Ifa santrauka kokia analizė. Fermentinis imunologinis kraujo tyrimas: interpretacija, metodai. Vaizdo įrašas: šiuolaikinis fermentinis imunologinis tyrimas

Praktikoje dažniausiai naudojami trys kietosios fazės imunologinio tyrimo variantai – netiesioginis imuninis tyrimas, tiesioginis imuninis tyrimas ir sumuštinio tipo imunologinis tyrimas. Skirtumai tarp šių imunologinių tyrimų tipų yra tokie. Netiesioginėje imunologinio tyrimo versijoje pirmajame etape antigenas adsorbuojamas ant polistireno plokštelės šulinių paviršiaus. Pašalinus nesurištas antigeno molekules, pridedamas mėginys, kuriame yra tam antigenui specifinių antikūnų. Gauti antigeno-antikūno kompleksai aptinkami naudojant anti-rūšinius antikūnus, konjuguotus su bet kuria etikete (1A pav.). Tiesioginėje imunologinio tyrimo versijoje sorbuoto antigeno aptikimas atliekamas tiesiogiai naudojant specifinius antikūnus, konjuguotus su etikete (1B pav.). Atliekant sumuštinio tipo imuninį tyrimą, pirmajame etape ant plokštelės paviršiaus adsorbuojamas ne antigenas, o tiriamam antigenui specifiniai antikūnai (substrato antikūnai). Pašalinus nesurištas antikūnų molekules, pridedamas mėginys su antigenu. Norint aptikti susidariusį substrato antikūno-antigeno kompleksą, pridedami antrieji antikūnai, kurie yra specifiniai kitam, erdviškai nutolusiam, antigeno epitopui, konjuguotam su bet kuria etikete (1B pav.). Sumuštinio tipo imuninių antikūnų, specifinių dviem skirtingiems antigeno epitopams, naudojimas leidžia pasiekti aukštą jautrumą ir specifiškumą nustatant antigeną net ir tokiuose nevienalyčiuose mėginiuose kaip kraujo plazma.

Ryžiai. 1. Netiesioginio (A), tiesioginio (B) ir sumuštinio tipo imunologinio tyrimo (C) principas

Netiesioginis fermentų imunologinis tyrimas (netiesioginis ELISA)

Netiesioginiam imunologiniam tyrimui būdingas 3 etapų procesas, kurio pirmajame etape antigenas adsorbuojamas ant specialiai paruošto plastiko, antrajame etape jam būdingi antikūnai sąveikauja su antigenu, o trečiame etape antikūnai prieš rūšį. Konjuguoti su fermentu įvedami į sistemą, sukeldami indikatorinę fermentinę reakciją. Šioje technikoje krienų peroksidazė naudojama kaip fermentas. Reakcija vykdoma specialiose 96 šulinėlių plokštelėse.

I. Antigeno sorbcija

96 šulinėlių plokštelės, skirtos imuniniam tyrimui, šulinėliai sorbuoja 0,1–0,5 μg antigeno vienoje duobutėje 100 μl fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Inkubuojama 30 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo. Nesurištos antigeno molekulės nuplaunamos (2 kartus) fosfatiniu buferiniu tirpalu, kuriame yra 0,1 % Tween-20 (PBS).

II. Užraktas

Norint blokuoti nespecifines surišimo vietas, plokštelės šulinėliai užpildomi PBST ir inkubuojami 10-15 minučių kambario temperatūroje.

III. Specifinių antikūnų titravimas

Titruoti galima tiek horizontaliomis, tiek vertikaliomis tabletės eilėmis. Reikėtų pažymėti, kad antikūnų titravimas atliekamas, jei reikia parinkti optimalią antikūnų koncentraciją arba nustatyti titrą. Jei nustatoma optimali antikūnų koncentracija ir (arba) titras, naudojamas rekomenduojamas šių specifinių antikūnų praskiedimas.

Titruojant į pirmą eilės šulinėlį įpilamas paruoštas antikūnų skiedimas - vidutiniškai 1-10 μg į duobutę, tada šulinėliuose atliekamas nuoseklus antikūnų skiedimas. Inkubuojama su specifiniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo. Skalbimas atliekamas naudojant PBST 3 kartus.

IV. Anti-rūšinių antikūnų, konjuguotų su fermento žyme, pridėjimas

Anti-rūšiniai polikloniniai antikūnai, konjuguoti su krienų peroksidaze, naudojami kaip detektorius (antriniai) antikūnai. Dažniausiai naudojami ožkos arba triušio antikūnai, būdingi visai molekulei arba specifinių antikūnų Fc fragmentams. Detektoriaus antikūnų koncentraciją gamintojas paprastai nurodo kaip pradinio tirpalo praskiedimą (pavyzdžiui, 1:1000). Inkubuojama su antriniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo. Skalbimas atliekamas naudojant PBST 5-6 kartus.

Krienų peroksidazė katalizuoja substrato oksidacijos reakciją su vandenilio peroksidu. O-fenilendiaminas (OPD) naudojamas kaip krienų peroksidazės substratas. Dėl reakcijos susidaro spalvotas OPD oksidacijos produktas.

Substrato tirpalas: į 10 ml substrato buferio (0,1 M Na-citrato buferis, pH 4,5) įpilkite 0,01 ml 30% vandenilio peroksido ir 0,2 ml 50x OPD tirpalo (340 mg OPD 10 ml etilo alkoholio; laikyti – 20°C).

Inkubuojama 10 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

V. Fermentinės reakcijos stabdymas

VI. Optinio tankio matavimas

Tiesioginis fermentų imunologinis tyrimas (tiesioginis ELISA)

Tiesioginio imunologinio tyrimo metodas turi tik nežymius skirtumus, palyginti su netiesioginio imunologinio tyrimo metodu. Taigi I ir II etapai yra vienodi abiejų tipų analizėse. Skirtumas tas, kad tiesioginėje imunologinio tyrimo versijoje III stadijoje naudojami specifiniai antikūnai, konjuguoti su fermento žyme. Jei reikia, taip pat galima titruoti specifinius antikūnus, konjuguotus su fermento žyme, panašiai kaip anksčiau buvo aprašyta nekonjuguotų antikūnų atveju. IV etapas praleidžiamas, o kiti etapai (V-VII) atliekami panašiai kaip aprašyti aukščiau netiesioginei imunologinio tyrimo versijai.

Sumuštinio tipo imunologinis tyrimas

Ryžiai. 2. Scheminis sumuštinio tipo imunologinio tyrimo vaizdas. ATP – substrato antikūnas, ATD – detektoriaus antikūnas, AG – antigenas, M – žymė kovalentiškai surišta su detektoriaus antikūnu, P – substratas, ant kurio yra sorbuojamas substrato antikūnas.

Šioje imunologinio tyrimo versijoje (2 pav.) naudojama antikūnų pora, būdinga erdviškai nutolusiems tiriamo antigeno epitopams.

I. Substrato antikūnų sorbcija

Substrato antikūnai, 1–2 μg vienoje duobutėje, absorbuojami į 96 šulinėlių plokštelės šulinukus imuniniam tyrimui 100 μl fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Inkubuojama 30 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo. Nesurištos antigeno molekulės nuplaunamos (2 kartus) fosfatiniu buferiniu tirpalu, kuriame yra 0,1 % Tween-20 (PBS).

II. Užraktas

Norint blokuoti nespecifines surišimo vietas, plokštelės šulinėliai užpildomi PBST ir inkubuojami 10-15 minučių kambario temperatūroje.

III. Inkubavimas su antigenu

50 µl tiriamojo tirpalo arba standartinių antigeno skiedimų įpilama į plokštelės šulinukus su iš anksto adsorbuotais antikūnais. Antigenų skiedimai turi būti ruošiami naudojant PBST, nes Tween-20 sumažina nespecifinį baltymų molekulių jungimąsi tarpusavyje ir su plokštelės paviršiumi. Tiriamasis tirpalas ir standartiniai antigeno skiedimai pridedami poromis (arba 3 pakartojimais), naudojant dvi (tris) duobutes kiekvienam baltymo skiedimui. Inkubuojama kambario temperatūroje 30 minučių nuolat maišant. Skalbimas atliekamas PBST tirpalu 3 kartus.

IV. Inkubavimas su antikūnais, konjuguotais su fermento žyme

Į plokštelės duobutes įpilama 100 μl specifinių antikūnų, konjuguotų su fermento žyme, tirpalo. Optimalią konjuguotų antikūnų koncentraciją dažniausiai nurodo gamintojas (dažniausiai naudojama 2-4 μg/ml koncentracija). Inkubuojama su antikūnais, turinčiais fermento žymę, 30 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo. Skalbimas atliekamas naudojant PBST 5-6 kartus.

V. Fermentinės reakcijos, kurią lydi spalvoto produkto atsiradimas, vykdymas

Į duobutes įpilama 100 μl substrato tirpalo ir inkubuojama 10 minučių kambario temperatūroje, nuolat maišant.

VI. Fermentinės reakcijos sustabdymas

Prieš matuojant optinį tankį, spalvos reakcija sustabdoma naudojant 0,5 M H2SO4. Po inkubacijos į šulinėlius su OPD darbiniu tirpalu įpilama 50 μl 0,5 M sieros rūgšties tirpalo. Po to galite iš karto pradėti matuoti optinį tankį.

VII. Optinio tankio matavimas

Spalvoto produkto tirpalo optinis tankis matuojamas esant λ=490 nm, naudojant plokštelinį spektrofotometrą.

spausdinimo versija

Imunologinis tyrimas (ELISA)

Imunologinis tyrimas arba metodas (ELISA) — antigenų aptikimas naudojant atitinkamus antikūnus, konjuguotus su žymens fermentu (krienų peroksidaze, beta-galaktozidaze ir (arba) šarmine fosfataze). Sujungus antigeną su fermentu pažymėtu imuniniu serumu, į mišinį pridedamas substratas/chromogenas. Substratas skaidomas fermento ir pasikeičia reakcijos produkto spalva – spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.

