Ifa resumo que tipo de análise. Exame de sangue por imunoensaio enzimático: interpretação, métodos. Vídeo: imunoensaio enzimático moderno

Três variantes de imunoensaio em fase sólida são mais frequentemente utilizadas na prática - imunoensaio indireto, imunoensaio direto e imunoensaio tipo sanduíche. As diferenças entre esses tipos de imunoensaios são as seguintes. Na versão indireta do imunoensaio, na primeira etapa, o antígeno é adsorvido na superfície dos poços de uma placa de poliestireno. Após a remoção das moléculas de antígeno não ligadas, é adicionada uma amostra contendo anticorpos específicos para esse antígeno. Os complexos antígeno-anticorpo resultantes são detectados usando anticorpos anti-espécies conjugados com qualquer marcador (Fig. 1A). Na versão direta do imunoensaio, a detecção do antígeno sorvido é realizada diretamente por meio de anticorpos específicos conjugados a um marcador (Fig. 1B). Em um imunoensaio tipo sanduíche, na primeira etapa, não o antígeno, mas os anticorpos específicos do antígeno em estudo (anticorpos substrato) são adsorvidos na superfície da placa. Após a remoção das moléculas de anticorpos não ligadas, é adicionada uma amostra contendo o antígeno. Para detectar o complexo substrato anticorpo-antígeno resultante, são adicionados segundos anticorpos que são específicos para outro epítopo do antígeno, espacialmente distante, conjugado a qualquer marcador (Fig. 1B). A utilização de imunoensaios do tipo sanduíche de anticorpos específicos para dois epítopos diferentes de um antígeno permite alcançar alta sensibilidade e especificidade na determinação do antígeno, mesmo em amostras heterogêneas como o plasma sanguíneo.

Arroz. 1. Princípio do imunoensaio indireto (A), direto (B) e tipo sanduíche (C)

Imunoensaio enzimático indireto (ELISA indireto)

O método de imunoensaio indireto é caracterizado por um processo de 3 etapas, na primeira etapa em que o antígeno é adsorvido em um plástico especialmente preparado, na segunda etapa os anticorpos específicos interagem com o antígeno e na terceira etapa os anticorpos anti-espécies conjugados com uma enzima são introduzidos no sistema, causando uma reação enzimática indicadora. Nesta técnica, a peroxidase de rábano é usada como enzima. A reação é realizada em placas especiais de 96 poços.

I. Sorção de antígeno

Os poços de uma placa de 96 poços para imunoensaio absorvem 0,1-0,5 μg de antígeno por poço em 100 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A incubação é realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente e agitação num agitador de placas horizontal. A lavagem (2 vezes) das moléculas de antígeno não ligadas é realizada com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,1% (PBS).

II. Trancar

Para bloquear locais de ligação não específicos, os poços da placa são preenchidos com PBST e incubados durante 10-15 minutos à temperatura ambiente.

III. Titulação de anticorpos específicos

A titulação pode ser realizada em linhas horizontais e verticais do comprimido. Deve-se notar que a titulação de anticorpos é realizada se for necessário selecionar a concentração ideal de anticorpos ou determinar o título. Se for determinada a concentração e/ou título óptimo de anticorpos, então é utilizada a diluição recomendada para estes anticorpos específicos.

Ao titular, uma diluição pronta de anticorpos é adicionada ao primeiro poço da linha - em média 1-10 μg por poço, depois a diluição sequencial dos anticorpos é realizada nos poços. A incubação com anticorpos específicos é realizada por 30 minutos em temperatura ambiente e agitação em agitador de placas horizontal. A lavagem é realizada com PBST 3 vezes.

4. Adição de anticorpos anti-espécies conjugados a um marcador enzimático

Anticorpos policlonais anti-espécies conjugados com peroxidase de rábano são usados ​​como anticorpos detectores (secundários). Na maioria das vezes, são utilizados anticorpos de cabra ou coelho, específicos para a molécula inteira ou para os fragmentos Fc de anticorpos específicos. A concentração de anticorpos detectores é geralmente indicada pelo fabricante como uma diluição da solução estoque (por exemplo, 1:1000). A incubação com anticorpos secundários é realizada por 30 minutos em temperatura ambiente e agitação em agitador de placas horizontal. A lavagem é realizada com PBST 5-6 vezes.

A peroxidase de rábano catalisa a reação de oxidação do substrato com peróxido de hidrogênio. A O-fenilenodiamina (OPD) é usada como substrato para a peroxidase de rábano. Como resultado da reação, um produto de oxidação colorido de OPD é formado.

Solução de substrato: A 10 ml de tampão de substrato (tampão citrato de Na 0,1 M, pH 4,5), adicione 0,01 ml de peróxido de hidrogênio a 30% e 0,2 ml de solução 50x OPD (340 mg OPD em 10 ml de álcool etílico; armazenar em - 20ºC).

A incubação é realizada durante 10 minutos à temperatura ambiente e agitação num agitador de placas horizontal.

V. Parando a reação enzimática

VI. Medição de densidade óptica

Imunoensaio enzimático direto (ELISA direto)

A técnica de imunoensaio direto apresenta apenas pequenas diferenças em comparação com a técnica de imunoensaio indireto. Assim, as etapas I e II são iguais nos dois tipos de análise. A diferença é que na versão direta do imunoensaio, a etapa III utiliza anticorpos específicos conjugados a um marcador enzimático. Se necessário, também é possível titular anticorpos específicos conjugados a um marcador enzimático, à semelhança do que foi descrito anteriormente para anticorpos não conjugados. O estágio IV é omitido e os estágios adicionais (V-VII) são realizados de forma semelhante aos descritos acima para a versão indireta do imunoensaio.

Imunoensaio tipo sanduíche

Arroz. 2. Representação esquemática de um imunoensaio tipo sanduíche. ATP - anticorpo substrato, ATD - anticorpo detector, AG - antígeno, M - rótulo ligado covalentemente ao anticorpo detector, P - substrato no qual o anticorpo substrato é sorvido.

Esta versão do imunoensaio (Fig. 2) utiliza um par de anticorpos específicos para epítopos espacialmente distantes do antígeno em estudo.

I. Sorção de anticorpos substrato

Os anticorpos substrato, 1-2 μg por poço, são absorvidos nos poços de uma placa de 96 poços para imunoensaio em 100 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A incubação é realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente e agitação num agitador de placas horizontal. A lavagem (2 vezes) das moléculas de antígeno não ligadas é realizada com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,1% (PBS).

II. Trancar

Para bloquear locais de ligação não específicos, os poços da placa são preenchidos com PBST e incubados durante 10-15 minutos à temperatura ambiente.

III. Incubação com antígeno

50 µl da solução teste ou diluições padrão do antígeno são adicionados aos poços da placa com anticorpos pré-adsorvidos. As diluições do antígeno devem ser preparadas usando PBST porque o Tween-20 reduz a ligação inespecífica das moléculas de proteína entre si e com a superfície da placa. Tanto a solução teste quanto as diluições padrão de antígeno são adicionadas aos pares (ou em 3 repetições), utilizando dois (três) poços para cada diluição de proteína. A incubação é realizada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação constante. A lavagem é realizada com solução PBST 3 vezes.

4. Incubação com anticorpos conjugados a uma etiqueta enzimática

100 μl de uma solução de anticorpos específicos conjugados com um marcador enzimático são adicionados aos poços da placa. A concentração ideal de anticorpos conjugados é geralmente indicada pelo fabricante (geralmente é usada uma concentração de 2-4 μg/ml). A incubação com anticorpos contendo marcador enzimático é realizada por 30 minutos em temperatura ambiente e agitação em agitador de placas horizontal. A lavagem é realizada com PBST 5-6 vezes.

V. Realização de uma reação enzimática acompanhada pelo aparecimento de um produto colorido

100 μl de solução de substrato são adicionados aos poços e incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e agitação constante.

VI. Parando uma reação enzimática

Antes de medir a densidade óptica, a reação de cor é interrompida usando H2SO4 0,5 M. Após a incubação, 50 μl de uma solução de ácido sulfúrico 0,5 M são adicionados aos poços com a solução de trabalho OPD. Depois disso, você pode começar imediatamente a medir a densidade óptica.

