Иммуноблоттинг (иммуноблот) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РИГА или ИФА. Иммуноблоттинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов -появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

ООО "Лабораторная диагностика" использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы "EUROIMMUN" (Германия), "MIKROGEN" (Германия):

ВПГ 1 и ВПГ 2 IgM/IgG (герпесвирусная инфекция)

ЦМВ IgM/IgG (цитомегаловирусная инфекция)

Краснуха IgG

TORCH-профиль IgM (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

ВЭБ IgMTIgG (вирусная инфекция Эпштейна-Барра)

ВГС IgG (вирусный гепатит С)

Используют наборы двух типов - вестерн-блот и лайн-блот.

Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы. На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Лайн-блот: В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе.

Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. Современный высокочувствительный метод заключается в идентификации белков, в том числе вирусных антигенов. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:

1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины, этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE; разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;

2) разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на
нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; во многих случаях, но
не всегда, при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

3) на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные
антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для
обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую
меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг
аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.

Следует иметь в виду, что в данной постановке иммуноблотинга белки находятся в денатурированном состоянии, и поэтому могут не распознаваться антителами, специфическими по отношению к нативному белку, но зато при наличии сывороток ко всем составляющим пептидам одновременно выявляется весь антигенный спектр испытуемого белка. Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами. Высокая разрешающая способность иммуноблотинга позволяет получать хорошие результаты и в диагностической практике, когда требуется идентифицировать вирус в тканях или экскретах больного.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,- РНК и белок - блоттинг.

Иммунохимическое выявление антигенов можно проводить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В качестве метки в последнее время широко применяют либо радиоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого, в основном, составляет 1-3 ч, для некоторых высокомолекулярных белков- более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от антигена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследования.

Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам возбудителя позволяет оценить значимость этих антител (специфичность для данного этиологического агента), исключить реакцию на перекрестные антигены. Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут быть использованы различные комбинации антигенных детерминант - как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции с другими возбудителями. В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в случае иммуноблоттинга это доказательно

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наибольшее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода - возможность тестирования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в антигены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному количеству нанесенного на гель антигена, которое при фракционировании белков удается выявить иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом носителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.

Большие трудности интерпретации результатов перекресных при реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии. В первой ситуации при повторном исследовании через промежуток определенный времени антитела не выявляются, а во в втором иммуноблоте появляются новые полосы, свидетельствующие о антител появлении к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя ответной динамику иммунной реакции на антигены вируса.

Является фактически конечным верификационным методом в цепи серологических исследований, позволяющих сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности пациента или же отвергнуть таковую. Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза заранее перенесены белки ВИЧ в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела испытываемых сывороток взаимодействуют с белками определенных зонах полоски. Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски (стрипа) конъюгатом и хромоген-субстратом с отмыванием не связавшихся компонентов и прекращением реакции дистиллированной водой. Предварительное электрофоретическое разделение белков и их фиксация на нитроцеллюлозе позволяет идентифицировать антитела к конкретным белкам в соответствии с наличием (или отсутствием) окрашивания (серовато-голубого) соответствующих зон полоски. Иммуноблотинг не может использоваться для массового скрининг исследования вследствие высокой стоимости и является методом индивидуального арбитража на заключительном этапе серологического исследования.

Существует достаточно четкие корреляции между результатами исследования сывороток в ИБ и ИФА. Дважды положительные в ИФА (в разных тест-системах) сыворотки интерпретируются затем в ИБ как ВИЧ-позитивные в 97-98% случаев. Сыворотки, положительные в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-системах, оказываются ВИЧ-позитивными в ИБ не чаще, чем в 4% случаев. При проведении подтверждающих исследований около 5% ИБ могут давать так называемые "неопределенные" результаты, которым, как правило, соответствуют положительные ИФА, но не РИП. Примерно в 20% случаев "неопределенные" ИБ вызывают антитела к gag- белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). При получении сомнительных результатов иммуноблотинга необходимо исследование повторить через 3 месяца и при сохранении неопределённости результата - через 6 месяцев.

Радио-иммунный метод (РИМ)(Радиоиммунологический анализ, РИА) Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

С помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” - Австрия II-I 125 удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0, 1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”). Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках - радиоспектрометрах. Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции. Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Таблица 1.Классификация вакцин

Список литературы:

Обязательная:

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А.,Сидорович И.Г. Иммунология:Учебник.-М.:Медицина,2000.- 432 с: ил.(Учеб. лит. для студ. медвузов).