Komponentai aptinkami pridedant pažymėtų antikūnų arba antigenų. Jei rezultatas teigiamas, chromogeno spalva pasikeičia.

Kietosios fazės netiesioginis su fermentais susijęs imunosorbento tyrimas

Kiekvieną kartą, pridėjus kitą komponentą, nesusieti reagentai pašalinami iš šulinių plaunant.
I. Nustatant antikūnus, paciento kraujo serumas, fermentu paženklintas antiglobulino serumas ir fermento substratas/chromogenas iš eilės įpilami į plokštelių su sorbuotu antigenu šulinėlius.

II. Nustatant antigeną, į duobutes su sorbuotais antikūnais (pavyzdžiui, kraujo serumas su norimu antigenu) įpilamas antigenas, prieš jį diagnostinis serumas ir antriniai antikūnai (prieš diagnostinį serumą), pažymėti fermentu, ir tada fermento substratas / chromogenas.

Konkurencinga ELISA antikūnų aptikimui: norimi antikūnai ir fermentu pažymėti antikūnai konkuruoja tarpusavyje dėl antigenų, adsorbuotų ant kietosios fazės.

Peroksidazės žymens nustatymas naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją. Greitų fermentų imunologinių tyrimų metodų, atliekamų naudojant nešiojamus prietaisus, kūrimas. Sinergija ir stiprinimo laipsnis. Šviesos spinduliavimo intensyvumas ir trukmė.

Su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas su padidinta chemiliuminescencija

ĮVADAS

Fermento žymenį galima kiekybiškai įvertinti naudojant įvairius metodus, pavyzdžiui, naudojant kolorimetriją, fluorimetriją, radiometriją ir potenciometriją.

Pastaruoju metu šiam tikslui pradėta naudoti ir chemiliuminescencija arba bioliuminescencija. Fermentų žymenys, kuriuos galima nustatyti naudojant reakcijas, lydimas šviesos emisijos, pateiktos lentelėje. 1. Apskritai chemikalų ir bioliuminescencinių aptikimo metodų jautrumas yra labai didelis, o jei taip pat naudojamas signalo stiprinimas iš fermentinės etiketės, atitinkamų imunologinių tyrimų metodų jautrumas turėtų būti ypač didelis.

Bioliuminescencinio metodo galimybės neseniai buvo pademonstruotos D-galaktozidazės nustatymo pavyzdžiu. Naudojant susietą galaktozės dehidrogenazės AOH:PMN oksidoreduktazės-bakterinės luciferazės reakciją, buvo galima aptikti 2 * 10″22 mol /3-galaktozidazės.

Krienų peroksidazė plačiai naudojama kaip etiketė su fermentais susietuose imunosorbentiniuose tyrimuose; konjugatų paruošimo ir stabilizavimo metodai, su kuriais buvo gerai ištirti.

Krienų peroksidazė dažniausiai nustatoma kolorimetriškai, tačiau tam gali būti naudojamos ir įvairios chemi- bei bioliuminescencinės reakcijos.

Išsamiai ištirtas peroksidazės nustatymas naudojant chemiliuminescencinę reakciją luminolio-vandenilio peroksido sistemoje, sustiprintoje fenolio junginiais.

Šis fermentų aktyvumo nustatymo metodas turi daug privalumų, palyginti su kitais nustatymo metodais; Pagrindinės jo charakteristikos pateiktos lentelėje. 2.

Stiprintuvai. Įvairūs junginiai, įskaitant 6-hidroksibenzotiazolus, tokius kaip liuciferinas, fenoliai, naftoliai ir aminai, turi galimybę sustiprinti šviesos emisiją luminalinės oksidacijos reakcijoje su vandenilio peroksidu, katalizuojamą peroksidazės.

Fig. 1 paveiksle pavaizduotos kiekvienos klasės medžiagų atstovų struktūros. Šviesos spinduliuotės stiprinimo laipsnis priklauso nuo reagentų koncentracijos. Tipiška liuminescencijos intensyvumo priklausomybė nuo stiprintuvo koncentracijos luminolio reakcijoje su vandenilio peroksidu, katalizuojama peroksidazės ir sustiprinta 6-hidroksi-benzotiazolu, parodyta Fig.

Sinergija ir stiprinimo laipsnis. Sistemoje peroksidazė - luminal - vandenilio peroksidas, mėlynas

rgizmas, kaip rodo lentelėje pateikti duomenys. 3. Sustiprinimo laipsnį įtakoja daug veiksnių; Nepaisant to, šviesos emisija padidėjo daugiau nei 500 kartų.

Esant tam tikriems stiprintuvams, foninės šviesos emisija luminolio-vandenilio peroksido sistemoje sumažėja. Nustatant peroksidazės aktyvumą, tai leidžia keliomis eilėmis padidinti signalo ir triukšmo santykį tik naudojant tokius stiprintuvus.

Padidėjusi liuminescencija būdinga įvairiems cikliniams diacilhidrazidams, kai jie veikiami oksiduojančiomis medžiagomis, esant peroksindazei. Kai kurių peroksidazės aktyvių medžiagų, pvz., hemoglobino, kuris katalizuoja tik kolorimetrines reakcijas, padidėjimas nepastebėtas.

Šis faktas rodo didesnį sustiprintos chemiliuminescencinės analizės specifiškumą, palyginti su kolorimetriniais metodais. Išspinduliuotos šviesos spektrai sustiprintoje ir nestiprintoje reakcijoje yra beveik vienodi. Tai „rodo, kad pats stiprintuvas neskleidžia šviesos.

Jei nėra stiprintuvų, chemiliuminescenciją peroksidazės-luminolio-peroksido sistemoje, matyt, riboja santykinai lėta vadinamojo II junginio pavidalo peroksindazės reakcija su luminoliu, dėl kurios susidaro luminolio radikalai ir peroksidazė atsinaujina.

Stiprintuvai, galintys greitai reaguoti su tokiu junginiu, gali padidinti šviesos emisiją, pagreitindami II junginio pavertimą aktyvia peroksidaze.

Tada stiprintuvo konversijos produktai gali greitai reaguoti su luminoliu, sudarydami papildomus luminolio radikalus ir taip dar labiau sustiprindami šviesos emisiją. Stiprintuvai taip pat gali būti nukreipti į neaktyvius peroksidazės tarpinius produktus™, tokius kaip III junginys.

Reagentai

Svarbus veiksnys nustatant peroksidazės aktyvumą naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją yra ciklinių diacilhidrazidų cheminis grynumas.

Įvairių luminolio mėginių tyrimas parodė, kad priemaišos neigiamai veikia šviesos emisiją. Dėl fotocheminių ir terminių procesų luminolis dalinai suyra, o susidarančios priemaišos veikia šviesos emisijos kinetiką ir intensyvumą.

Lentelėje 4 pateikiami kai kurių prekyboje esančių luminolio preparatų, taip pat luminolio natrio druskos, išgrynintos perkristalinant iš natrio hidroksido tirpalo, grynumo ir savybių palyginimo rezultatai.

2. PAGRINDINTAS CHEMILUMINESCENTINIS IMUNOTAS

Patobulintas chemiliuminescencinis imunologinis tyrimas su peroksidaze kaip fermento žyma buvo naudojamas daugeliui junginių nustatyti. Lentelėje pateikti keli pavyzdžiai. 5. Atliekant šiuos imunologinius tyrimus buvo naudojami konkurenciniai ir imuninių kompleksų ekstrahavimo metodai bei dažniausiai naudojamos kietosios atramos.

a Signalo ir fono santykis krienų peroksidazės, sustiprintos l-jodfenoliu, chemiliuminescenciniam nustatymui; 6 TLC – plonasluoksnė chromatografija.

ryžių. 3 paveiksle parodyta folikulus stimuliuojančio hormono nustatymo diagrama. Taikant šį metodą, FSH aptikimo riba mikrotitravimo plokštelėje yra apie 0,01 ppm. Metodas pasižymi puikiu atkuriamumu tiek per vieną tyrimą, tiek tarp tyrimų.

Patobulintas chemiliuminescencijos metodas taip pat buvo sėkmingai naudojamas peroksidazės žymenims aptikti DNR hibridizacijos tyrimuose.

FLUORESCING ANTIKŪNU METODAS (FFA).

kiekybinio nustatymo metodas naudojant plokštelinį fotometrą ir kokybinė analizė naudojant fotografinį aptikimą kelių pikogramų jautrumu.

Prietaisai

Šiuo metu pramonė gamina kelių tipų luminometrus, tinkamus sustiprintos chemiliuminescencijos reakcijose skleidžiamai šviesai matuoti.

Kai kurie iš šių liuminometrų buvo modifikuoti specialiai siekiant pagerinti chemiliuminescencijos analizę. Šviesos spinduliuotės intensyvumas ir trukmė liuminescencijos stiprinimo reakcijose palengvino paprastų luminometrų, kuriuose kaip detektoriai naudoja silicio fotodiodus arba didelės spartos fotografinę plėvelę, sukūrimą.

Tokie liuminometrai yra palyginti nebrangūs, nešiojami, todėl gali būti naudojami ne laboratorijose. Šiuo metu MAST Immunosystems gamina specialias kameras, skirtas alergenui specifinio imunoglobulino E chemiliuminescenciniam aptikimui ELISA metodu. Galima daryti prielaidą, kad ateityje bus kuriami rinkiniai su ELISA ir kitų junginių rezultatų fotografiniu fiksavimu, kurių nustatymas turi būti atlikti klinikose, ligoninėse ar namuose.

Pagaminti instrumentai ir reagentų rinkiniai.

Patobulintus chemiliuminescencinius fermentų imunologinio tyrimo rinkinius ir susijusius instrumentus dabar Amersham International parduoda pavadinimu Amerlite.

Analizė atliekama ant baltų mikrotitravimo plokštelių juostelių, o liuminescencijos matavimai greitai ir automatiškai atliekami specialiu mikroplokštelės luminometru.