VII. Medição de densidade óptica

A densidade óptica da solução do produto colorido é medida a λ=490 nm utilizando um espectrofotômetro de placa.

versão impressa

Ensaio de imunoensaio (ELISA)

Ensaio ou método de imunoensaio (ELISA) — detecção de antigénios utilizando os seus anticorpos correspondentes conjugados com uma enzima marcadora (peroxidase de rábano, beta-galactosidase e/ou fosfatase alcalina). Após combinar o antígeno com o soro imune marcado com enzima, o substrato/cromógeno é adicionado à mistura. O substrato é clivado pela enzima e a cor do produto da reação muda - a intensidade da cor é diretamente proporcional ao número de moléculas de antígeno e anticorpo ligadas.

Os componentes são detectados pela adição de anticorpos ou antígenos marcados. Se o resultado for positivo, a cor do cromógeno muda.

Ensaio imunoenzimático indireto de fase sólida

Cada vez após a adição de outro componente, os reagentes não ligados são removidos dos poços por lavagem.
I. Na determinação de anticorpos, o soro sanguíneo do paciente, o soro antiglobulina marcado com uma enzima e um substrato/cromógeno para a enzima são adicionados sucessivamente aos poços das placas com antígeno sorvido.

II. Ao determinar um antígeno, um antígeno é adicionado aos poços com anticorpos sorvidos (por exemplo, soro sanguíneo com o antígeno desejado), um soro diagnóstico contra ele e anticorpos secundários (contra o soro diagnóstico), marcados com uma enzima, são adicionados, e então um substrato/cromógeno para a enzima.

ELISA competitivo para detecção de anticorpos: os anticorpos desejados e os anticorpos marcados com enzima competem entre si pelos antígenos adsorvidos na fase sólida.

Determinação do rótulo da peroxidase usando quimiluminescência aprimorada. Desenvolvimento de métodos rápidos de imunoensaios enzimáticos realizados em dispositivos portáteis. Sinergia e grau de aprimoramento. Intensidade e duração da emissão de luz.

Ensaio imunoabsorvente enzimático com quimioluminescência aprimorada

INTRODUÇÃO

O marcador enzimático pode ser quantificado utilizando vários métodos, por exemplo, utilizando colorimetria, fluorimetria, radiometria e potenciometria.

Recentemente, a quimioluminescência ou bioluminescência também tem sido utilizada para esse fim. Marcadores enzimáticos que podem ser determinados usando reações acompanhadas de emissão de luz são apresentados na tabela. 1. Em geral, a sensibilidade dos métodos de detecção quimioluminescentes e bioluminescentes é muito alta, e se a amplificação do sinal de um marcador enzimático também for usada, então a sensibilidade dos métodos de imunoensaio correspondentes deverá ser extremamente alta.

As capacidades do método bioluminescente foram recentemente demonstradas pelo exemplo da determinação da D-galactosidase. Utilizando a reação acoplada galactose desidrogenase AOH:PMN oxidorredutase-luciferase bacteriana, foi possível detectar 2 * 10″22 mol de /3-galactosidase.

A peroxidase de rábano é amplamente utilizada como marcador em ensaios imunoenzimáticos; métodos para preparar e estabilizar conjugados com os quais foram bem estudados.

A peroxidase de rábano é mais frequentemente determinada colorimetricamente, mas várias reações químicas e bioluminescentes também podem ser usadas para esse fim.

A determinação da peroxidase utilizando uma reação quimioluminescente no sistema luminol-peróxido de hidrogênio potencializado com compostos fenólicos foi estudada detalhadamente.

Esta abordagem para determinar a actividade enzimática tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos de determinação; suas principais características estão listadas na tabela. 2.

Amplificadores. Vários compostos, incluindo 6-hidroxibenzotiazóis, como luciferina, fenóis, naftóis e aminas, têm a capacidade de aumentar a emissão de luz na reação de oxidação luminal com peróxido de hidrogênio, catalisada pela peroxidase.

Na Fig. A Figura 1 mostra as estruturas dos representantes das substâncias de cada classe. O grau de aumento da emissão de luz depende da concentração dos reagentes. Uma dependência típica da intensidade da luminescência na concentração do amplificador na reação do luminol com peróxido de hidrogênio, catalisada pela peroxidase e potencializada pelo 6-hidroxi-benzotiazol, é mostrada na Fig.

Sinergia e grau de aprimoramento. No sistema peroxidase - luminal - peróxido de hidrogênio, um azul-

rgismo, conforme evidenciado pelos dados fornecidos na tabela. 3. O grau de aprimoramento é influenciado por muitos fatores; No entanto, foi alcançado um aumento na emissão de luz de mais de 500 vezes.

Na presença de certos amplificadores, a emissão de luz de fundo no sistema luminol-peróxido de hidrogênio diminui. Ao determinar a atividade da peroxidase, isso permite aumentar a relação sinal-ruído em várias ordens de grandeza somente através do uso de tais amplificadores.

O aumento da luminescência é característico de várias diacilhidrazidas cíclicas quando expostas a agentes oxidantes na presença de peroxindase. O aumento não é observado para algumas substâncias com atividade peroxidase, como a hemoglobina, que catalisa apenas reações colorimétricas.

Este fato indica uma maior especificidade da análise quimioluminescente aprimorada em comparação aos métodos colorimétricos. Os espectros da luz emitida são quase os mesmos nas reações amplificadas e não amplificadas. Isto “sugere que o próprio amplificador não emite luz.

Na ausência de amplificadores, a quimiluminescência no sistema peroxidase-luminol-peróxido é aparentemente limitada pela reação relativamente lenta da peroxindase, na forma do chamado composto II, com o luminol, como resultado da formação de radicais luminol e a peroxidase é regenerada.

Amplificadores capazes de reagir rapidamente com um tal composto podem aumentar a emissão de luz, acelerando a conversão do Composto II em peroxidase activa.

Os produtos de conversão do amplificador podem então reagir rapidamente com o luminol para formar radicais luminol adicionais e, assim, aumentar ainda mais a emissão de luz. Os reforços também podem ter como alvo intermediários inativos da peroxidase™, como o Composto III.

Reagentes

Um factor importante na determinação da actividade da peroxidase utilizando quimiluminescência melhorada é a pureza química das diacil-hidrazidas cíclicas.

Um estudo de várias amostras de luminol mostrou que as impurezas afetam negativamente a emissão de luz. Como resultado de processos fotoquímicos e térmicos, o luminol é parcialmente decomposto e as impurezas resultantes afetam a cinética e a intensidade da emissão de luz.

Na tabela 4 apresenta os resultados de uma comparação da pureza e propriedades de algumas preparações de luminol disponíveis comercialmente, bem como do sal de sódio do luminol, purificado por recristalização a partir de uma solução de hidróxido de sódio.

2. IMUNOENSAIO QUIMILUMINESCENTE MELHORADO

O imunoensaio de quimioluminescência aprimorado com peroxidase como marcador enzimático tem sido utilizado para a determinação de muitos compostos. Vários exemplos são dados na tabela. 5. Estes imunoensaios utilizaram métodos de extração competitivos e de imunocomplexos, bem como os suportes sólidos mais comumente utilizados.

a Razão sinal/fundo para determinação quimioluminescente de peroxidase de rábano melhorada com l-iodofenol; 6 TLC - cromatografia em camada delgada.

arroz. A Figura 3 mostra um diagrama para determinação do hormônio folículo-estimulante. Neste método, o limite de detecção de FSH numa placa de microtitulação é de cerca de 0,01 ppm. O método é caracterizado por excelente reprodutibilidade tanto dentro de um ensaio como entre ensaios.

O método de quimiluminescência aprimorada também tem sido usado com sucesso para detectar marcadores de peroxidase em estudos de hibridização de DNA.

MÉTODO DE ANTICORPOS FLUORESCENTES (FFA).

método de determinação quantitativa por fotômetro de placas e análise qualitativa por detecção fotográfica com sensibilidade de vários picogramas.

Dispositivos

A indústria produz atualmente vários tipos de luminômetros adequados para medir a luz emitida em reações intensificadas de quimioluminescência.

Alguns desses luminômetros foram modificados especificamente para análise aprimorada de quimioluminescência. A intensidade e a duração da emissão de luz em reações de aumento de luminescência facilitaram o desenvolvimento de luminômetros simples que utilizam fotodiodos de silício ou filme fotográfico de alta velocidade como detectores.