2. Ковальчук Л.В и др. Иммунология: практикум: учеб. пособие – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 с.

3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 768 с.

4. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.

Дополнительная:

1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов.- 3-е издание, испр. и доп. – СПб, СпецЛит. 2002. – 591 с.

3. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.

4. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.

альная гипотензия, тахикардия, одышка, цианоз. При тяжёлом течении болезни возможны кровотечение, рвота с примесью крови. Печень и селезёнка увеличены. Отмечают олигурию. Температура остаётся постоянно высокой течение 3–10 дней. В периферической крови - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом формулы влево. Помимо описанных общих проявлений чумы, развиваются поражения, характерные для отдельных клинических форм болезни.

Кожная форма встречается редко (3–5%). На месте входных ворот инфекции появляется пятно, затем папула, везикула (фликтена), заполненная серозногеморрагическим содержимым, окружённая инфильтрированной зоной с гиперемией и отёком. Фликтена отличается резкой болезненностью. При вскрытии её образуется язва с тёмным струпом на дне. Чумная язва отличается длительным течением, заживает медленно, образуя рубец. Если эта форма осложняется септицемией, возникают вторичные пустулы и язвы. Возможно развитие регионарного бубона (кожно-бубонная форма).

Бубонная форма встречается чаще всего (около 80%) и отличается относительной доброкачественностью течения. С первых дней болезни в области регионарных лимфатических узлов появляется резкая болезненность, что затрудняет движения и заставляет больного принимать вынужденное положение. Первичный бубон, как правило, бывает одиночным, реже наблюдаются множественные бубоны. В большинстве случаев поражаются паховые и бедренные, несколько реже подмышечные и шейные лимфатические узлы. Размеры бубона варьируют от грецкого ореха до яблока средних размеров. Яркие особенности - резкая болезненность, плотная консистенция, спаянность с подлежащими тканями, сглаженность контуров из-за развития периаденита. Бубон начинает формироваться на второй день болезни. По мере развития кожа над ним краснеет, блестит, часто имеет цианотичный оттенок. В начале он плотный, затем происходит его размягчение, появляется флюктуация, контуры становятся нечёткими. На 10–12-й день болезни он вскрывается - образуется свищ, изъязвление. При доброкачественном течении болезни и современной антибиотикотерапии наблюдают его рассасывание или склерозирование. В результате гематогенного заноса возбудителя могут формироваться вторичные бубоны, которые появляются позже и отличаются незначительными размерами, меньшей болезненностью и, как правило, не нагнаиваются. Грозным осложнением этой формы может быть развитие вторичной лёгочной или вторичной септической формы, что резко ухудшает состояние больного, вплоть до летального исхода.

Первично-лёгочная форма встречается редко, в периоды эпидемий в 5–10% случаев и представляет собой наиболее опасную в эпидемиологическом отношении и тяжёлую клиническую форму болезни. Начинается она остро, бурно. На фоне резко выраженного интоксикационного синдрома с первых дней появляются сухой кашель, сильная одышка, режущие боли в груди. Кашель затем становится продуктивным, с выделением мокроты, количество которой может варьировать от нескольких плевков до огромных количеств, она редко отсутствует вообще. Мокрота, вначале пенистая, стекловидная, прозрачная, затем приобретает кровянистый вид, позже становится чисто кровавой, содержит огромное количество чумных бактерий. Обычно она бывает жидкой консистенции - один из диагностических признаков. Физикальные данные скудные: небольшое укорочение перкуторного звука над поражённой долей, при аускультации необильные мелкопузырчатые хрипы, что явно не соответствует общему тяжёлому состоянию больного. Терминальный период характеризуется нарастанием одышки, цианоза, развитием сопора, отёка лёгких и ИТШ. АД падает, пульс учащается и становится нитевидным, тоны сердца глухими, гипертермия сменяется гипотермией. В отсутствие лечения заболевание в течение 2–6 сут заканчивается летально. При раннем применении антибиотиков течение болезни доброкачественное, мало отличается

Описание

Метод определения Иммуноблот.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антинуклерные антитела представляют семейство аутоантител, связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, а также часто отмечаются при аутоиммунных заболеваниях печени и ряде других состояний. На сегодняшний день охарактеризованы около 200 разновидностей этого семейства аутоантител, но не все они могут быть использованы в клинической практике.