Šiuo metu gaminami rinkiniai skydliaukę stimuliuojančiam hormonui, žmogaus choriogonadotropinui, karcinoembrioniniam antigenui, alfa-fetoproteinui, tiroksinui, trijodtironinui nustatyti ir laisvojo tiroksino indeksui nustatyti. Šie tyrimai pasižymi dideliu jautrumu ir puikiu atkuriamumu.

IŠVADOS

Peroksidazės žymens nustatymas naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją yra labai jautrus, specifiškas ir paprastas ir gali būti naudojamas kaip pagrindas patogiems ir greitiems su fermentais susieto imunosorbento tyrimo metodams, atliekamiems naudojant nebrangius nešiojamus prietaisus, sukurti.

Fermentinio imunologinio tyrimo principai, pagrindiniai ELISA tipai, taikymas diagnostikoje

Imunologinio tyrimo metodai medicinos praktikoje, antigeno ir antikūno sąveika jos pagrindu.

Imunologinio tyrimo tipai priklausomai nuo etiketės tipo ir tyrimo sąlygų. Fermentiniame imuniniame tyrime naudojamų komponentų charakteristikos.

santrauka, pridėta 2011-11-07

Serologinės reakcijos

Serologinės reakcijos kaip reakcijos tarp antigenų ir antikūnų in vitro.

Serologinių reakcijų klasifikavimas pagal antigeno pobūdį ir fizinę būklę. Gelio nusodinimo reakcija pagal Ouchterlony. Fermento imunologinis tyrimas Mctode.

pristatymas, pridėtas 2015-06-03

Elektrokardiogramos spektrinė analizė

Priemonės elektrokardiogramoms įrašyti ir analizuoti. Analoginio ir skaitmeninio signalo apdorojimo palyginimas.

Elektrokardiografinių signalų, gautų naudojant itin didelės raiškos elektrokardiografą, tyrimas. Analizės galimybės naudojant MatLab paketą.

santrauka, pridėta 2011-12-09

Radiacijos taikymas medicinoje

Bronchinės astmos gydymas infraraudonaisiais spinduliais. Dirbtiniai ultravioletinės (UV) spinduliuotės šaltiniai medicinoje. Ozono ir beozono baktericidinės lempos.

Geriamojo vandens dezinfekcija UV spinduliuote. Rentgeno diagnostika, prietaisų projektavimas.

santrauka, pridėta 2009-08-27

Akromegalija

Akromegalija yra liga, susijusi su padidėjusia augimo hormono (somatotropinio hormono) gamyba. Klinikinis ligos vaizdas. Būdingas laboratorinis akromegalijos rodiklis diagnozės metu. Tyrimas su tirotropiną atpalaiduojančiu hormonu. Gydymas rentgenu.

pristatymas, pridėtas 2012-05-03

Naviko žymenys klinikinėje praktikoje

Laboratorinės analizės panaudojimas vėžio diagnostikai ir pooperaciniam operacijos bei chemoterapijos efektyvumo stebėjimui.

Naviko žymenų nustatymas naudojant fermentinį imunologinį, imunoliuminescencinį ir radioimunologinį tyrimą.

santrauka, pridėta 2010-10-09

Fizikiniai-cheminiai vaistų analizės metodai

Fizikinių ir cheminių analizės metodų klasifikacija. Molekulinės sugerties spektrinė analizė. Radiacijos sugerties dėsniai. Vizuali kolorimetrija. Koncentracijos nustatymas fotoelektrokolorimetrijoje. Vaistų spektrofotometrija.

santrauka, pridėta 2010-11-14

Pagrindinės aktyvintos chemiliuminescencijos taikymo sritys

Reakcijų mechanizmas, kurį lydi gyvų organizmų švytėjimas, matomas plika akimi.

Aktyvintos chemiliuminescencijos ir bioliuminescencijos, kaip priemonės, panaudojimas atliekant biomedicininius kraujo serumo, šlapimo, smegenų skysčio ir seilių tyrimus.

kursinis darbas, pridėtas 2011-10-25

Šiuolaikiniai infekcinių ligų diagnostikos metodai

Gyvūnų užkrečiamųjų ligų diagnostikos metodai.

Polimerazės grandininė reakcija. Fermentinis imunologinis tyrimas ir jo tikslai. Stafilokokų, pneumokokų ir salmonelių sukeltų infekcijų diagnostika. Bruceliozės sukėlėjas, jos diagnostika.

santrauka, pridėta 2013-12-26

Liuminescencinės etiketės

Liuminescencijos samprata, jos fizinė prigimtis ir atsiradimo priežastys.

Stokso taisyklė. Liuminescencijos rūšys (fotoliuminescencija, chemiliuminescencija) ir jos išeiga. Pagrindiniai šiluminės spinduliuotės dėsniai. Liuminescencinė, kokybinė ir kiekybinė medžiagų analizė.

pristatymas, pridėtas 2016-05-05

Širdies išemija

1.1 IŠL klasifikacija

IŠL apima keletą ligų, kurios labai skiriasi klinikinėmis apraiškomis.

Lėtinio pulpito klinika: fibrozinis, hipertrofinis, gangreninis

klasifikacija

Ūminis pulpitas pulpos hiperemija serozinis ribotas serozinis difuzinis pūlingas trauminis Lėtinis pulpitas pluoštinis gangreninis hipertrofinis (proliferacinis) Lėtinio pulpito paūmėjimas Lėtinis…

Laktacijos mastitas

4.

klasifikacija

Chirurginė mastito klasifikacija: I. Dėl ligos: 1. Nespecifinis. 2. Specifinis. II. Pagal krūties funkcinę būklę: 1. Laktacija.

Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA)

2. Nelaktacinė. III. Pagal uždegiminio proceso eigą: 1. Ūminis. 2. Lėtinis. IV...

Vaistiniai augalai ir vaistinės augalinės žaliavos, naudojamos medicinoje nuo šlapimo pūslės akmenligės

1.1 Klasifikacija

Urolitiazė gali būti klasifikuojama pagal akmenų lokalizaciją: inkstų ir šlapimtakio akmenys (nefroureterolitiazė), šlapimo pūslės akmenligė. Galima suskirstyti urolitiazę pagal akmenų sudėtį...

Gerklų vėžys

3.

klasifikacija

Pagal buitinę gerklų vėžio klasifikaciją (Sveikatos apsaugos ministerijos nurodymų rinkinys) yra 4 stadijos: I stadija: auglys užima tik vieną gerklų dalį ir neprasiskverbia giliau už poodinį sluoksnį...

Pūslės vėžys

2. Klasifikacija

Šlapimo pūslės neoplazmai dažniausiai pasireiškia pereinamojo laikotarpio ląstelių karcinoma.

Tačiau norėdami išvengti diagnostinių klaidų, turime nepamiršti, kad...

Stemplės karcinoma

klasifikacija

Tarptautinė histologinė stemplės navikų klasifikacija (1990): epitelio navikai. Gerybiniai navikai. Plokščialąstelinė papiloma. Virusinė karpa. Adenoma. Piktybiniai navikai.

Suragėjusių ląstelių karcinoma...

Žaizdos, žaizdų klasifikacija, mechaninis antisepsis gydant žaizdas

Žaizdų klasifikacija

Yra keletas žaizdų klasifikacijų. Pagal audinių pažeidimo pobūdį išskiriamos žaizdos: pradurtos, pjaustytos, kapotos, sumuštos, suplėšytos, sukandusios, apsinuodijusios, šautinės. Pradurtos žaizdos daromos veriamuoju ginklu (durtuvu, adata ir kt.)...

Augaliniai tanino šaltiniai ir jų panaudojimas medicinoje

2.

klasifikacija

Visi taninai skirstomi į taninus: hidrolizuojamus ir kondensuotus. Hidrolizuoti taninai, veikiami praskiestų mineralinių rūgščių, bazių ir tanino acilo hidrolazės fermentų, skyla į angliavandenius ir fenolkarboksirūgštis...

Vaikų, sergančių cerebriniu paralyžiumi, reabilitacija

1.2 Cerebrinio paralyžiaus klasifikacija.

Šiuo metu Rusijos Federacijoje naudojama K.A. klasifikacija.

Semenova (1974). - spazminė diplegija - daugiausia pažeidžiamos kojos - dviguba hemiplegija - spastinė tetraparezė, šiek tiek labiau pažeidžiamos rankos...

Reumatoidinis poliartritas

1. Klasifikacija

Reumatoidinis artritas dešimtmečius išliko reumatologijos mokslo dėmesio centre, o tai atspindi didelę ligos reikšmę bendrosios medicinos ir socialiniu požiūriu...

Nemedikamentinio bronchinės astmos gydymo vaidmuo

1.1.1 Klasifikacija

Bronchinė astma (BA) skirstoma į paūmėjimo (ligos aukščio) ir remisijos fazę (kai ligos požymių praktiškai nėra).

Astmos priepuolio metu yra įspėjamųjų požymių periodas (čiaudulys, sloga ir kt.).

Paramediko vaidmuo diagnozuojant, gydant ir profilaktikai stabligę. Kovos su epidemijomis priemonės infekcinių ligų protrūkio metu. Stabligės ligų dinamika ir lyginamoji analizė Salsko srityje 2013-2014 m.

1.4 Klasifikacija

Klasifikavimo charakteristikose atsižvelgiama į įvairius veiksnius – infekcijos mechanizmą, konvulsinio sindromo paplitimą ir sunkumą bei klinikinės eigos ypatybes.

Atsižvelgiant į šiuos veiksnius, išskiriamos šios stabligės formos: 1...

Paramediko vaidmuo organizuojant ir vykdant diagnostines, terapines ir prevencines priemones kovojant su hipertenzija

1.2 Klasifikacija

Per visą ligos tyrimo laikotarpį buvo sukurta ne viena hipertenzijos klasifikacija: pagal paciento išvaizdą, slėgio padidėjimo priežastis, etiologiją, slėgio lygį ir jo stabilumą, organų pažeidimo laipsnį. , kurso pobūdis...