Tais luminômetros são relativamente baratos, portáteis e, portanto, podem ser usados ​​fora de laboratórios. Atualmente, a MAST Immunosystems produz câmeras especiais para detecção quimioluminescente no método ELISA de imunoglobulina E específica para alérgenos. Pode-se presumir que futuramente serão criados kits com registro fotográfico dos resultados de ELISA e outros compostos, cuja determinação deve ser realizado em clínicas, hospitais ou em casa.

Instrumentos fabricados e kits de reagentes.

Kits de imunoensaio enzimático de quimioluminescência aprimorados e instrumentos associados são agora comercializados sob o nome Amerlite pela Amersham International pic.

A análise é realizada em tiras brancas de placas de microtitulação e as medições de luminescência são realizadas de forma rápida e automática por um luminômetro especial de microplacas.

Atualmente são produzidos kits para determinação de hormônio estimulador da tireoide, coriogonadotrofina humana, antígeno carcinoembrionário, alfa-fetoproteína, tiroxina, triiodotironina e para determinação do índice de tiroxina livre. Esses ensaios têm alta sensibilidade e excelente reprodutibilidade.

CONCLUSÕES

A determinação do marcador de peroxidase usando quimioluminescência aprimorada é altamente sensível, específica e simples e pode ser usada como base para o desenvolvimento de métodos de ensaio imunoabsorvente ligados a enzimas convenientes e rápidos realizados usando dispositivos portáteis baratos.

Princípios do imunoensaio enzimático, principais tipos de ELISA, aplicação em diagnóstico

Métodos de imunoensaio na prática médica, a interação entre antígeno e anticorpo é sua base.

Tipos de imunoensaio dependendo do tipo de rótulo e condições de teste. Características dos componentes utilizados no imunoensaio enzimático.

resumo, adicionado em 07/11/2011

Reações sorológicas

Reações sorológicas como reações entre antígenos e anticorpos in vitro.

Classificação das reações sorológicas em função da natureza e do estado físico do antígeno. Reação de precipitação em gel de acordo com Ouchterlony. Mctode de imunoensaio enzimático.

apresentação, adicionada em 03/06/2015

Análise espectral do eletrocardiograma

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resumo, adicionado em 09/12/2011

Aplicação da radiação na medicina

Tratamento da asma brônquica com radiação infravermelha. Fontes artificiais de radiação ultravioleta (UV) na medicina. Lâmpadas bactericidas sem ozônio e sem ozônio.

Desinfecção de água potável por radiação UV. Diagnóstico por raios X, design de dispositivos.

resumo, adicionado em 27/08/2009

Acromegalia

A acromegalia é uma doença associada ao aumento da produção do hormônio do crescimento (hormônio somatotrópico). Quadro clínico da doença. Um indicador laboratorial característico de acromegalia durante o diagnóstico. Teste com hormônio liberador de tireotropina. Tratamento de raios X.

apresentação, adicionada em 03/05/2012

Marcadores tumorais na prática clínica

A utilização de análises laboratoriais para o diagnóstico de câncer e monitoramento pós-operatório da eficácia da cirurgia e da quimioterapia.

Determinação de marcadores tumorais por métodos de imunoensaio enzimático, imunoluminescente e radioimunoensaio.

resumo, adicionado em 09/10/2010

Métodos físico-químicos de análise de medicamentos

Classificação dos métodos físico-químicos de análise. Análise espectral de absorção molecular. Leis de absorção de radiação. Colorimetria visual. Determinação da concentração em fotoeletrocolorimetria. Espectrofotometria de medicamentos.

resumo, adicionado em 14/11/2010

Principais áreas de aplicação da quimiluminescência ativada

O mecanismo de reações acompanhado pelo brilho dos organismos vivos, visível a olho nu.

O uso de quimioluminescência ativada e bioluminescência como ferramenta em estudos biomédicos de soro sanguíneo, urina, líquido cefalorraquidiano e saliva.

trabalho do curso, adicionado em 25/10/2011

Métodos modernos para diagnóstico de doenças infecciosas

Métodos para diagnosticar doenças infecciosas em animais.

Reação em cadeia da polimerase. Imunoensaio enzimático e suas finalidades. Diagnóstico de infecções causadas por infecções por estafilococos, pneumococos e salmonelas. O agente causador da brucelose, seu diagnóstico.

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Etiquetas luminescentes

O conceito de luminescência, sua natureza física e causas de ocorrência.

Regra de Stokes. Tipos de luminescência (fotoluminescência, quimioluminescência) e sua produção. Leis básicas da radiação térmica. Análises luminescentes, qualitativas e quantitativas de substâncias.

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Isquemia cardíaca

1.1 Classificação da DIC

A DIC inclui várias doenças que diferem significativamente nas manifestações clínicas.

Clínica de pulpite crônica: fibrosa, hipertrófica, gangrenosa

Classificação

Pulpite aguda hiperemia pulpar serosa limitada serosa difusa purulenta traumática Pulpite crônica fibrosa gangrenosa hipertrófica (proliferativa) Exacerbação de pulpite crônica Crônica…

Mastite de lactação

4.

Classificação

Classificação cirúrgica da mastite: I. Decorrente da doença: 1. Inespecífica. 2. Específico. II. De acordo com o estado funcional da mama: 1. Lactação.

Ensaio imunoenzimático (ELISA)

2. Não lactacional. III. De acordo com o curso do processo inflamatório: 1. Agudo. 2. Crônico. 4...

Plantas medicinais e matérias-primas de plantas medicinais utilizadas na medicina para urolitíase

1.1 Classificação

A urolitíase pode ser classificada de acordo com a localização dos cálculos: cálculos renais e ureterais (nefroureterolitíase), cálculos vesicais. É possível subdividir a urolitíase de acordo com a composição dos cálculos...

Câncer de laringe

3.

Classificação

De acordo com a classificação nacional do câncer de laringe (Coleção de Instruções do Ministério da Saúde), existem 4 estágios: Estágio I: o tumor ocupa apenas parte de uma parte da laringe e não penetra mais profundamente que a camada submucosa...

Câncer de bexiga

2. Classificação

As neoplasias da bexiga são representadas principalmente pelo carcinoma de células transicionais.

Porém, para evitar erros de diagnóstico, não devemos esquecer que...

Carcinoma de esôfago

Classificação

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Carcinoma de células escamosas...

Feridas, classificação de feridas, antissepsia mecânica no tratamento de feridas

Classificação de feridas

Existem diversas classificações de feridas. Com base na natureza do dano tecidual, as feridas são diferenciadas: punção, corte, corte, machucado, rasgado, mordido, envenenado, tiro. As feridas perfurantes são infligidas com uma arma perfurante (baioneta, agulha, etc.)…

Fontes vegetais de tanino e seu uso na medicina

2.

Classificação

Todos os taninos são divididos em taninos: hidrolisáveis ​​e condensados. Os taninos hidrolisados, sob a ação de ácidos minerais diluídos, bases e enzimas tanino acil hidrolase, decompõem-se em carboidratos e ácidos fenolcarboxílicos...

Reabilitação de crianças com paralisia cerebral

1.2 Classificação da paralisia cerebral.

Atualmente na Federação Russa é utilizada a classificação de K.A..

Semenova (1974). - diplegia espástica - as pernas são predominantemente afetadas - hemiplegia dupla - tetraparesia espástica, os braços são afetados um pouco mais...

Poliartrite reumatóide

1. Classificação

A artrite reumatóide tem permanecido o foco de atenção da ciência reumatológica durante décadas, o que é um reflexo da grande importância da doença em termos médicos e sociais gerais...

O papel dos tratamentos não medicamentosos para asma brônquica

1.1.1 Classificação

A asma brônquica (AB) é dividida em fase de exacerbação (aumento da doença) e remissão (quando praticamente não há sinais da doença).

Durante uma crise de asma há um período de sinais de alerta (espirros, coriza, etc....

O papel do paramédico no diagnóstico, tratamento e prevenção do tétano. Medidas antiepidêmicas no surto de doenças infecciosas. Dinâmica e análise comparativa das doenças tetânicas na região de Salsk para o período 2013-2014.