Иммуноблот антинуклеарных антител позволяет в одном тесте одновременно провести исследование 15 основных разновидностей антинуклеарных антител, что обеспечивает проведение дифференциальной диагностики основных системных ревматических заболеваний. Каждая разновидность аутоантител, выявляемая с помощью иммуноблота, обычно отмечается у пациентов с характерной клинической картиной, поэтому спектр аутоантител позволяет не только диагностировать заболевание, но и установить риск развития определенных клинических проявлений.

Иммуноблот антинуклеарных антител целесообразно использовать на втором этапе серологического обследования при положительном результате других тестов, указывающих на присутствие в сыворотке обследуемого антинуклеарных антител. К таким тестам относятся определение антиядерных антител (скрининг ИФА ), выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на клетках Hep2 (), антинуклеарных антител и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА, ).

Метод иммуноблота антинуклеарных антител в диагностике системных ревматических заболеваний характеризуется высокой клинической специфичностью. Но специфику антинуклеарных антител даже при высоких титрах АНФ () удается установить не всегда, поскольку до сих пор остаются неохарактеризоваными ряд антигенов антинуклеарных антител. Отрицательный результат иммуноблота в этом случае не исключает диагноза системных ревматических заболеваний. Ряд антинуклеарных антител можно выявить с помощью иммуноблота - панель миозит-специфичных аутоантител () и иммуноблота - панель аутоантител при склеродермии ().

Литература

1. Лапин С.В. Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний/ Издательство «Человек», СПб - 2010. 272 c.
2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. Клинические рекомендации / БХМ, М - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008. 598 p.
7. Инструкции к набору реагентов.

Подготовка

Предпочтительно выдержать 4 часа после последнего приема пищи, обязательных требований нет.

Показания к назначению

Тест показан для диагностики и дифференциальной диагностики следующих состояний:

• системная красная волчанка;
• подострая кожная волчанка и другие разновидности кожной волчанки;
• смешанное заболевание соединительной ткани;
• синдром Шегрена и ассоциированные заболевания;
• диффузная и локализованная склеродермия, CREST-синдром;
• воспалительные миопатии (полимиозит и дерматомиозит);
• ювенильный хронический артрит;
• аутоиммунный гепатит;
• первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит;
• использование данного теста показано при обнаружении высоких титров антинуклеарного фактора, антинуклеарных антител, антител к экстрагируемому ядерному антигену, антител к ДНК, антител к нуклеосомам и антифосфолипидных антител.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: качественный тест, результат представляют в форме «обнаружено» или «не обнаружено».

При обнаружении полосы, характеризующей наличие какого-либо вида антител, интенсивность окраски полосы дополнительно описывают количеством плюсов («крестов») для каждого из выявленных видов антител. Увеличение степени позитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.

Референсные значения: антитела к Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1 не обнаружены.

Результат определения аутоантител представляется в «крестах» для каждого соответствующего антигена. Увеличение степени серопозитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител. Варианты результата оценки серопозитивности приведены ниже:

1. Антитела не обнаружены.
2. +/- - пограничный результат;
3. + – низкое содержание аутоантител к специфическому антигену;
4. ++ – среднее содержание аутоантител к специфическому антигену;
5. +++ – высокое содержание аутоантител к специфическому антигену.

Основные заболевания, связанные с выявлением антинуклеарных антител:

Иммуноблоттинг – (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).

Радиоиммунный анализ (РИА)

В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Реакции иммунитета

Работа студента на практическом занятии

Работу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже).

1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках.

2. Реакция связывания комплемента

а) разобрать РСК по таблице;

б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы;

в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия);

г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК;

д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке.

3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите – что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется.

5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию – результат реакции.

6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции.

7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию – результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

Иммуноблоттинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.

Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.

Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).

В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.

Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.

Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.

По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».

Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.

Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.

Иммуноблоттинг

Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.

Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.

В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.

Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.

Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

Иммуноблоттинг - дополнительный непрямой метод

Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.

Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ - р24, gp41 и gp 120 (рис.37).

РИСУНКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.

2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.

вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М. : Гэотар Медиа, 2010. .

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.

Дополнительная литература

1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.

Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.

2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.

Главная » Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.

Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация

Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.

Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.

Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Цель

Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.

В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.

Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)

Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.

Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.

Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.

Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.

Особенности

Анализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.

Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента. Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к

Что это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?

Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция. Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.

Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы: быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.

Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.

За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.

Где сделать анализ?

Где я могу пройти тестирование на ВИЧ?

ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?

Как провести ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.

После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.

Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.

В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость

Сколько анализ? Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.

В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Интерпретация результатов

Наиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.

Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.

Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.

Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».

Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.

Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.

Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.

Что такое вестерн-блоттинг?

Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.

В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.

Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.

После проведения ДСН - электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.

51. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха-низм, компоненты, применение.

Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.

После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.

1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).

Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.

Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.

Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.

Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.

Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.

Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.

Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.

Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А - с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б - первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.

Протокол:

I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).

Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.

После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.

Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.

II. Электроперенос

Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.

Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.

III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко).

После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител.

Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном.

По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.

После тщательной отмывки (минимум 5 - 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6.

Инкубацию проводят при перемешивании 5 - 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.

Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!

Иммуноблот на ВИЧ позволяет обнаружить антитела к вирусным белкам, помещенным на специальную нитроцеллюлозную мембрану. Это высокоточное исследование, устанавливающее наличие фракций, в которых основные белки располагаются в виде небольших полос.

Оболочка вируса ВИЧ-1 содержит гликопротеины с молекулярной массой от 41 кд до 160 кд (килодальтона). Большое значение для проведения иммунного блоттинга имеет гликопротеин ВИЧ-2 с молекулярным весом от 32 кд до 140 кд. Белки сердцевины ВИЧ-1 и ферменты вируса представлены протеинами р17, р24, р55.

Возбудитель ВИЧ-2 состоит из белков, обозначаемых как р16, р25, р56. Они образуют его внутреннюю оболочку. В состав генома входят 6 регуляторных и 3 структурных гена. Нередко при делении клеток возникают генетические неточности и появляется несколько подтипов возбудителя.

Положительные пробы

Для исключения ошибок при лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции пациенту назначают дополнительное исследование. Его результаты интегрируются как положительные, если обнаружены антитела к 2 или 3 белкам ВИЧ-1 или ВИЧ-2.

Иммуноблот подтверждает все хорошие результаты ИФА. В этом случае обнаруживают антитела к gp120/160, gp41 или р24, которые являются структурными единицами трех основных генов СПИДа — gag, pol, and env. У некоторых пациентов, имеющих отрицательные результаты ИФА и ПЦР, иммуноблот показывает несколько положительных полосок. Врач назначает дополнительное исследование р24 для постановки правильного диагноза и исключения ранней фазы ВИЧ-инфекции.

Если полученные результаты подвергаются сомнению, больному предлагают повторять сдачу анализа в течение последующих 3 месяцев. Почти все случаи заболевания ВИЧ подтверждают с помощью системы для проведения иммуноблота — прибора Sanofi. В большинстве случаев обнаруживают антигены ВИЧ, белки р25, gp110/120 и gp160, указывающие на инфицирование вирусом. Ложноположительная проба регистрируется у пациентов, страдающих заболеваниями соединительной ткани, имеющих повышенный уровень билирубина, при взаимодействии с различными вирусными антигенами.

Негативный результат

В случае недостатка положительных линий, соответствующих белкам вируса СПИДа, иммуноблот расшифровывают как отрицательный результат. Анализ однозначно подтверждает отсутствие заражения вирусом иммунодефицита или указывает на «период окна». Если иммуноблот дает отрицательный результат, человек не является носителем вируса СПИДа.

Для исследования берут образцы сыворотки крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Их хранят в замороженном виде при температуре -20°С. Анализ проводят с помощью тест-систем:

• Антиген;
• Рекомбинат-ВИЧ;
• Пептоскрин.

Регистрация отрицательного результата указывает на отсутствие в сыворотке антител к оболочечным гликопротеинам ВИЧ gp120, gp160, Sp41.

Нередко больного интересует вопрос, может ли быть отрицательный результат иммуноблота на ВИЧ у пациента, имеющего инфицированного сексуального партнера. После проведенного исследования нередко получают сомнительный результат или фиксируются антитела к белкам gp120 и gp160, что указывает на полное отсутствие отрицательных данных. Иногда сомнительный ответ регистрируют у пациентов с бессимптомно протекающей инфекцией.

Неинтерпретируемые результаты

Анализ, проведенный с помощью различных тестов на антитела к ВИЧ-инфекции, иногда не соответствует отрицательным данным и не отвечает критериям серопозитивности. Врачу трудно установить причину появления сомнительного результата.

Некоторые больные не входят в группу риска по инфицированию ВИЧ. Врач может ошибаться в интерпретации результатов исследования в том случае, если инфицирование вызвано другим серотипом.

Сыворотку крови пациента необходимо исследовать в динамике. Если в течение 6 месяцев не наблюдают клинических проявлений СПИДа и отсутствуют факторы риска, у больного регистрируют отсутствие инфекции.