Diabetas

1.1 Klasifikacija

Yra keli cukrinio diabeto klasifikavimo tipai, kurie priklauso nuo klinikinio vaizdo, etiologijos, angliavandenių apykaitos kompensavimo laipsnio, gydymo sunkumo, komplikacijų.

Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA)– modernus laboratorinis tyrimas, kurio metu kraujyje ieškoma specifinių antikūnų ar specifinių ligų antigenų, siekiant nustatyti ne tik etiologiją, bet ir ligos stadiją.

ELISA rezultatai gali būti pateikti kokybiškai ir kiekybiškai.

Šiuo metu ELISA yra naudojamas šiose situacijose:

1) Ieškoti specifinių antikūnų prieš bet kurią infekcinę ligą;
2) bet kokių ligų (infekcinių, venerologinių) antigenų paieška;
3) paciento hormoninės būklės tyrimas;
4) naviko žymenų tyrimas;
5) tyrimas dėl autoimuninių ligų buvimo.

ELISA metodo privalumai:

1) Didelis ELISA metodo specifiškumas ir jautrumas (daugiau nei 90%).
2) Gebėjimas nustatyti ligą ir sekti proceso dinamiką, tai yra lyginti antikūnų skaičių skirtingais laikotarpiais.
3) ELISA diagnostikos prieinamumas bet kurioje gydymo įstaigoje.

Santykinis trūkumas:

1) Imuninio atsako (antikūnų), bet ne paties patogeno, nustatymas.

Pagrindinės sąvokos

Prieš išsiaiškindami ELISA metodo esmę, trumpai supraskime kai kurias sąvokas.
Antikūnai (arba imunoglobulinai – Ig)- specifiniai baltymai, kuriuos gamina B
limfocitai (imuninės ląstelės), reaguojant į bet kokio infekcinio patogeno (virusų, bakterijų, grybelių ir kt.) patekimą į organizmą.

Yra imunoglobulinai A (IgA), imunoglobulinai E (IgE), imunoglobulinai M (IgM), imunoglobulinai G (IgG), imunoglobulinai D (IgD). Jie skiriasi vienas nuo kito molekuline forma ir svoriu, pusinės eliminacijos periodu, dalyvavimu/nedalyvavimu infekciniuose procesuose ir aptikimo laiku nuo užsikrėtimo momento. Jei atsižvelgsime į molekulinę masę, tai IgM turi didžiausią svorį - tai yra pentameras (950 000 daltonų), priešingai nei kiti Ig (nuo 150 iki 200 000 Da), dėl kurių IgM tiesiog negali praeiti pro placentos barjerą.

Todėl IgM aptikimas 1 metų vaikui visada yra infekcijos požymis vaisiui. Kraujo serume didžiąją imunoglobulinų dalį sudaro IgG (75–85%), o mažiausią – IgE (0,003%). Infekciniame procese tiesiogiai dalyvauja tik IgA, M, G. IgE yra alerginių reakcijų ir ligų požymis, o IgD galima rasti tik limfmazgių ir tonzilių audinyje ir vaidina vietinio imuniteto formavimąsi.

Imunoglobulino klasės

Antigenai– organinės kilmės didelės molekulinės medžiagos, ypač infekcinių ir kitų ligų sukėlėjai, taip pat įvairių pakitusių ląstelių medžiagos, susidarančios tam tikros ligos metu (autoimuninės ligos, onkologijos).

Imuninis kompleksas– antigeno-antikūnų kompleksas, dalyvaujantis imuniniame procese.

Kuo pagrįstas ELISA metodas?

Yra keletas ELISA tipų (tiesioginis, netiesioginis, blokuojantis metodas, konkurencinis), tačiau praktikoje dažniausiai naudojamas heterogeninis kietosios fazės imunologinis tyrimas arba ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

Fermentinio imunologinio tyrimo pagrindas – antigeno ir antikūno imuninė reakcija, susidarant imuniniam kompleksui: antigenui-antikūnui, dėl kurio pasikeičia specifinių žymių antikūnų paviršiuje fermentinis aktyvumas.

ELISA metodo esmė

Paprastais žodžiais tariant, šį procesą galima suskirstyti į kelis etapus:

1) Tyrimą atliekančio gydytojo tabletės šulinėlių paviršiuje yra išgrynintas tam tikro patogeno antigenas.

Pridėjus biologinės medžiagos (kraujo serumo) iš paciento, tarp šio antigeno ir norimo antikūno (imunoglobulino) įvyksta specifinė reakcija. Šis junginys kitame etape veiks kaip „specialus antigenas“.

2) Šiame etape susidaro IC (imuniniai kompleksai) - reakcija tarp „specialaus antigeno“ ir konjugato (tai imunoglobulinas, pažymėtas fermentu peroksidaze). Pridedamas specialus chromogenas. Šios fermentinės reakcijos rezultatas yra spalvotos medžiagos susidarymas tabletės duobutėje, kurios spalvos intensyvumas priklauso nuo imunoglobulinų (antikūnų) kiekio paciento medžiagoje.

3) Toliau vertinamas rezultatas: fotometrija naudojant daugiakanalį spektrofotometrą, tiriamos medžiagos optinio tankio palyginimas su kontrolinių mėginių optiniu tankiu, matematinis rezultatų apdorojimas.

Antikūnų kiekis paciente tiesiogiai priklauso nuo tam tikros duobutės optinio tankio aukščio.

Paprastai praktikoje naudojamos 96 šulinėlių plokštelės.

Matuojant tiriamojo skysčio optinį tankį (OD), apskaičiuojamas antikūnų kiekis (arba koncentracija) tam tikrame tūrio vienete.

Tada rezultatas lyginamas su kontroliniu mėginiu.

Reikia prisiminti: Kiekvienai bandymų sistemai sukuriami individualūs rodikliai rezultatams fiksuoti, normalumo ir patologijos rodikliai (tai yra „atskaitos vertės“). Į tai reikia atsižvelgti vertinant kiekvieno konkretaus tyrimo rezultatus. Neteisinga vienos laboratorijos rezultatus interpretuoti remiantis kitos laboratorijos „etaloninėmis vertėmis“.

Taip pat neteisinga lyginti skirtingų laboratorijų rezultatus tarpusavyje.

Atliekant ELISA reakcijas, svarbi ir antikūnų avidiškumo samprata.
Antikūnų avidiškumas- tai antikūno ir antigeno ryšio stiprumas ir antigeno kiekis, susijęs su imunoglobulinais (antikūnais).

Avidumas turi didelę reikšmę vertinant numatomą užsikrėtimo trukmę, o tai itin svarbu diagnozuojant pirminę infekciją nėščioms moterims.

Antikūnų avidiškumo tyrimo pagrindas yra imuninio komplekso (antigeno-antikūno) apdorojimas karbamido tirpalu, siekiant sunaikinti baltymą.

Didelio avidiškumo ryšiai lieka nepažeisti, o mažo avidiškumo ryšiai sunaikinami. Rezultatas pateikiamas kaip avidiškumo indeksas, išreikštas procentais (%).

Kokios ligos nustatomos naudojant ELISA diagnostiką?

Autoimuninių ligų žymenys ir žmogaus imuniteto rodikliai (bendras IgE, bendras IgG, bendras IgA, bendras IgM, bendras IgD, sekrecinis IgA, IgG 2, IgG4, CEC cirkuliuojantys imuniniai kompleksai, IgA ir IgG į gliadiną ir kt.)

3. Onkologiniai žymenys (TNF – naviko nekrozės faktorius, CEA – karcinoembrioninis antigenas, PSA – prostatos specifinis antigenas, hCG – žmogaus chorioninis gonadotropinas, CA 125, alveomucinas ir daugelis kitų)

Reprodukciniai sutrikimai (estradiolis, progesteronas, prolaktinas, testosteronas, AFP-alfafetoproteinas, FSH - folikulus stimuliuojantis hormonas ir kt.)

5. Skydliaukės ligos (laisvas ir surištas T3, T4, tiroglobulinas, skydliaukės peroksidazė – TPO, skydliaukę stimuliuojantis hormonas – TSH).

Šiame sąraše nėra visų ligų, kurios diagnozuojamos naudojant fermentų imunologinį tyrimą.

Medžiaga ELISA analizei ir jos rinkimo taisyklės

Dažniausia medžiaga ELISA reakcijai atlikti yra paciento kraujo serumas, paimtas tuščiu skrandžiu.

Medžiaga taip pat gali būti smegenų skystis, vaisiaus vandenys, stiklakūnio turinys, gimdos kaklelio kanalo ir šlaplės gleivės, tepinėliai.

Pacientų paruošimas pateikti medžiagą ELISA tyrimui

Kraujas imamas tuščiu skrandžiu. Prieš duodami kraujo nereikia vartoti jokių vaistų.

Medžiagos fermentinis imunologinis tyrimas atliekamas greitai, per 24 valandas.

Skirtingose ​​laboratorijose gali atsirasti delsų dėl tam tikro serumo kiekio susikaupimo.

Galimi ELISA diagnostikos rezultatai

Vertinant konkrečių infekcijų rezultatus, svarbi aptiktų antikūnų klasė ir jų kiekis.

Ne tik infekcijos etiologijos klausimas (ar ji egzistuoja, ar ne), bet ir numatoma ligos stadija (ūminė, lėtinė), taip pat aktyvios infekcijos buvimas (ūminis ar lėtinės paūmėjimas) Nuo to priklauso tyrimo laikas.

Koks yra apytikslis antikūnų (imunoglobulinų – Ig) atsiradimo laikas?

Pirmieji antikūnai yra IgM.

Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA)

Jas galima aptikti praėjus 1-3 savaitėms po galimo užsikrėtimo, kuris apibūdina ūminę infekcinio proceso fazę. Antroji IgM antikūnų atsiradimo situacija yra lėtinio proceso suaktyvėjimas (arba paūmėjimas). IgM antikūnai cirkuliuoja vidutiniškai apie 3 mėnesius, vėliau jų skaičius palaipsniui nyksta. Tačiau kai kuriems pacientams IgM pėdsakus galima aptikti per 1–2 metus po užsikrėtimo.

Šiuolaikinės testų sistemos yra labai jautrios, todėl gaunami nespecifiniai klaidingai teigiami rezultatai (dažnai nėščioms moterims).

Todėl šioje pacientų grupėje turi būti pakartotinai patikrintas teigiamas IgM!

IgA antikūnai atsiranda praėjus 2-4 savaitėms po užsikrėtimo, tačiau jų pakanka aptikti per mėnesį. Serumo IgA sintetina blužnies, limfmazgių ir gleivinių plazminės ląstelės Sekretorinis IgA koncentruojasi ant gleivinės, kad atliktų savo apsauginę funkciją – dalyvauja vietiniame imunitete.

Nuo 4 savaitės po užsikrėtimo pradeda atsirasti IgG antikūnų.

Sergant daugeliu infekcijų, jų titras laipsniškai didėja maksimaliai skirtingu metu (vidutiniškai po 1,5-2 mėnesių), tada titras išlieka žemas ir rodo imunitetą. Sergant kai kuriomis ligomis (mikoplazmoze, chlamidijomis, trichomonoze) IgG lygis nėra didelis ir labai sumažėja dėl imuniteto stokos šioms infekcijoms.

Skirtingų klasių antikūnų aptikimo parinktys:

— Atskirai aptikti IgM antikūnai rodo pirminį antikūnų buvimą
infekcija.
— Vienalaikis IgM ir IgG nustatymas kraujyje būdingas pirminei infekcijai
per pastaruosius 2-3 mėnesius, taip pat lėtinės ligos paūmėjimo metu.

Todėl nėštumo metu IgM buvimas ne visada yra pirminės infekcijos požymis.
- Išskirto IgG aptikimas gali rodyti imunitetą šiai ligai,
taip pat dėl ​​lėtinės infekcijos. Antroje situacijoje svarbus ir antikūnų kiekis (titras), ir šio titro pokytis laikui bėgant. Paprastai tyrimai atliekami kas 2-4-6 savaites.
— IgA aptikimas izoliuoto arba su IgM rodo pirminę infekciją. At
IgA atsiradimas kartu su IgG rodo lėtinės infekcijos suaktyvėjimą (vidutiniškai 2 savaites nuo paūmėjimo momento).

IgG antikūnų avidiškumo nustatymas yra puikus papildomas žingsnis diagnozuojant pirminę infekciją nuo ilgalaikės infekcijos, kuri turi savo klinikinę reikšmę, visų pirma, vertinant vaisiaus intrauterinės infekcijos riziką.

Mažo avidiškumo IgG nustatymas rodo pirminę infekciją ir nustatomas vidutiniškai 4-6 mėnesius po užsikrėtimo, retai ilgiau. Mažo avidiškumo IgG reikalingas kitas laboratorinis pirminės infekcijos (IgM) patvirtinimas.

Didelio avidiškumo antikūnai yra arba lėtinės ligos ir jos paūmėjimo, arba susiformavusio imuniteto požymis.

Kūdikių savybės: vaikams iki vienerių metų, o kartais net 1,5 metų, motinos IgG nuo įvairių infekcijų cirkuliuoja kraujyje (tai yra, jie prasiskverbė per placentą iš motinos į vaisius intrauterinio vystymosi metu).

Jie patys savaime nėra infekcijos buvimo šiuo metu požymis. Jei IgM aptinkamas šiame amžiuje (atminkite, kad motinos IgM negali prasiskverbti pro placentą), tai yra intrauterinės infekcijos arba po gimdymo įgytos infekcijos požymis.

Kiekybinis ELISA metodas

ELISA diagnostikos (naudojant fermentų imuninės analizės analizatorių) rezultatas pateikiamas tam tikrais matavimo vienetais:
— Mėginio optinis tankis (OD) – specifinių antikūnų koncentracija tūrio vienete.

Kuo didesnis mėginio OD, tuo didesnė antikūnų koncentracija. Kai kurie rezultatai nurodo teigiamumo koeficientą (CP), kuris taip pat yra mėginio optinis tankis.
— Antikūnų koncentracijos vienetai (nanograma/ml arba ng/ml).

— Serumo titrų pavidalu: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 ir pan. Diagnostiniai titrai (pagal kuriuos nustatoma ligos diagnozė, o ne infekcijos faktas) skirtingoms ligoms yra skirtingi.
— Simbolių pavidalu – „+“, „-“, „? (+, ++, +++, ++++).
— Kokybinio įvertinimo forma pagal tam tikrą kriterijų (teigiamas arba neigiamas).

Tik gydytojas gali teisingai įvertinti antikūnų skaičių, imunoglobulinų klasės aptikimo galimybę, taigi ir nustatyti ligos stadiją bei gydymo poreikį.

Nereikia pamiršti, kad bet kuriai testų sistemai sukuriamos savo „referencinės vertės“ (normos variantai), o viršijus diagnozuojama konkreti liga (patologijos variantai).

Skirtingoms bandymų sistemoms „atskaitos vertės“ skiriasi.

Teisingai palyginti laikui bėgant gautus ELISA rezultatus galima tik tuo atveju, jei jie buvo gauti toje pačioje laboratorijoje.

Infekcinių ligų gydytoja N.I. Bykova

ELISA analizė (fermentinis imunosorbentinis tyrimas) yra moderni diagnostinė procedūra, kuria siekiama nustatyti specifinius antikūnus kraujyje prieš daugelio ligų sukėlėjus, nustatyti patologijos vystymosi stadiją ir jos etiologiją. Jis naudojamas kaip gydymo proceso ir jo veiksmingumo stebėjimo metodas. Tyrimo proceso metu analizuojami kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai.

ELISA metodas yra labai informatyvus, jo rezultatų tikslumas siekia daugiau nei 96%. Diagnostika yra prieinama beveik bet kurioje laboratorijoje ir medicinos įstaigoje.

Pagrindinės indikacijos

Siekiant patvirtinti lytiškai plintančių infekcinių ligų buvimą, skiriamas fermentinis imunologinis tyrimas:

• trichomonozė;
• chlamidija;
• ureaplazmozė;
• sifilis ir kt.

ELISA taip pat naudojama virusinėms ligoms diagnozuoti:

• pūslelinė;
• 4 tipo herpesas (Epstein-Barr virusas);
• virusinis hepatitas;
• citomegalovirusinė infekcija.

Kaip pasiruošti tyrimui

Biologinė medžiaga tyrimams yra kraujas. Likus kelioms dienoms iki tyrimo, neturėtumėte vartoti vaistų. Antibiotikų, antihelmintikų ir antivirusinių vaistų vartojimas nutraukiamas per 14 dienų.

Medžiaga surenkama ryte tuščiu skrandžiu. Likus valandai iki procedūros, leidžiama išgerti stiklinę negazuoto vandens; maistas neįtraukiamas.

Analizės ypatybės

Tyrimui atlikti imamas ne mažesnis kaip 5 ml veninio kraujo. Kai kuriais atvejais kaip biomedžiaga naudojamas smegenų skystis, amniono skystis arba stiklakūnio turinys.

Siekiant išvengti klaidingų teigiamų rezultatų, kraujo mėginiai imami naudojant adatą, griežtai tuščiu skrandžiu. Jūs turite mesti rūkyti ir gerti alkoholinius gėrimus prieš 12 valandų. Vartojant narkotines medžiagas, analizės rezultatai iškreipiami.

Jei išvada rodo neigiamas imunoglobulinų G, A, M vertes, tai rodo pradinį patologinio proceso vystymosi etapą arba jo nebuvimą. Šis rezultatas registruojamas visiškai pasveikus po gydymo.

Neigiamas IgM ir IgA bei teigiamas IgG rezultatas rodo imuniteto susiformavimą po infekcinės ligos ar vakcinacijos.

Teigiamas IgM rezultatas ir neigiamas arba teigiamas IgG, IgA rezultatas rodo ūminės infekcinės patologijos buvimą.

ELISA analizė atliekama gana greitai, rezultatai paruošiami per dieną po medžiagos surinkimo.

Turinys

Norint įvertinti organizmo gebėjimą atsispirti infekcinėms ligoms ar nustatyti patologijos fazę, naudojamas kraujo tyrimas. Svarbią vietą tarp laboratorinių tyrimų užima ELISA metodas, padedantis visapusiškai ištirti apsauginės kraujo funkcijos veiklą, nustatyti imunodeficitą sergant infekcinėmis ligomis, kraujo negalavimus, hormoninius, autoimuninius procesus.

Kas yra fermento imunologinis kraujo tyrimas?

Šis metodas taikomas laboratoriniams tyrimams, kuriais nustatomas apsauginių baltyminio pobūdžio kraujo faktorių (antikūnų) buvimas tam tikriems patogeniniams veiksniams (antigenams). Su fermentais susietas imunosorbentas aptinka imunoglobulinus, kuriuos galima rasti imunokompleksų pavidalu. Jie atsiranda, kai įvyksta sudėtingos žmogaus imuninės gynybos neurohumoralinės reakcijos, kurios tampa atsaku į svetimų antigenų patekimą.

Kūnas gamina specifinius antikūnus prieš kiekvieną patogeno tipą. Toliau patologinis mikroorganizmas arba antigenas jungiasi ir susidaro kompleksinis „antigeno-antikūno“ junginys. Tada jis neutralizuojamas, vyksta fermentinė lizė, fagocitozės reakcija, o procesas baigiasi pašalinimu iš organizmo. Konkrečių kompleksų, nustatytų ELISA metodu, buvimas rodo paciento patogeno ar kenksmingos medžiagos tipą.