1.4 Classificação

As características de classificação levam em consideração vários fatores - o mecanismo de infecção, a prevalência e gravidade da síndrome convulsiva e características do curso clínico.

Levando em consideração esses fatores, distinguem-se as seguintes formas de tétano: 1...

O papel do paramédico na organização e condução de medidas diagnósticas, terapêuticas e preventivas de combate à hipertensão

1.2 Classificação

Ao longo de todo o período de estudo da doença, mais de uma classificação da hipertensão foi desenvolvida: de acordo com a aparência do paciente, os motivos do aumento da pressão, a etiologia, o nível de pressão e sua estabilidade, o grau de lesão do órgão , a natureza do curso...

Diabetes

1.1 Classificação

Existem vários tipos de classificação do diabetes mellitus, que se baseiam no quadro clínico, etiologia, grau de compensação do metabolismo dos carboidratos, gravidade do tratamento, complicações...

Ensaio imunoenzimático (ELISA)– um teste laboratorial moderno que procura anticorpos específicos no sangue ou antígenos para doenças específicas, a fim de identificar não só a etiologia, mas também o estágio da doença.

Os resultados do ELISA podem ser fornecidos qualitativa e quantitativamente.

Atualmente, o ELISA é utilizado nas seguintes situações:

1) Pesquisa de anticorpos específicos para alguma doença infecciosa;
2) busca de antígenos de quaisquer doenças (infecciosas, venereológicas);
3) estudo do estado hormonal do paciente;
4) exame de marcadores tumorais;
5) exame para presença de doenças autoimunes.

Vantagens do método ELISA:

1) Alta especificidade e sensibilidade do método ELISA (mais de 90%).
2) Capacidade de determinar a doença e acompanhar a dinâmica do processo, ou seja, comparar o número de anticorpos em diferentes períodos de tempo.
3) Disponibilidade de diagnóstico ELISA em qualquer instituição médica.

Desvantagem relativa:

1) Detecção da resposta imune (anticorpos), mas não do patógeno em si.

Conceitos Básicos

Antes de esclarecermos a essência do método ELISA, vamos entender brevemente alguns conceitos.
Anticorpos (ou imunoglobulinas – Ig)- proteínas específicas produzidas por B -
linfócitos (células imunológicas) em resposta a qualquer patógeno infeccioso (vírus, bactérias, fungos, etc.) que entra no corpo.

Existem imunoglobulinas A (IgA), imunoglobulinas E (IgE), imunoglobulinas M (IgM), imunoglobulinas G (IgG), imunoglobulinas D (IgD). Eles diferem entre si na forma e peso molecular, meia-vida, participação/não participação em processos infecciosos e tempo de detecção a partir do momento da infecção. Se considerarmos o peso molecular, então o IgM tem o maior peso - é um pentâmero (950.000 daltons) em contraste com outras Igs (de 150 a 200.000 Da), devido ao qual o IgM simplesmente não consegue passar pela barreira placentária.

Portanto, a detecção de IgM em uma criança de 1 ano é sempre um sinal da presença de infecção no feto. No soro sanguíneo, a maior parte das imunoglobulinas é representada por IgG (75-85%) e a mais baixa é IgE (0,003%). Apenas IgA, M, G estão diretamente envolvidos no processo infeccioso.IgE é um sinal de reações alérgicas e doenças, e IgD só pode ser encontrada no tecido dos gânglios linfáticos e amígdalas e desempenha um papel na formação da imunidade local.

Aulas de imunoglobulina

Antígenos– substâncias de alto peso molecular de origem orgânica, em particular agentes patogénicos de doenças infecciosas e outras, bem como substâncias de várias células alteradas formadas durante uma determinada doença (doenças autoimunes, oncologia).

Complexo imunológico– um complexo antígeno-anticorpo envolvido no processo imunológico.

Em que se baseia o método ELISA?

Existem vários tipos de ELISA (método direto, indireto, de bloqueio, competitivo), mas na prática o imunoensaio heterogêneo de fase sólida ou ELISA (ensaio imunoenzimático) é o mais utilizado.

A base do imunoensaio enzimático é a reação imune de antígeno e anticorpo com a formação de um complexo imune: antígeno-anticorpo, que resulta em uma alteração na atividade enzimática de marcas específicas na superfície dos anticorpos.

A essência do método ELISA

Em termos simples, este processo pode ser dividido em várias etapas:

1) Na superfície dos poços do comprimido do médico que realiza o exame, existe um antígeno purificado de um determinado patógeno.

Quando é adicionado material biológico (soro sanguíneo) do paciente, ocorre uma reação específica entre esse antígeno e o anticorpo desejado (imunoglobulina). Este composto atuará como um “antígeno especial” na próxima etapa.

2) Nesta fase ocorre a formação de IC (complexos imunes) - uma reação entre um “antígeno especial” e um conjugado (esta é uma imunoglobulina marcada com a enzima peroxidase). Um cromogênio especial é adicionado. O resultado dessa reação enzimática é a formação de uma substância colorida no poço do comprimido, cuja intensidade de cor depende da quantidade de imunoglobulinas (anticorpos) contidas no material do paciente.

3) Em seguida, avalia-se o resultado: fotometria utilizando espectrofotômetro multicanal, comparação da densidade óptica do material em estudo com a densidade óptica das amostras controle, processamento matemático dos resultados.

A quantidade de anticorpos num paciente depende diretamente da altura da densidade óptica de um determinado poço.

Normalmente, placas de 96 poços são usadas na prática.

Ao medir a densidade óptica (DO) do líquido de teste, é calculada a quantidade (ou concentração) de anticorpos em uma determinada unidade de volume.

O resultado é então comparado com uma amostra de controle.

Precisa lembrar: Para cada sistema de teste são desenvolvidos indicadores individuais para registrar os resultados, indicadores de normalidade e patologia (ou seja, “valores de referência”). Isso deve ser levado em consideração na avaliação dos resultados de cada estudo específico. É incorreto interpretar os resultados de um laboratório com base nos “valores de referência” de outro laboratório.

Também é incorreto comparar os resultados de diferentes laboratórios entre si.

Ao realizar reações ELISA, o conceito de avidez de anticorpos também é importante.
Avidez de anticorpos- esta é a força da ligação entre o anticorpo e o antígeno e a quantidade de antígeno que está em relação com as imunoglobulinas (anticorpos).

A avidez é de grande importância na avaliação da duração esperada da infecção, o que é extremamente importante no diagnóstico da infecção primária em gestantes.

A base do teste de avidez de anticorpos consiste em tratar o complexo imune (antígeno-anticorpo) com uma solução de uréia para destruir a proteína.

Os vínculos de alta avidez permanecem intactos, enquanto os vínculos de baixa avidez são destruídos. O resultado é dado como um índice de avidez expresso em percentagem (%).

Quais doenças são detectadas pelo diagnóstico ELISA?

Marcadores de doenças autoimunes e indicadores de imunidade humana (IgE total, IgG total, IgA total, IgM total, IgD total, IgA secretora, IgG 2, IgG4, complexos imunes circulantes CEC, IgA e IgG para gliadina e outros)

3. Marcadores oncológicos (TNF - fator de necrose tumoral, CEA - antígeno carcinoembrionário, PSA - antígeno específico da próstata, hCG - gonadotrofina coriônica humana, CA 125, alveomucina e muitos outros)

Distúrbios reprodutivos (estradiol, progesterona, prolactina, testosterona, AFP-alfafetoproteína, FSH - hormônio folículo-estimulante e outros)

5. Doenças da glândula tireoide (T3 livre e ligado, T4, tireoglobulina, peroxidase tireoidiana - TPO, hormônio estimulador da tireoide - TSH).

Esta lista não representa todas as doenças diagnosticadas por imunoensaio enzimático.

Material para análise ELISA e regras para sua coleta

O material mais comum para a reação ELISA é o soro sanguíneo do paciente coletado com o estômago vazio.

O material também pode ser líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, conteúdo vítreo, muco do canal cervical e uretra, esfregaços.

Preparando pacientes para enviar material para ELISA

O sangue é coletado com o estômago vazio. Você não precisa tomar nenhum medicamento antes de doar sangue.

O imunoensaio enzimático do material é realizado rapidamente, em 24 horas.

Podem ocorrer atrasos em diferentes laboratórios devido ao acúmulo de certa quantidade de soro.