Сомнительные результаты анализа получают у пациентов, имеющих низкий риск инфицирования. В некоторых случаях появление неясных данных вызывают содержащиеся в сыворотке крови иммунные комплексы и аутоантитела.

У некоторых больных возникновение сомнительных результатов вызвано развитием патологических процессов:

• инфекционных заболеваний;
• раковой опухоли;
• аллергической реакции.

У больного появляются изменения в клиническом анализе крови, наблюдают рост С-реактивного белка или повышение СОЭ. У людей, страдающих инфекционными заболеваниями, часто выявляют сомнительную реакцию иммуноблота на ВИЧ.

Пациенты с неопределенными результатами не могут являться донорами крови и биологических материалов.

Линейный метод

Принцип иммуноблоттинга включает:

1. Использование нативного вирусного вещества ВИЧ-формат или антигенов в формате Western -Blot.
2. Соединение белков ВИЧ с отдельными антителами, выявленными в сыворотке крови.
3. Процесс инкубации, происходящий с добавлением меченных антител к человеческим Ig.
4. Расшифровку окрашенных полос.

Анализ позволяет врачу своевременно провести интерпретацию результатов исследования. Положительный блот расшифровывают как 2ENV+/- GAG+/POL, неопределенный — 1 ENV+/- GAG+/POL. Отрицательный результат предусматривает отсутствие полос.

Для выполнения анализа применяют рекомбинантный и лизатный иммуноблот. Исследование является специфичным и составляет 99,5%.

Может ли результат анализа быть расшифрован как ложный, интересуются больные. Полученные данные могут быть сформированы в результате стимуляции защитных сил организма (беременности, гемодиализа). При подозрении на острый ретровирусный синдром и контакт с больным ВИЧ-инфекцией пациенту рекомендуют сдать сыворотку на реакцию ПЦР. Повторное серологическое исследование подтверждается путем измерения вирусной нагрузки в представленном образе биологического материала.

Диагностика ВИЧ у новорожденных

Анализ на СПИД у ребенка раннего возраста проводят в том случае, если установлен контакт с ВИЧ-инфицированной матерью. Серологические реакции могут быть положительными в течение 1,5 лет. Антитела в сыворотке крови новорожденного обнаруживают с помощью реакций ИФА, РИФ и иммунного блоттинга.

В течение 9 месяцев жизни ребенка положительный результат появляется в связи с наличием в сыворотке крови антител матери. Антиген р24 имеет специфичность около 65%. В некоторых случаях не удается обнаружить антитела у больного ребенка, если у него диагностировано врожденное низкое содержание глобулинов в крови. Установленный отрицательный результат иммуноблота не является гарантией отсутствия инфекции.

Тестирование проводят в несколько этапов:

• на 1-2 сутки после рождения;
• в 1-2 месяца;
• в полугодовалом возрасте.

Дальнейшее изучение антител проводят до тех пор, пока не будут получены 2 отрицательных результата иммуноблота. Установление диагноза СПИД у ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной женщины, возможно на основании 2 положительных результатов реакции ПЦР. Передача новорожденному возбудителя ВИЧ-инфекции исключена, если женщина не кормит ребенка грудью.

Исследование при беременности

Будущей матери назначают иммунный и линейный блоттинг, если получен положительный результат на ВИЧ методом ИФА. Если блот подтвержден, пациентка больна СПИДом. В этом случае начиная с 14 недели беременности назначают терапию, предупреждающую инфицирование ребенка.

Может ли ошибиться специалист при выполнении исследования сыворотки крови во время беременности, спрашивают пациентки у лечащего врача. Он обязан выдать на руки беременной женщине копии анализов ПЦР, ИФА для устранения сомнений в их достоверности.

При постановке иммуноблота иногда возникают проблемы, но если ИФА, блот и ПЦР — положительные, диагноз ВИЧ-инфекции подтверждается окончательно. Вероятность получения ложноположительного анализа при беременности велика. В случае если ИФА (+), а иммуноблот (-), женщине предлагают пересдать сыворотку крови.

В обменной карте беременной указывают результат исследования. При его положительном значении женщине запрещают кормить ребенка после родов, чтобы не заразить вирусом СПИДа. Окончательные выводы делают на основании лабораторных, клинических и эпидемиологических исследований. Только после их расшифровки больному ставят диагноз «ВИЧ-инфекция».

Вконтакте