Imunoglobulino klasės

Mokslininkai atrado ir ištyrė 5 imunoglobulinų tipus: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA.. Yra ir kitų klasių, tačiau jos vis dar tiriamos, o jų vaidmuo nėra iki galo suprantamas. Praktinėje medicinoje svarbūs A, M, G. Informacijos turinys ir nustatymo tikslumas grindžiamas laiko intervalais, per kuriuos jie atsiranda, pasiekia maksimumą ir išnyksta.

Indikacijos kraujo tyrimui naudojant ELISA

Naudodamiesi šia analize galite įvertinti gydymo efektyvumą, atlikti išsamų tyrimą prieš transplantacijos operacijas, nustatyti imunodeficito būklę ir antikūnus prieš daugiau nei 600 rūšių alergenų. Kraujo tyrimas naudojant ELISA yra naudojamas kaip papildomas būdas aptikti vėžines ląsteles. Analizė skiriama, jei reikia nustatyti antikūnus prieš mikrobus, kurie provokuoja lytiniu keliu plintančias patologijas:

• trichomonozė;
• sifilis;
• toksoplazmozė;
• mikoplazmozė;
• ureaplazmozė.

Esant helmintų invazijai, ELISA analizė parodys padidėjusį imunoglobulinų kiekį. Atliekami tyrimai, siekiant patvirtinti, ar pacientas turi:

• Epstein-Barr virusas;
• herpetinės infekcijos;
• citomegalovirusas;
• virusinio hepatito grupė.

Kraujo tyrimas ELISA metodu

Fermentinis imunologinis kraujo tyrimas nėra vienintelis būdas nustatyti imunoglobulinus. Kartais šiam tyrimui renkamas smegenų skystis, stiklakūnis ir amniono skystis. Naudojant kraują, jis paimamas iš priešakinės venos naudojant injekcinę adatą. Tyrimas turi būti atliekamas tuščiu skrandžiu, prieš ELISA nerekomenduojama vartoti vaistų, kurie gali turėti įtakos rezultatui. Prieš dovanodami biomedžiagą, turėtumėte atsisakyti alkoholio, rūkymo ir narkotikų vartojimo. Testo rezultatų parinktys:

1. Jei imunoglobulinai IgG, IgM, IgA yra neigiami, gydytojai sako, kad nėra patologijos ar pradinės stadijos. Toks pat rezultatas (neigiamas) bus po visiško atsigavimo po ilgo laikotarpio.
2. Jei IgG teigiamas, bet IgM ir IgA neaptikta, tai rodo imuniteto susiformavimą po vakcinacijos arba infekcinę ligą.
3. Esant dideliems IgM ir neigiamiems IgA, IgG titrai, diagnozuojama ūminė infekcinė liga.
4. Jei IgG, IgM, IgA yra teigiami, gydytojai kalba apie ūminę esamos lėtinės ligos atkryčio fazę.
5. Lėtinės infekcijos, kuri yra aprimimo (remisijos) stadijoje, ELISA testas rodo neigiamus IgM titrus, o IgA ir IgG bus teigiami.

ELISA analizės privalumai ir trūkumai

Pagrindinis neigiamas šio tyrimo aspektas yra galimybė gauti klaidingai teigiamų arba klaidingai neigiamų rezultatų. Nepatikimumo priežastis – vaistų vartojimas ir techniniai defektai laboratorijoje. Metabolizmo sutrikimų procesas organizme gali suklastoti analizę. Pagrindiniai ELISA analizės pranašumai yra šie:

• tikslumas, diagnostinis specifiškumas;
• maža analizės kaina;
• rezultatų gavimo greitis;
• galimybė dinamiškai stebėti patologijos stadiją ir gydymo efektyvumą;
• tyrimo paprastumas;
• gebėjimas atlikti masinius infekcijos židinių tyrimus;
• neskausmingumas, saugumas pacientui;
• taikymas informacinių technologijų apdorojime.

Vaizdo įrašas

Radote klaidą tekste?
Pasirinkite jį, paspauskite Ctrl + Enter ir mes viską ištaisysime!

Susietas imunosorbento tyrimas(arba trumpiau ELISA) – tai laboratorinis tyrimas, padedantis nustatyti tikslią diagnozę, nustatyti paslėptas ligas, nustatyti polinkį sirgti tam tikromis ligomis, taip pat stebėti paskirtos terapijos efektyvumą. Tyrimo metu paciento kraujo serume aptinkami specifiniams patogenams būdingi antigenai ir antikūnai prieš juos.

Kokia prasmė

Norint suprasti ELISA principą, reikia prisiminti, kaip veikia organizmo imuninė sistema, kas yra „antigenas“ ir „antikūnai“ ir kokias funkcijas jie atlieka.

Antigenas yra molekulė, kuri neša tam tikrą informaciją apie ląstelę. Jei į organizmą patenka svetimas antigenas, antikūnai (arba imunoglobulinai (Ig), reaguodami į svetimo mikroorganizmo atsiradimą organizme, prie jo prisijungia ir atpažįsta, ar tai savas, ar svetimas. Gavus „svetimą“ signalą, antikūnai pradeda naikinti potencialiai pavojingą objektą. Ši „antigeno“ sąveika -antikūnas“ vadinamas imuninis kompleksas. Juo pagrįstas ELISA metodas.

Indikacijos

Analizė plačiai naudojama įvairių tipų ligoms diagnozuoti. O ypač vertinga tai, kad šiuo tyrimu gana tiksliai diagnozuojamos ligos, kurios organizme atsiranda latentiškai, be simptomų.

Su jo pagalba galite nustatyti:

• lytiniu keliu plintančios infekcinės ligos (chlamidijos, ureaplazmozė, mikoplazmozė, sifilis, herpesas, ŽIV ir kt.);
• toksoplazmozė, tuberkuliozė, hepatitas, tymai ir kt.;
• autoimuninės problemos;
• onkologija;
• lytiniai hormonai;
• skydliaukės hormonai;
• alergijos.

ELISA netgi gali aptikti širdies ligų žymenis. Be to, jis skiriamas įvertinti gydymo kurso efektyvumą, taip pat prieš tam tikras chirurgines intervencijas.

Paruošimas

Kraujas tyrimams imamas iš venos tuščiu skrandžiu, geriausia ryte.

Dieną prieš tai turėtumėte susilaikyti nuo alkoholio, saldžių gėrimų, kavos ir gausios vakarienės. Be to, rodiklių rezultatams įtakos gali turėti tam tikrų vaistų vartojimas, todėl konsultacija su gydytoju būtina.

Likus 4 valandoms iki procedūros reikia susilaikyti nuo rūkymo.

Fermentinis imunologinis kraujo tyrimas ON CLINIC

Tarptautiniame medicinos centre ON CLINIC įrengta nuosava laboratorija, kuri turi tarptautinį kokybės kontrolės sertifikatą. Čia patyrę ir kvalifikuoti specialistai atlieka įvairaus pobūdžio analizes (daugiau nei 1000 vienetų).

Iš šio metodo privalumų galima išskirti tai, kad jis aptinkamas jau ankstyviausiose ligos vystymosi stadijose. Testo jautrumas yra 90%. Tyrimas tiksliai parodo infekcinio proceso dinamiką, o tai leidžia specialistui stebėti terapijos efektyvumą. Visas procesas yra visiškai automatizuotas, o tai pašalina vadinamojo „žmogiškojo faktoriaus“ įtaką.

Be to, didelio tikslumo įranga leidžia gauti patikimus tyrimų rezultatus per minimaliai trumpą laiką.

Rezultatus galite iššifruoti tą pačią dieną su gydytoju. Remdamasis jais, gydytojas parinks Jums tinkamą gydymo taktiką.

KLINIKOJE: Per daugiau nei 25 darbo metus mus pasirinko milijonai žmonių. Prisijunk prie mūsų!

Gydytojai

Administratorius susisieks su jumis, kad patvirtintų jūsų paskyrimą. IMC "ON CLINIC" garantuoja visišką Jūsų užklausos konfidencialumą.

BENDRASIS FARMAKOPĖJOS STRAIPSNIS

Pristatytas pirmą kartą

Ši bendroji farmakopėjos monografija taikoma su fermentais susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) metodui. ELISA metodas yra labai jautrus ir labai specifinis imunodiagnostinis metodas, kuriuo kokybiškai ir kiekybiškai nustatomos įvairios medžiagos, turinčios antigeno, hapteno (nepilno antigeno) ar antikūno savybes. ELISA metodas plačiai naudojamas diagnozuojant žmonių ir gyvūnų infekcines ir neinfekcines ligas, taip pat gali būti naudojamas imunobiologinių vaistinių preparatų (IBP) kokybei patvirtinti.

Metodo principas – specifinė antigeno sąveika su antikūnu, susidarant imuniniam kompleksui ir vėliau gauto komplekso aptikimas naudojant spektrofotometriją, chemiliuminescenciją ir kitus tinkamus metodus. Aptikimas gali būti tiesioginis (kai pati bandomoji medžiaga turi fermentinį aktyvumą arba ji yra paženklinta fermento etikete), arba netiesioginė arba netiesioginė (kai bandomoji medžiaga, surišta su antikūnais, imobilizuotais ant kietosios fazės, yra inkubuojama su fermentu pažymėta medžiaga antikūnai). Kokybinė analizė leidžia gauti informaciją apie antigeno ar antikūno kiekį tiriamoje medžiagoje pagal „taip/ne“ principą. Atliekant kiekybinę analizę, antigeno arba antikūno koncentracija tiriamojoje medžiagoje nustatoma naudojant kalibravimo grafiką.

BENDROSIOS NUOSTATOS

ELISA metodas apima 3 pagrindinius etapus: 1) imuninio komplekso „antigenas (tiriamoji medžiaga) – jam specifinis antikūnas“ susidarymas arba atvirkščiai; 2) ryšio tarp konjugato ir imuninio komplekso, susidariusio ankstesnėje stadijoje arba su laisvomis surišimo vietomis (determinantais), susidarymas; 3) substrato transformavimas veikiant fermento žymeniui į įrašytą signalą dėl biocheminės reakcijos.