Possíveis resultados do diagnóstico ELISA

Ao avaliar os resultados de infecções específicas, a classe de anticorpos detectados e a sua quantidade são importantes.

Não só a questão da etiologia da infecção (se existe ou não), mas também o estágio esperado da doença (aguda, crônica), bem como a presença de infecção ativa (aguda ou exacerbação de crônica) no o tempo do exame depende disso.

Qual o prazo aproximado para o aparecimento de anticorpos (imunoglobulinas - Ig)?

Os primeiros anticorpos são IgM.

Ensaio imunoenzimático (ELISA)

Podem ser detectados 1 a 3 semanas após uma possível infecção, o que caracteriza a fase aguda do processo infeccioso. A segunda situação para o aparecimento de anticorpos IgM é a ativação (ou exacerbação) de um processo crônico. Os anticorpos IgM circulam em média durante cerca de 3 meses, depois o seu número desaparece gradualmente. No entanto, em alguns pacientes, vestígios de IgM podem ser detectados 1-2 anos após a infecção.

Os sistemas de teste modernos são altamente sensíveis, resultando em resultados falso-positivos inespecíficos (frequentemente em mulheres grávidas).

Portanto, neste grupo de pacientes, o IgM positivo deve ser verificado novamente!

Os anticorpos IgA aparecem 2 a 4 semanas após a infecção, mas em quantidades suficientes para serem detectados dentro de um mês. A IgA sérica é sintetizada pelas células plasmáticas do baço, gânglios linfáticos e membranas mucosas.A IgA secretora concentra-se nas membranas mucosas para desempenhar sua função protetora - elas participam da imunidade local.

A partir da 4ª semana após a infecção, os anticorpos IgG começam a aparecer.

Na maioria das infecções, seu título aumenta gradualmente até um máximo em momentos diferentes (em média após 1,5-2 meses), então o título permanece em um nível baixo e indica imunidade. Em algumas doenças (micoplasmose, clamídia, tricomoníase), o nível de IgG não é elevado e diminui significativamente devido à falta de imunidade nestas infecções.

Opções para detectar anticorpos de diferentes classes:

— A detecção isolada de anticorpos IgM sugere a presença de um primário
infecção.
— A detecção simultânea de IgM e IgG no sangue é característica da infecção primária
nos 2-3 meses anteriores, bem como durante a exacerbação de uma doença crônica.

Portanto, durante a gravidez, a presença de IgM nem sempre é sinal de infecção primária.
- A detecção de IgG isolada pode indicar imunidade a esta doença,
bem como para infecção crônica. Na segunda situação, tanto a quantidade de anticorpos (título) como a alteração deste título ao longo do tempo são importantes. Normalmente, os estudos são realizados em intervalos de 2 a 4 a 6 semanas.
— A detecção de IgA isolada ou com IgM indica uma infecção primária. No
O aparecimento de IgA junto com IgG sugere a ativação de uma infecção crônica (em média 2 semanas a partir do momento da exacerbação).

A determinação da avidez dos anticorpos IgG é uma excelente etapa complementar no diagnóstico de uma infecção primária a partir de uma infecção de longa data, que tem seu significado clínico, antes de tudo, na avaliação do risco de infecção intrauterina do feto.

A detecção de IgG de baixa avidez indica uma infecção primária e é detectada em média 4-6 meses após a infecção, raramente por mais tempo. IgG de baixa avidez requer outra confirmação laboratorial de infecção primária (IgM).

Anticorpos de alta avidez são um sinal de doença crônica e sua exacerbação ou de imunidade formada.

Recursos em bebês: em crianças de até um ano de idade, e às vezes até 1,5 anos, a IgG materna para várias infecções circula no sangue (ou seja, penetra através da placenta da mãe para o feto durante o desenvolvimento intrauterino).

Eles não são, por si só, um sinal da presença de infecção no presente. Se a IgM for detectada nesta idade (lembre-se de que a IgM materna não consegue penetrar na placenta), isso é um sinal de infecção intrauterina ou de uma infecção adquirida após o nascimento.

Método ELISA quantitativo

O resultado do diagnóstico ELISA (usando um analisador de imunoensaio enzimático) é fornecido em certas unidades de medida:
— Densidade óptica (DO) de uma amostra – a concentração de anticorpos específicos por unidade de volume.

Quanto maior for a DO da amostra, maior será a concentração de anticorpos. Alguns resultados referem-se ao coeficiente de positividade (CP), que também é a densidade óptica da amostra.
— Unidades de concentração de anticorpos (nanograma/mililitro ou ng/ml).

— Na forma de títulos séricos: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 e assim por diante. Os títulos diagnósticos (nos quais é feito o diagnóstico da doença, e não o fato da infecção) são diferentes para diferentes doenças.
— Na forma de símbolos – “+”, “-”, “?” (+, ++, +++, ++++).
— Sob a forma de avaliação qualitativa segundo um determinado critério (positivo ou negativo).

Só o médico pode avaliar corretamente o número de anticorpos, a opção de detecção da classe das imunoglobulinas e, com isso, definir o estágio da doença e a necessidade de tratamento.

Não devemos esquecer que para qualquer sistema de teste são desenvolvidos seus próprios “valores de referência” (variantes da norma), quando ultrapassados, é diagnosticada uma determinada doença (variantes da patologia).

Para diferentes sistemas de teste, os “valores de referência” são diferentes.

A comparação correta dos resultados de ELISA obtidos ao longo do tempo só é possível se forem produzidos no mesmo laboratório.

Médico infectologista N. I. Bykova

A análise ELISA (ensaio imunoenzimático) é um procedimento diagnóstico moderno que visa identificar anticorpos específicos no sangue para patógenos de diversas doenças, determinando o estágio de desenvolvimento da patologia e sua etiologia. É utilizado como método de monitoramento do processo de tratamento e sua eficácia. Durante o processo de pesquisa são analisados ​​indicadores qualitativos e quantitativos.

O método ELISA é altamente informativo, a precisão dos resultados é superior a 96%. Os diagnósticos estão disponíveis em quase todos os laboratórios e instituições médicas.

Principais indicações

Um imunoensaio enzimático é prescrito para confirmar a presença de doenças infecciosas sexualmente transmissíveis:

• tricomoníase;
• clamídia;
• ureaplasmose;
• sífilis, etc

O ELISA também é usado para diagnosticar doenças virais:

• herpes;
• herpes tipo 4 (vírus Epstein-Barr);
• hepatite viral;
• infecção por citomegalovírus.

Como se preparar para a pesquisa

O material biológico para pesquisa é o sangue. Poucos dias antes do teste, você não deve tomar medicamentos. Antibióticos, anti-helmínticos e antivirais são interrompidos em 14 dias.

O material é coletado pela manhã com o estômago vazio. Uma hora antes do procedimento, é permitido beber um copo de água sem gás, excluindo-se a ingestão de alimentos.

Características da análise

Para realizar o estudo, é coletado sangue venoso em um volume de pelo menos 5 ml. Em alguns casos, o líquido cefalorraquidiano, o líquido amniótico ou o conteúdo do corpo vítreo são utilizados como biomaterial.

A coleta de sangue é realizada com agulha de injeção, estritamente com o estômago vazio, para evitar resultados falsos positivos. Você deve parar de fumar e ingerir bebidas alcoólicas 12 horas antes. Ao usar substâncias entorpecentes, os resultados da análise são distorcidos.

Se a conclusão indicar valores negativos das imunoglobulinas G, A, M, isso indica a fase inicial do desenvolvimento do processo patológico ou sua ausência. Este resultado é registrado após recuperação completa após a terapia.

Um resultado negativo de IgM e IgA e um resultado positivo de IgG indicam a formação de imunidade após uma doença infecciosa ou vacinação.

Um resultado positivo de IgM e um resultado negativo ou positivo de IgG, IgA indicam a presença de uma patologia infecciosa aguda.

A análise ELISA é realizada com bastante rapidez, os resultados ficam prontos um dia após a coleta do material.

Contente

Para avaliar a capacidade do corpo de resistir a doenças infecciosas ou para determinar a fase da patologia, é utilizado um exame de sangue. O método ELISA ocupa um lugar importante entre os exames laboratoriais, pois ajuda a estudar de forma abrangente a atividade da função protetora do sangue, determinar a imunodeficiência em doenças infecciosas, doenças do sangue, processos hormonais e autoimunes.

