултат на топлинна емисия, излъчва свободни електрони, които са след това се ускорява от електростатичното поле, създадено между фокусиращия електрод и анода. След това електронният лъч се формира с помощта на кондензаторни лещи и се насочва към изследвания обект. Електроните, преминаващи през обект, поради различната му дебелина и електрическа плътност, се отклоняват под различни ъгли и навлизат в лещата на обектива, което формира първото увеличение на обекта.

След лещата на обектива електроните влизат в междинната леща, която е предназначена да променя плавно увеличението на микроскопа и да получава дифракция от областите на изследваната проба. Прожекционният обектив създава окончателно увеличено изображение на обекта, което се насочва върху флуоресцентен екран. Благодарение на взаимодействието на бързите електрони с луминофора на екрана, върху него се появява видимо изображение на обекта. След фокусиране веднага се прави снимка. Увеличението на крайното изображение на екрана се определя като произведението на увеличенията, дадени от обектива, междинните и проекционните лещи.

На електронно микроскопско изследване могат да бъдат подложени ултратънки срезове от различни тъкани, клетки, микроорганизми, както и цели бактериални клетки, вируси, фаги, както и субклетъчни култури, изолирани при разрушаването на клетките по различни начини.

Видове електронни микроскопи:

1) Трансмисионният електронен микроскоп (TEM) е устройство, при което изображение от ултратънък обект (с дебелина около 0,1 µm) се формира в резултат на взаимодействието на електронен лъч с пробата, последвано от увеличение с магнитни лещи ( обектив) и запис на флуоресцентен екран. За да регистрирате изображение, е възможно да използвате сензори, например CCD матрица. Първият практичен трансмисионен електронен микроскоп е създаден от Алберт Пребъс и Дж. Хилиър в Университета на Торонто (Канада) през 1938 г., използвайки концепция, предложена преди това от Макс Нол и Ернст Руска.

2) Сканиращият електронен микроскоп (SEM) е устройство, което ви позволява да получавате изображения на повърхността на пробата с висока разделителна способност (няколко нанометра). Редица допълнителни методи позволяват да се получи информация за химичния състав на приповърхностните слоеве;

3) Сканиращ тунелен микроскоп (STM, английски STM - сканиращ тунелен микроскоп) - устройство, предназначено за измерване на релефа на проводящи повърхности с висока пространствена разделителна способност. При STM остра метална игла се довежда до проба на разстояние няколко ангстрьома. Когато към иглата се приложи малък потенциал спрямо пробата, възниква тунелен ток. Големината на този ток зависи експоненциално от разстоянието проба-игла. Типичните стойности са 1-1000 pA на разстояния от около 1 Å.

Съвременните модели електронни микроскопи са проектирани по такъв начин, че комбинират възможностите както на трансмисионни, така и на сканиращи микроскопи и могат лесно да се преобразуват от един тип в друг.

Трансмисионната електронна микроскопия се използва за изследване на ултратънки срезове от микроби, тъкани, както и структурата на малки обекти (вируси, камшичета и др.), Контрастирани с фосфорволфрамова киселина, уранилацетат и отлагане на метал във вакуум. Сканиращата електронна микроскопия се използва за изследване на повърхността на обекти. С трансмисионната електронна микроскопия се получават планарни изображения на обект, а със сканиране е възможно да се получи триизмерно обемно изображение. В бактериологията сканирането е най-ефективно за идентифициране на процеси и други повърхностни структури, за определяне на формата и топографските връзки както в колониите, така и на повърхността на заразените тъкани.

При сканиращата микроскопия пробата се фиксира, изсушава на студено и се покрива под вакуум със злато или други тежки метали. По този начин се получава реплика (пръстов отпечатък), която следва контурите на пробата, която впоследствие се сканира.

Недостатъци на електронния микроскоп:

1) материалът, подготвен за изследване, трябва да е мъртъв, тъй като по време на процеса на наблюдение е във вакуум;

2) трудно е да се гарантира, че обектът възпроизвежда жива клетка във всичките й детайли, тъй като фиксирането и оцветяването на изследвания материал може да промени или увреди структурата му;

3) самият електронен микроскоп и поддръжката му са скъпи;

4) подготовката на материал за работа с микроскоп е трудоемка и изисква висококвалифициран персонал;