Visi fermentų imunologinių tyrimų atlikimo metodai yra klasifikuojami kaip homogeniniai arba nevienalyčiai.

Metodai, kuriuose visos 3 ELISA stadijos vyksta tirpale, o tarp pagrindinių etapų nėra papildomų susidariusių imuninių kompleksų atskyrimo nuo nesureagavusių komponentų etapų, priklauso vienarūšių ELISA metodų grupei. Vienalytės ELISA, paprastai naudojamos mažos molekulinės masės medžiagoms nustatyti, pagrindas yra fermento aktyvumo slopinimo procesas, kai jis susijungia su antigenu arba antikūnu. Dėl antigeno-antikūno reakcijos atkuriamas fermentų aktyvumas. Kai susidaro antigeno ir antikūno imuninis kompleksas, turintis fermento žymę, fermento aktyvumas slopinamas 95%, palyginti su didelės molekulinės masės substratu, o tai yra dėl substrato sterinio pašalinimo iš aktyvaus fermento centro. Didėjant antigeno koncentracijai, jungiasi vis daugiau antikūnų, lieka vis daugiau laisvų antigeno-fermento konjugatų, galinčių hidrolizuoti didelės molekulinės masės substratą. Homogeninis ELISA metodas yra labai greitas. Vienam apibrėžimui išanalizuoti užtrunka 1 minutę. Metodo jautrumas yra gana didelis. Jis gali būti naudojamas medžiagai nustatyti pikomolių lygiu.

Heterogeniniams metodams būdinga analizė dviejų fazių sistemoje, kurioje dalyvauja kietoji nešiklio fazė, ir privalomas imuninių kompleksų atskyrimas nuo nesureagavusių komponentų (plovimas), kurie yra skirtingose ​​fazėse (susidarę imuniniai kompleksai yra ant kietos medžiagos). fazė, o nesureagavę kompleksai yra tirpale). Heterogeniniai metodai, kurių metu imuninių kompleksų susidarymas pirmajame etape vyksta kietojoje fazėje, vadinami kietosios fazės metodais.

Metodai priskiriami homogeniniams-heterogeniniams, jei tirpale vyksta 1 etapas – specifinių kompleksų susidarymas, o tada komponentams atskirti naudojama kieta fazė su imobilizuotu reagentu.

Heterogeninis ELISA metodas susideda iš 3 pagrindinių etapų:

• antigeno ar antikūno imobilizavimas ant kietos fazės, susidaręs kompleksas vadinamas imunosorbentu;
• nesurišto reagento pašalinimas ir surišimo vietų blokavimas ant kieto pagrindo naudojant blokuojančius baltymus, tokius kaip albuminas, kazeinas; analizuojamo vaisto inkubavimas su imunosorbentu, kad jie susijungtų;

3) aptikimas dėl pačios tiriamosios medžiagos fermentinio aktyvumo arba dėl fermentinės etiketės, susijusios su analizuojamu vaistu (tiesioginė versija). Kai kuriais atvejais papildomai inkubuojamas „imunosorbento ir tiriamosios medžiagos“ kompleksas su antriniais antikūnais, konjuguotais su fermentine etikete (netiesioginis pasirinkimas).

Kiekybinis bandomosios medžiagos nustatymas atliekamas pridedant substrato, tinkamo naudojamam detektoriui, ir lyginant bandomosios medžiagos signalą su standartiniu mėginiu.

Heterogeninis ELISA metodas skirstomas į nekonkurencinį ELISA ir konkurencinį ELISA. Tyrimo schemos gali būti modifikuojamos vaistų kūrimo proceso metu pagal būtinus reikalavimus. Pakeitimai turi būti nurodyti farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose. ELISA metodo pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos pobūdžio ir jos kiekio, nes skirtingų tipų ELISA jautrumas yra skirtingas. Norint įvertinti medžiagų, kuriose yra antikūnų, kokybę, galima naudoti specifinius anti-idiotipinius antikūnus.

Nekonkurencinis ELISA metodas

Nekonkurencinis ELISA metodas skirstomas į keletą tipų pagal aptikimo tipą (tiesioginis konkurencinis, netiesioginis (netiesioginis) konkurencinis) ir pagal medžiagos, imobilizuotos ant kietosios fazės, tipą (antigenas arba antikūnas).

Tiesioginė ELISA parinktis

Galima atlikti 2 būdais. Pirmuoju atveju tiriamoji medžiaga (antigenas) yra tiesiogiai imobilizuojama ant kietosios fazės; tada su antigenu surištas žymėtasis antikūnas yra detektorius. Atliekant tyrimą kitu būdu, naudojami ant kietosios fazės imobilizuoti antikūnai. Šiuo atveju detektorius yra bandomoji medžiaga, paženklinta fermentu.

Netiesioginė (netiesioginė) ELISA versija

Atliekant netiesioginę ELISA versiją, antigenas imobilizuojamas ant kietosios fazės. Po blokavimo į antigeną pridedamas jam būdingų antikūnų tirpalas. Po inkubacijos gautas antigeno-antikūno kompleksas nuplaunamas nuo neprisijungusių antikūnų ir pridedamas fermentu pažymėtas anti-imunoglobulinas (anti-Ig), kuris veikia kaip detektorius. Prekyboje yra anti-Ig detektorių, skirtų konkrečioms Ig klasėms ir poklasiams, todėl šis tyrimo formatas yra patogus antikūnų izotipams nustatyti. Be to, pažymėto anti-Ig naudojimas sustiprina signalą, palyginti su tiesioginiu su fermentu susietu imunosorbento tyrimo metodu, taip padidindamas tyrimo jautrumą.

„Sumuštinio“ metodas kaip ELISA atlikimo parinktis

Dažniausias nekonkurencinis metodas yra sumuštinių metodas. Kai tai atliekama, pirminiai antikūnai imobilizuojami ant kietosios fazės ir vėliau blokuojami. Tada į juos pridedama bandomosios medžiagos, kurioje yra antigeno, ir inkubuojama. Po inkubacijos antigeno-antikūno kompleksas nuplaunamas nuo neprisijungusio antigeno ir pridedami antriniai antikūnai, pažymėti fermentu, ir atliekamas aptikimas.

Konkurencinis ELISA metodas

Konkurencinis ELISA metodas skirstomas į keletą tipų: pagal aptikimo tipą (tiesioginis konkurencinis, netiesioginis (netiesioginis) konkurencinis) ir pagal kietojoje fazėje imobilizuotos medžiagos tipą (antigenas arba antikūnas).

Tiesioginė konkurencinė ELISA

Tirpių antigenų aptikimui arba kiekybiniam kiekiui nustatyti naudojama tiesioginė konkurencinė ELISA versija su antigenu, imobilizuotu ant kietosios fazės. Norėdami tai padaryti, naudokite antigenui specifinius antikūnus, konjuguotus su atitinkamu detektoriumi (pavyzdžiui, krienų peroksidaze, šarmine fosfataze, rutenu arba fluoresceinu). Standartinis antigenas imobilizuojamas ant kietosios fazės, po to blokuojamas. Antikūnas, konjuguotas su fermentiniu žymeniu, inkubuojamas su tiriamąja medžiaga (tirpusiu antigenu). Tada šis mišinys pridedamas prie imobilizuoto antigeno, inkubuojamas ir plaunamas, kad būtų pašalintas nesurištas antigeno-antikūno kompleksas. Kitas žingsnis yra pridėti tinkamą substratą fermentui, kuris naudojamas kaip žyma. Reakcijos slopinimas dėl 2 antigenų buvimo sistemoje, lyginant su kontroliniu mėginiu be konkurencinio tirpaus antigeno, yra atvirkščiai proporcingas tiriamosios medžiagos kiekiui.

Tiesioginis konkurencinis kietosios fazės antikūnų ELISA yra panašus į tiesioginį konkurencinį kietojo antigeno ELISA, bet yra naudojamas antikūnams aptikti arba kiekybiškai nustatyti.

Netiesioginis (netiesioginis) konkurencinis ELISA variantas

Šis ELISA metodas yra panašus į tiesioginį konkurencinį variantą, tačiau vietoj pažymėto antikūno ar antigeno aptikimui naudojamas atitinkamai pažymėtas anti-Ig reagentas arba pažymėti antriniai antikūnai.

Bendrosios metodo vykdymo sąlygosELISA

Fermentiniam imuniniam tyrimui kaip kieta fazė naudojamos įvairios medžiagos: silikonas, nitroceliuliozė, poliamidai, polistirenas, polivinilchloridas, polipropilenas, akrilas ir kt. Kieta fazė gali būti mėgintuvėlio sienelės, 96 šulinėlių ir kitos plokštelės, rutuliukai, karoliukai, taip pat nitroceliuliozė ir kitos aktyviai baltymus sugeriančios membranos. Imobilizacijos principas (hidrofobinė, hidrofilinė, kovalentinė sąveika) priklauso nuo kietosios fazės pasirinkimo. Dažniausiai kaip kietoji fazė naudojamos 96 šulinėlių plastikinės mikrotitravimo plokštelės. Skylučių skaičius plokštelėje gali skirtis. Tabletė gali būti skaidri (kolorimetrinė aptikimas) arba matinė (chemiliuminescencinė aptikimas, fluorimetrija).

Imobilizavimas turi būti atliekamas be oro burbuliukų šulinyje, nes jų buvimas keičia optinio tankio rodmenis. Galima naudoti biotiniluotus imobilizuotus reagentus. Šiuo atveju reakcijai naudojamas streptavidinas ir biotinilinto fermento žymė. Šis metodas naudojamas signalui sustiprinti. Imobilizacijos laikas ir temperatūra, priklausomai nuo reagento kinetinės prigimties, stabilumo ir koncentracijos, turi būti nurodyti farmakopėjos monografijoje ir norminiuose dokumentuose.