O que é um exame de sangue por imunoensaio enzimático?

Este método refere-se a pesquisas laboratoriais que determinam a presença de fatores sanguíneos protetores de natureza proteica (anticorpos) para certos agentes patogênicos (antígenos). Um teste imunoenzimático detecta imunoglobulinas, que podem ser encontradas na forma de imunocomplexos. Eles aparecem quando ocorrem reações neuro-humorais complexas da defesa imunológica humana, que se tornam uma resposta à introdução de antígenos estranhos.

O corpo produz anticorpos específicos contra cada tipo de patógeno. Em seguida, o microrganismo patológico ou antígeno se liga e um composto complexo “antígeno-anticorpo” é formado. Em seguida, é neutralizado, ocorre a lise enzimática, ocorre uma reação de fagocitose e o processo termina com a remoção do corpo. A presença de complexos específicos, determinados por ELISA, indica o tipo de patógeno ou substância nociva do paciente.

Aulas de imunoglobulina

Os cientistas descobriram e estudaram 5 tipos de imunoglobulinas: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA. Existem outras classes, mas ainda estão em fase de pesquisa e seu papel não é totalmente compreendido. Na medicina prática são importantes A, M, G. O conteúdo da informação e a precisão da determinação baseiam-se nos intervalos de tempo em que aparecem, atingem o máximo e desaparecem.

Indicações para exames de sangue usando ELISA

Usando esta análise, você pode avaliar a eficácia do tratamento, realizar um estudo abrangente antes das operações de transplante, determinar o estado de imunodeficiência e anticorpos para mais de 600 tipos de alérgenos. O exame de sangue usando ELISA é usado como uma forma adicional de detectar células cancerígenas. Uma análise é prescrita se for necessário detectar anticorpos contra micróbios que provocam patologias sexualmente transmissíveis:

• tricomoníase;
• sífilis;
• toxoplasmose;
• micoplasmose;
• ureaplasmose.

No caso de infestações helmínticas, a análise ELISA indicará aumento na quantidade de imunoglobulinas. Estudos são realizados para confirmar se o paciente tem:

• Vírus de Epstein Barr;
• infecções herpéticas;
• citomegalovírus;
• grupo de hepatites virais.

Exame de sangue usando o método ELISA

O exame de sangue por imunoensaio enzimático não é a única opção para determinar imunoglobulinas. Às vezes, para este estudo, são coletados líquido cefalorraquidiano, tecido vítreo e líquido amniótico. Ao usar o sangue, ele é coletado da veia antecubital por meio de uma agulha de injeção. O teste deve ser feito com o estômago vazio, antes do ELISA não é recomendado tomar medicamentos que possam afetar o resultado. Você deve abandonar o álcool, o fumo e o uso de drogas antes de doar o biomaterial. Opções de resultados de teste:

1. Se as imunoglobulinas IgG, IgM, IgA forem negativas, os médicos dizem que não há patologia ou estágio inicial. O mesmo resultado (negativo) ocorrerá após recuperação completa após um longo período.
2. Se IgG for positivo, mas IgM e IgA não forem detectados, isso indica a formação de imunidade após a vacinação ou uma doença infecciosa.
3. Com altos títulos de IgM e IgA, IgG negativos, é feito o diagnóstico de doença infecciosa aguda.
4. Se IgG, IgM, IgA forem positivos, os médicos falam sobre a fase aguda de uma recaída de uma doença crônica existente.
5. Para uma infecção crônica que está em fase de remissão (remissão), o teste ELISA mostra títulos de IgM negativos, enquanto IgA e IgG serão positivos.

Vantagens e desvantagens da análise ELISA

O principal aspecto negativo deste estudo é a possibilidade de obtenção de resultados falsos positivos ou falsos negativos. O motivo da falta de confiabilidade é o uso de medicamentos e defeitos técnicos de laboratório. O processo de distúrbios metabólicos no corpo pode falsificar a análise. As principais vantagens da análise ELISA são:

• precisão, especificidade diagnóstica;
• baixo custo de análise;
• rapidez na obtenção de resultados;
• a possibilidade de monitoramento dinâmico do estágio da patologia e da eficácia do tratamento;
• facilidade de pesquisa;
• a capacidade de realizar exames em massa de focos de infecção;
• indolor, segurança para o paciente;
• aplicação no processamento de tecnologia da informação.

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Ensaio imunoabsorvente vinculado(ou ELISA, abreviadamente) é um teste laboratorial que ajuda a fazer um diagnóstico preciso, identificar doenças ocultas, determinar a predisposição para certas doenças e também monitorar a eficácia da terapia prescrita. Durante o estudo, antígenos característicos de patógenos específicos e anticorpos contra eles são detectados no soro sanguíneo do paciente.

Qual é o objetivo

Para compreender o princípio do ELISA, é necessário lembrar como funciona o sistema imunológico do corpo, o que são “antígenos” e “anticorpos” e quais funções eles desempenham.

Um antígeno é uma molécula que carrega certas informações sobre uma célula. Se um antígeno estranho entrar no corpo, anticorpos (ou imunoglobulinas (Ig), em resposta ao aparecimento de um microrganismo estranho no corpo, ligam-se a ele e reconhecem se é próprio ou estranho. Ao receber um “estranho” sinal, os anticorpos começam a destruir o objeto potencialmente perigoso. Essa interação “antígeno” -anticorpo" é chamada complexo imunológico. O método ELISA é baseado nele.

Indicações

A análise é amplamente utilizada para diagnosticar vários tipos de doenças. E o que é especialmente valioso é que este estudo diagnostica com bastante precisão doenças que ocorrem no corpo de forma latente, sem sintomas.

Com sua ajuda você pode identificar:

• doenças infecciosas sexualmente transmissíveis (clamídia, ureaplasmose, micoplasmose, sífilis, herpes, HIV, etc.);
• toxoplasmose, tuberculose, hepatite, sarampo, etc.;
• problemas autoimunes;
• oncologia;
• hormônios sexuais;
• hormônios da tireóide;
• alergias.

O ELISA pode até detectar marcadores de doenças cardíacas. Além disso, é prescrito para avaliar a eficácia do tratamento, bem como antes de certos tipos de intervenções cirúrgicas.

Preparação

O sangue para pesquisa é retirado de uma veia com o estômago vazio, de preferência pela manhã.

No dia anterior você deve abster-se de álcool, bebidas açucaradas, café e um jantar farto. Além disso, os resultados dos indicadores podem ser afetados pelo uso de determinados medicamentos, sendo necessária a consulta com seu médico.

Deve-se evitar fumar 4 horas antes do procedimento.

Exame de sangue imunoensaio enzimático na ON CLINIC

O centro médico internacional ON CLINIC está equipado com laboratório próprio, que possui certificado internacional de controle de qualidade. Aqui, especialistas experientes e qualificados realizam diversos tipos de análises (mais de 1000 itens).

Entre as vantagens desse método, destaca-se o fato de detectá-lo já nos estágios iniciais do desenvolvimento da doença. A sensibilidade do teste é de 90%. O estudo mostra com precisão a dinâmica do processo infeccioso, o que permite ao especialista monitorar a eficácia da terapia. Todo o processo é totalmente automatizado, o que elimina a influência do chamado “fator humano”.

Além disso, equipamentos de alta precisão permitem obter resultados de pesquisa confiáveis ​​em um período de tempo minimamente curto.

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ARTIGO FARMACOPÉICO GERAL

Apresentado pela primeira vez

Esta monografia farmacopéica geral aplica-se ao método de ensaio imunoenzimático (ELISA). O método ELISA é um método de imunodiagnóstico altamente sensível e altamente específico, que é utilizado para realizar a determinação qualitativa e quantitativa de diversas substâncias que possuem propriedades de um antígeno, hapteno (antígeno incompleto) ou anticorpo. O método ELISA é amplamente utilizado para o diagnóstico de doenças infecciosas e não infecciosas de humanos e animais e também pode ser utilizado para confirmar a qualidade de medicamentos imunobiológicos (IBPs).

O princípio do método é a interação específica de um antígeno com um anticorpo com a formação de um complexo imune e posterior detecção do complexo resultante por espectrofotometria, quimioluminescência e outras técnicas adequadas. A detecção pode ser direta (quando a própria substância teste tem atividade enzimática, ou é marcada com um rótulo enzimático), ou indireta ou indireta (quando a substância teste, ligada a anticorpos imobilizados na fase sólida, é incubada com enzima marcada anticorpos). A análise qualitativa permite obter informações sobre o conteúdo de antígeno ou anticorpo no material em estudo de acordo com o princípio “sim/”não”. Ao realizar uma análise quantitativa, a concentração de antígeno ou anticorpo no material de teste é determinada por meio de um gráfico de calibração.

DISPOSIÇÕES GERAIS

O método ELISA inclui 3 etapas principais: 1) formação de um complexo imune “antígeno (substância teste) – anticorpo específico para ele” ou vice-versa; 2) a formação de uma ligação entre o conjugado e o complexo imune formado na etapa anterior ou com sítios de ligação livres (determinantes); 3) transformação do substrato sob a ação de um marcador enzimático em um sinal gravado como resultado de uma reação bioquímica.

Todos os métodos de realização de imunoensaios enzimáticos são classificados como homogêneos ou heterogêneos.

Os métodos em que todas as 3 etapas do ELISA ocorrem em solução, e entre as etapas principais não há etapas adicionais de separação dos complexos imunes formados dos componentes que não reagiram, pertencem ao grupo dos métodos ELISA homogêneos. A base do ELISA homogêneo, utilizado, via de regra, para a determinação de substâncias de baixo peso molecular, é o processo de inibição da atividade de uma enzima quando ela se combina com um antígeno ou anticorpo. Como resultado da reação antígeno-anticorpo, a atividade enzimática é restaurada. Quando um complexo imune antígeno-anticorpo contendo um marcador enzimático é formado, a atividade da enzima é inibida em 95% em relação ao substrato de alto peso molecular, o que se deve à exclusão estérica do substrato do centro ativo da enzima. À medida que a concentração do antígeno aumenta, mais e mais anticorpos se ligam e permanecem cada vez mais conjugados antígeno-enzima livres, capazes de hidrolisar o substrato de alto peso molecular. O método ELISA homogêneo é muito rápido. Demora 1 minuto para analisar uma definição. A sensibilidade do método é bastante elevada. Pode ser usado para determinar uma substância no nível de picomol.

Os métodos heterogêneos são caracterizados pela análise em um sistema bifásico com a participação de uma fase transportadora sólida e uma etapa obrigatória de separação dos imunocomplexos dos componentes que não reagiram (lavagem), que estão em fases diferentes (os imunocomplexos formados estão no sólido fase e os complexos que não reagiram estão em solução). Os métodos heterogêneos nos quais a formação de complexos imunes no primeiro estágio ocorre na fase sólida são chamados de métodos de fase sólida.

Os métodos são classificados como homogêneo-heterogêneos se a etapa 1 - formação de complexos específicos - ocorrer em solução e, em seguida, uma fase sólida com reagente imobilizado for utilizada para separar os componentes.

O método ELISA heterogêneo consiste em 3 etapas principais:

• imobilização de um antígeno ou anticorpo em uma fase sólida, o complexo resultante é denominado imunoabsorvente;
• remoção do reagente não ligado e bloqueio dos locais de ligação num suporte sólido utilizando proteínas bloqueadoras, tais como albumina, caseína; incubação do medicamento analisado com imunossorvente para que ocorra sua ligação;

3) detecção pela atividade enzimática da própria substância teste ou por rótulo enzimático associado ao medicamento analisado (versão direta). Em alguns casos, é realizada incubação adicional do complexo “imunoabsorvente-substância teste” com anticorpos secundários conjugados a um marcador enzimático (opção indireta).

A determinação quantitativa da substância em estudo é realizada adicionando um substrato adequado ao detector utilizado e comparando o sinal da substância em estudo com uma amostra padrão.

O método ELISA heterogêneo é dividido em ELISA não competitivo e ELISA competitivo. Os esquemas de ensaio podem ser modificados durante o processo de desenvolvimento do medicamento de acordo com os requisitos necessários. As alterações devem ser indicadas na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória. A escolha do método ELISA depende da natureza da substância teste e da sua quantidade, uma vez que diferentes tipos de ELISA têm sensibilidades diferentes. Para avaliar a qualidade das substâncias que contêm anticorpos, é possível utilizar anticorpos anti-idiotípicos específicos.

Método ELISA não competitivo

O método ELISA não competitivo é dividido em vários tipos de acordo com o tipo de detecção (competitivo direto, competitivo indireto (indireto)) e de acordo com o tipo de substância imobilizada na fase sólida (antígeno ou anticorpo).

Opção ELISA direto

Pode ser feito de 2 maneiras. No primeiro caso, a substância teste (antígeno) é imobilizada diretamente na fase sólida; então o anticorpo marcado ligado ao antígeno é o detector. Ao realizar o teste de forma diferente, são utilizados anticorpos imobilizados na fase sólida. Neste caso, o detector é a substância teste marcada com uma enzima.

Versão indireta (indireta) do ELISA

Ao realizar a versão indireta do ELISA, o antígeno é imobilizado na fase sólida. Após o bloqueio, uma solução de anticorpos específicos é adicionada ao antígeno. Após a incubação, o complexo antígeno-anticorpo resultante é lavado dos anticorpos não ligados e é adicionada anti-imunoglobulina (anti-Ig) marcada com enzima, que atua como um detector. Os detectores anti-Ig estão disponíveis comercialmente para classes e subclasses específicas de Ig, tornando este formato de ensaio conveniente para isotipagem de anticorpos. Além disso, a utilização de anti-Ig marcado aumenta o sinal em comparação com o método de ensaio imunoenzimático direto, aumentando assim a sensibilidade do ensaio.

O método “sanduíche” como opção para realização de ELISA

O método não competitivo mais comum é o método sanduíche. Quando realizada, os anticorpos primários são imobilizados na fase sólida e posteriormente bloqueados. Em seguida, a substância teste contendo o antígeno é adicionada a eles e incubada. Após a incubação, o complexo antígeno-anticorpo é removido do antígeno não ligado e os anticorpos secundários marcados com uma enzima são adicionados e a detecção é realizada.

Método ELISA competitivo

O método ELISA competitivo é dividido em vários tipos: pelo tipo de detecção (competitivo direto, competitivo indireto (indireto)) e pelo tipo de substância imobilizada na fase sólida (antígeno ou anticorpo).

ELISA competitivo direto

Para detectar ou quantificar antígenos solúveis, utiliza-se uma versão competitiva direta do ELISA com um antígeno imobilizado na fase sólida. Para fazer isso, use anticorpos específicos do antígeno conjugados a um detector apropriado (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, rutênio ou fluoresceína). Um antígeno padrão é imobilizado na fase sólida, seguido de bloqueio. O anticorpo conjugado a um marcador enzimático é incubado com a substância teste (antígeno solúvel). Esta mistura é então adicionada ao antígeno imobilizado, incubada e depois lavada para remover o complexo antígeno-anticorpo não ligado. O próximo passo é adicionar um substrato adequado para a enzima que será usada como marcador. A inibição da reação devido à presença de 2 antígenos no sistema, em comparação com uma amostra controle sem antígeno solúvel competitivo, é inversamente proporcional à quantidade da substância teste.

O ELISA competitivo direto de anticorpos em fase sólida é semelhante ao ELISA competitivo direto de antígeno sólido, mas é usado para detectar ou quantificar anticorpos.

Variante ELISA competitiva indireta (indireta)

Este método ELISA é semelhante à versão competitiva direta, mas em vez de um anticorpo ou antígeno marcado, um reagente anti-Ig marcado ou anticorpos secundários marcados são usados ​​para detecção, respectivamente.

Condições gerais para a realização do métodoELISA

Diversos materiais são utilizados como fase sólida para imunoensaios enzimáticos: silicone, nitrocelulose, poliamidas, poliestireno, policloreto de vinila, polipropileno, acrílico e outros. A fase sólida pode ser as paredes de um tubo de ensaio, placas de 96 poços e outras placas, bolas, esferas, bem como nitrocelulose e outras membranas que absorvem proteínas ativamente. O princípio da imobilização (interação hidrofóbica, hidrofílica, covalente) depende da escolha da fase sólida. Na maioria das vezes, placas de microtitulação plásticas de 96 poços são usadas como fase sólida. O número de poços na placa pode variar. O comprimido pode ser transparente (detecção colorimétrica) ou fosco (detecção quimioluminescente, fluorimetria).