Farmakopėjos monografijoje ir norminiuose dokumentuose taip pat turi būti nurodyti visi fermento imunologinio tyrimo etapai, plovimo ir blokavimo tirpalai, kiekvieno etapo laiko intervalai ir temperatūros sąlygos, inkubacijos purtyklėje apsisukimų skaičius per minutę, aptikimo sąlygos.

Kai kurių tipų ELISA metodų pavyzdžiai

Netiesioginis nekonkurencinis ELISA metodas

1. Antigeno sorbcija.Į kiekvieną 96 šulinėlių plokštelės šulinėlį įpilkite 0,1–0,5 μg antigeno ir 100 μl 0,05 M karbonato-bikarbonato buferinio tirpalo (pH 9,6), jei farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose nenurodyta kitaip, tada atlikite sorbciją 4 ° C temperatūroje 16 valandų Galima naudoti kitus buferinius tirpalus, kurių pH vertės aukštas. Inkubuojama kratant ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

Neprisijungusios antigeno molekulės nuplaunamos (du kartus) fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0), kuriame yra 0,1% Tween-20 (300 μl vienoje duobutėje), nebent farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose nurodyta kitaip.

1. Blokavimas. Norint blokuoti nespecifinio antigenų ar antikūnų prisijungimo vietas, tabletės šulinėliai užpildomi fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0) arba kitu buferiniu tirpalu, nurodytu farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose, kuriuose yra 1 % galvijų serumo tirpalo. albuminą ar kitus baltymus (kazeiną, želatiną, pieno miltelius ir kt.) ir inkubuokite 10–15 minučių kambario temperatūroje (jei farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose nenurodyta kitaip).

III. Specifinių antikūnų titravimas. Jei reikia atlikti kiekybinį įvertinimą, bandomoji medžiaga (antigenas arba antikūnas) titruojama serijiniais skiedimais lygiagrečiai su standartiniu mėginiu (RM).

Titravimas gali būti atliekamas tiek horizontaliose, tiek vertikaliose plokštės eilėse. Pažymėtina, kad antikūnų titravimas atliekamas, jei reikia parinkti optimalią antikūnų koncentraciją arba nustatyti jų titrą. Jei nustatoma optimali antikūnų koncentracija ir (arba) titras, naudojamas rekomenduojamas šių antikūnų skiedimas (serumas).

Titruojant į pirmąjį serijos šulinėlį įpilamas paruoštas antikūnų skiedimas - vidutiniškai 1-10 μg vienoje duobutėje, tada šulinėliuose atliekamas nuoseklus antikūnų praskiedimas. Inkubuojama su specifiniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje, kratant ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

Skalbimas atliekamas mažiausiai 3–4 kartus, naudojant fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 9,0, kuriame yra 0,1% Tween-20.

1. Anti-rūšinių (antiglobulino) antikūnų, konjuguotų su fermento žyma, pridėjimas. Anti-rūšiniai polikloniniai antikūnai, konjuguoti su fermentine žyme, naudojami kaip detektorius (antriniai) antikūnai. Dažniausiai naudojami ožkos arba triušio antikūnai, būdingi visai molekulei arba specifinių antikūnų Fc fragmentams. Detektoriaus antikūnų koncentraciją gamintojas paprastai nurodo kaip pradinio tirpalo praskiedimą (pavyzdžiui, 1:1000).

Inkubuojama su pažymėtais antriniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje, kratant ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

Skalbimas atliekamas mažiausiai 3–4 kartus, naudojant fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0), kuriame yra 0,1% Tween-20.

Inkubuojama 10 minučių kambario temperatūroje ir kratoma ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

1. Į duobutes įpilama 100 μl substrato tirpalo ir inkubuojama 10 minučių kambario temperatūroje, nuolat maišant. Fermentinei reakcijai sustabdyti naudojamas „stabdymo reagentas“, kurio vienodais kiekiais dedama į visus tiriamuosius ir kontrolinius mėginius. Sieros rūgštis dažniausiai naudojama kaip „stabdymo reagentas“.

Tiesioginis nekonkurencinis ELISA metodas

Tiesioginis ELISA metodas turi tik nežymius skirtumus nuo netiesioginio nekonkurencinio ELISA metodo. Taigi I ir II etapai yra vienodi abiejų tipų analizėse. Skirtumas tas, kad tiesioginėje ELISA versijoje III stadijoje naudojami tiriamajam antigenui specifiniai antikūnai, konjuguoti su fermento etikete ir jie tiesiogiai sąveikauja su tiriamąja medžiaga. Jei reikia, konjugatų titravimas taip pat gali būti atliekamas panašiai kaip anksčiau aprašytas nekonjuguotų antikūnų atveju. Tiesioginio nekonkurencinio ELISA IV etapas neatliekamas.

„Sumuštinio“ metodas ELISA

Šioje ELISA versijoje naudojama pora antikūnų (pirminių ir antrinių), būdingų erdviškai nutolusiems tiriamo antigeno epitopams.

1. Antikūnų sorbcija kietoje fazėje. Antigenų sorbcijos technika yra panaši į antikūnų sorbcijos metodą, aprašytą skyriuje „Netiesioginis nekonkurencinis ELISA metodas“.
2. Blokavimas. Nespecifinių surišimo vietų ant substrato (kietos fazės) blokavimo metodas yra panašus į blokavimo metodą, aprašytą skyriuje „Netiesioginis nekonkurencinis ELISA metodas“.

III. Inkubavimas su antigenu. 50 μl bandomosios medžiagos ir standartinių antigeno skiedimų įpilama į lėkštelės šulinukus su iš anksto adsorbuotais antikūnais, nebent farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose nurodyta kitaip. Antigenų skiedimai turi būti ruošiami fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0), kuriame yra 0,1 % Tween-20, nes Tween-20 sumažina nespecifinį baltymų molekulių jungimąsi tarpusavyje ir su plokštelės paviršiumi. Ir bandomoji medžiaga, ir standartiniai antigeno skiedimai poromis dedami į gretimus šulinukus horizontalioje eilėje (arba 3 pakartojimais), naudojant 2 (3) šulinėlius kiekvienam baltymo skiedimui.

Inkubuojama kambario temperatūroje 30 minučių nuolat maišant. Skalbimas atliekamas mažiausiai 3-4 kartus fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0), kuriame yra 0,1% Tween-20, arba kitu buferiniu tirpalu, nurodytu farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose.

1. Inkubavimas su antikūnais, konjuguotais su fermento žyme.Į plokštelės duobutes įpilama 100 μl specifinių antikūnų, konjuguotų su fermento žyme, tirpalo. Optimali konjuguotų antikūnų koncentracija paprastai nurodoma farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose (dažniausiai naudojama 2–4 ​​μg/ml koncentracija).

Inkubuojama su antikūnais, turinčiais fermento žymę, 30 minučių kambario temperatūroje, kratant ant horizontalios plokštelės kratytuvo.

Skalbimas atliekamas mažiausiai 3–4 kartus, naudojant fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 9,0), kuriame yra 0,1 % Tween-20, arba kitu buferiniu tirpalu, nurodytu farmakopėjos monografijoje arba norminiuose dokumentuose.

1. Vykdoma fermentinė reakcija kartu su spalvoto produkto atsiradimu. Fermentinės reakcijos atlikimo technika yra panaši į metodą, aprašytą skyriuje „Netiesioginis nekonkurencinis ELISA metodas“.

Aptikimas

Kaip minėta pirmiau, aptikimui naudojami antikūnai, pažymėti fermento žyme arba kitu reagentu. Fermento žyma gali būti, pavyzdžiui, krienų peroksidazė, šarminė fosfatazė arba galaktozidazė. Antikūnai arba antigenai su kitomis etiketėmis gali būti naudojami kaip detektorius. Detektoriaus reagento pasirinkimas priklauso nuo etiketės, konjuguotos su antikūnu arba antigenu, tipo ir aptikimo metodo.

Spektrofotometrija, chemiliuminescencija, fluorimetrija ir kiti metodai gali būti naudojami kaip aptikimo metodai, atsižvelgiant į etiketės pasirinkimą.

Kiekybinio ELISA metodo rezultatai

Kiekybiniai ELISA rezultatai apskaičiuojami pagal tiesinę kalibravimo kreivę su atvirkštine regresija arba kompleksiniu metodu, naudojant netiesinę kalibravimo kreivę su atvirkštine regresija. Rezultatų interpretavimo metodas priklauso nuo naudojamo ELISA metodo. Pavyzdžiui, bandymo rezultatai gali būti naudojami norint įvertinti nežinomo mėginio koncentraciją, pusę didžiausios slopinimo koncentraciją arba efektyviąją koncentraciją naudojant kalibravimo kreivę. Tai leidžia nustatyti bandomosios medžiagos kiekį arba jos aktyvumą, palyginti su etaloniniu/kalibravimo etalonu (RM). Paprastai kalibracinės kreivės tipas atliekant kiekybinį ELISA metodą, apibūdinantį analizuojamo vaisto koncentraciją, netiesiškai priklauso nuo apskaičiuotos vidutinės vertės. Atsižvelgiant į tai, gautos kreivės analizei rekomenduojama naudoti įvairius matematinius modelius. Kitais atvejais ELISA metodas naudojamas kaip kokybinis metodas, leidžiantis įvertinti konkrečios tiriamosios medžiagos buvimą mėginyje neviršijant metodo jautrumo ribų.

Pastaba.

Karbonato-bikarbonato buferinio tirpalo paruošimas (pH 9,6). Į 1000 ml talpos matavimo cilindrą įpilkite 1,59 g natrio karbonato (bevandenio) arba 4,29 g natrio karbonato 10 vandeninio ir 2,93 g natrio bikarbonato, ištirpinkite 800 ml išgryninto vandens, nustatykite pH iki 9,6, sumaišykite. , tada išvalytu vandeniu pripildykite tirpalo tūrį iki žymės ir vėl sumaišykite.