A imobilização deve ser realizada sem bolhas de ar no poço, pois a presença delas altera a leitura da densidade óptica. É possível utilizar reagentes imobilizados biotinilados. Neste caso, a reação utiliza estreptavidina e um marcador enzimático biotinilado. Este método é usado para amplificar o sinal. O tempo e a temperatura de imobilização, dependendo da natureza cinética, estabilidade e concentração do reagente, devem ser indicados na monografia farmacopeica e na documentação regulamentar.

Todas as etapas do imunoensaio enzimático, soluções de lavagem e bloqueio, intervalos de tempo e condições de temperatura para cada etapa, número de rotações por minuto para incubação em shaker, condições de detecção também devem ser especificados na monografia farmacopéica e na documentação regulatória.

Exemplos de métodos para alguns tipos de ELISA

Método ELISA indireto não competitivo

1. Sorção de antígeno. Adicione 0,1-0,5 μg de antígeno e 100 μl de solução tampão de carbonato-bicarbonato 0,05 M (pH 9,6) a cada poço de uma placa de 96 poços, a menos que indicado de outra forma na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória, e então realize a sorção em um temperatura de 4°C por 16 horas. É possível utilizar outras soluções tampão com valores de pH elevados. A incubação é realizada agitando num agitador de placas horizontal.

A lavagem (duas vezes) das moléculas de antígeno não ligadas é realizada com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo 0,1% de Tween-20 (300 μl por poço), salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar.

1. Bloqueio. Para bloquear locais de ligação inespecífica de antígenos ou anticorpos, os poços do comprimido são preenchidos com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopeica ou na documentação regulatória contendo uma solução de soro bovino a 1% albumina ou outras proteínas (caseína, gelatina, leite em pó, etc.) e incubar durante 10-15 minutos à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar).

III. Titulação de anticorpos específicos. Se for necessária uma avaliação quantitativa, a substância teste (antígeno ou anticorpo) é titulada em diluições seriadas em paralelo com a amostra padrão (RM).

A titulação pode ser realizada em fileiras horizontais e verticais da placa. Deve-se notar que a titulação de anticorpos é realizada se for necessário selecionar a concentração ideal de anticorpos ou determinar seu título. Se for determinada a concentração e/ou título ideal de anticorpos, então é utilizada a diluição recomendada para estes anticorpos (soro).

Ao titular, uma diluição pronta de anticorpos é adicionada ao primeiro poço da série - uma média de 1-10 μg por poço, depois a diluição sequencial dos anticorpos é realizada nos poços. A incubação com anticorpos específicos é realizada por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação em agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes usando solução salina tamponada com fosfato pH 9,0 contendo 0,1% de Tween-20.

1. Adição de anticorpos antiespécies (antiglobulina) conjugados a um marcador enzimático. Anticorpos policlonais antiespécies conjugados a um marcador enzimático são usados ​​como anticorpos detectores (secundários). Na maioria das vezes, são utilizados anticorpos de cabra ou coelho, específicos para a molécula inteira ou para os fragmentos Fc de anticorpos específicos. A concentração de anticorpos detectores é geralmente especificada pelo fabricante como uma diluição da solução estoque (por exemplo, 1:1000).

A incubação com anticorpos secundários marcados é realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação num agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo 0,1% de Tween-20.

A incubação é realizada durante 10 minutos à temperatura ambiente e agitação num agitador de placas horizontal.

1. 100 μl de solução de substrato são adicionados aos poços e incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e agitação constante. Para interromper a reação enzimática, é utilizado um “reagente de parada”, que é adicionado a todas as amostras de teste e controle em quantidades iguais. O ácido sulfúrico é mais frequentemente usado como “reagente de parada”.

Direto não competitivo Método ELISA

O método ELISA direto apresenta apenas pequenas diferenças em relação ao método ELISA indireto não competitivo. Assim, as etapas I e II são iguais nos dois tipos de análise. A diferença é que na versão direta do ELISA, no estágio III, são utilizados anticorpos específicos do antígeno teste, conjugados a um marcador enzimático, e interagem diretamente com a substância teste. Se necessário, a titulação dos conjugados também pode ser realizada de forma semelhante ao princípio descrito anteriormente para anticorpos não conjugados. A etapa IV do ELISA direto não competitivo não é realizada.

Método "sanduíche" ELISA

Esta versão do ELISA utiliza um par de anticorpos (primários e secundários) específicos para epítopos espacialmente distantes do antígeno em estudo.

1. Sorção de anticorpos na fase sólida. A técnica de sorção de antígeno é semelhante à técnica de sorção de anticorpos na seção “Método ELISA indireto não competitivo”.
2. Bloqueio. A técnica de bloqueio de sítios de ligação inespecíficos no substrato (fase sólida) é semelhante à técnica de bloqueio descrita na seção “Método ELISA indireto não competitivo”.

III. Incubação com antígeno. 50 μl da substância de teste e diluições padrão do antígeno são adicionados aos poços da placa com anticorpos pré-adsorvidos, salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar. As diluições do antígeno devem ser preparadas em solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, uma vez que o Tween-20 reduz a ligação inespecífica das moléculas de proteína entre si e com a superfície da placa. Tanto a substância de teste como as diluições padrão do antigénio são adicionadas aos pares em poços adjacentes numa fila horizontal (ou em 3 réplicas), utilizando 2 (3) poços para cada diluição de proteína.

A incubação é realizada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação constante. A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopéica ou documentação regulamentar.

1. Incubação com anticorpos conjugados a um marcador enzimático. 100 μl de uma solução de anticorpos específicos conjugados com um marcador enzimático são adicionados aos poços da placa. A concentração ideal de anticorpos conjugados é geralmente indicada na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória (geralmente é usada uma concentração de 2–4 μg/ml).

A incubação com anticorpos contendo um marcador enzimático é realizada por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação em um agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopéica ou documentação regulamentar.

1. Realização de uma reação enzimática acompanhada do aparecimento de um produto colorido. A técnica para realizar a reação enzimática é semelhante à técnica descrita na seção: “Método ELISA indireto não competitivo”.

Detecção

Como afirmado acima, os anticorpos marcados com um marcador enzimático ou outro reagente são utilizados para detecção. A etiqueta enzimática pode ser, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou galactosidase. Anticorpos ou antígenos com outros rótulos podem ser usados ​​como detector. A escolha do reagente detector depende do tipo de marcador conjugado ao anticorpo ou antígeno e do método de detecção.

Espectrofotometria, quimioluminescência, fluorimetria e outros métodos podem ser utilizados como métodos de detecção, com base na escolha do rótulo.

Resultados do método ELISA quantitativo

Os resultados quantitativos do ELISA são calculados a partir de uma curva de calibração linear com regressão inversa ou por um método complexo utilizando uma curva de calibração não linear com regressão inversa. O método de interpretação dos resultados depende do método ELISA utilizado. Por exemplo, os resultados do teste podem ser usados ​​para estimar a concentração de uma amostra desconhecida, a metade da concentração máxima de inibição ou a concentração eficaz usando uma curva de calibração. Isto permite determinar a quantidade da substância em estudo ou a sua atividade em comparação com um padrão de referência/calibração (RM). Normalmente, o tipo de curva de calibração ao realizar um método ELISA quantitativo, caracterizando a concentração do medicamento analisado, depende de forma não linear do valor médio calculado. Nesse sentido, recomenda-se a utilização de diversos modelos matemáticos para analisar a curva resultante. Noutros casos, o método ELISA é utilizado como um método qualitativo que permite avaliar a presença de uma determinada substância de teste numa amostra dentro dos limites de sensibilidade da técnica.

Observação.

Preparação de solução tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6). Adicionar 1,59 g de carbonato de sódio (anidro) ou 4,29 g de carbonato de sódio 10-aquoso e 2,93 g de bicarbonato de sódio em uma proveta com capacidade para 1000 ml, dissolver em 800 ml de água purificada, ajustar o pH para 9,6, misturar , em seguida, leve o volume da solução até a marca com água purificada e misture novamente.