22.09.2019

Люминесцентная микроскопия

Возбуждённых атомов и молекул образца. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.

Энциклопедичный YouTube

1 / 3

✪ Флюоресцентная микроскопия: от клетки до молекулы

✪ Флуоресцентная микроскопия (опухоль головного мозга)

✪ Patrushev about super resolved fluorescence microscopy

Субтитры

Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Во флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой , а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может быть сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов - двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) основан на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающем критический (1/n). Интенсивность излучения, проникающего во вторую среду затухает по экспоненциальному закону, что позволяет детектировать флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм . Таким образом, TIRFM может по праву считаться одним из методов флуоресцентной наноскопии. В биологии метод используется для визуализации плазматической мембраны и примембранных структур клеток.

Флуоресцентная наноскопия

В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного разрешения ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином флуоресцентная наноскопия.

Системы флуоресцентной наноскопии построены на трёх принципиально различающихся подходах:

улучшение фокусировки за счёт создания новых оптических схем и применения объективов с высокой угловой апертурой (4Pi, I5M и I5S микроскопия);
использование явления полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM);
контролируемое «включение» и «выключение» флуоресцентных молекул и последовательное их детектирование (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Можно предвидеть несколько приложений флуоресцентных наноскопических методов в биологии и медицине. Наноскопия позволяет напрямую изучать взаимодействия между

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ (лат. lumen, luminis _ свет; греч, mikros малый + skopeo рассматривать, исследовать; син. флюоресцентная микроскопия ) - метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав. Люминесценция (см.) возбуждается коротковолновой (сине-фиолетовой) частью видимого света либо ультрафиолетовыми лучами с длиной волны, близкой к видимому свету. Цвет люминесценции, т. е. длина волны излучаемого света, зависит от химической структуры и от физикохимического состояния микроскопируемого объекта, что и обусловливает возможность использования Л. м. в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клетки. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведенная, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями - флюорохрома-ми. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках (напр., флюоресцеин), другие -избирательно связываются с определенными структурами клетки или даже с определенными хим. веществами. Эта способность флюорохромов к избирательному окрашиванию позволяет проводить люминесцентно-цитол. и люминесцентно-цитохим. исследования.

В истории развития Л. м. выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:

1) доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа; 2) создание в 1911 г. люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М. С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток; 3) применение сильно разбавленных р-ров флюорохромов, избирательно связывающихся с определенными структурами клеток [Хайтингер (М. Haitinger, 1933- 1935)], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер (S. Strugger), 1940]; 4) разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки (E. М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953) и выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе (МЛ-1, МЛ-2, ОИ-17); 5) создание метода иммунофлюоресценции (см.), нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико-биол. исследований [Кунс (А. Н. Goons), 1942, 1950].

В СССР значительный вклад в развитие и распространение Л. м. в медико-биол. исследованиях сделан М. Н. Мейселем.

Для проведения Л. м. применяют либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биол, микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов (см. Микроскоп). Устройство люминесцентных микроскопов основано на некоторых физ. законах люминесценции. Один из них - закон Стокса, согласно к-рому максимум спектра люминесценции смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждающего света. Это позволяет использовать для Л. м. принцип скрещенных светофильтров, который заключается в том, что коротковолновое световое излучение (ультрафиолетовое, сине-фиолетовое), возбуждающее люминесценцию, выделяется возбуждающим светофильтром, помещенным перед осветителем микроскопа. После прохождения препарата, в к-ром возбуждается люминесценция, этот свет полностью поглощается запирающим светофильтром, пропускающим более длинноволновый свет люминесценции.

Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения к-рого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой (или набором таких пластинок), применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак-иллюминатор, используемая в отечественных люминесцентных микроскопах (а в последнее время и в люминесцентных микроскопах, выпускаемых зарубежными фирмами), имеет ряд существенных преимуществ: 1) интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции; 2) объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещенность препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвертой степени апертуры объектива; 3) люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа. Источниками освещения для Л. м. чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-галогенные лампы накаливания. В качестве светофильтра применяют окрашенное в массе оптическое стекло или используют интерференционные светофильтры, имеющие лучшие спектральные характеристики.

Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами- лазерами, излучение которых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.

Поскольку для возбуждения люминесценции при Л. м. обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зеленую область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычную стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стекла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям.

В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный р-р глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт и др.).

Наряду с визуальной оценкой люминесцентно - микроскопического изображения применяют его микрофотографирование (см. Микрофотография). Люминесцентная микрофотосъемка имеет ряд особенностей. С одной стороны, недостаточная яркость свечения требует длительной экспозиции, с другой - под влиянием возбуждающего света интенсивность люминесценции быстро снижается, препараты выцветают, живые клетки повреждаются, погибают, и поэтому невозможно регистрировать динамику процессов, происходящих в клетках. Для преодоления этих затруднений необходимо использовать фотоматериалы с высокой общей и избирательной спектральной чувствительностью, высокоапертурные объективы, оку-ляры с минимальным собственным увеличением, однако достаточным для передачи деталей объекта, малоформатные микрофотонасадки. Возможна также обработка препаратов веществами, уменьшающими выцветание (гидрохиноном и т. д.).

М. Я. Корном и М. М. Бутсловым с сотр. (1968) разработана аппаратура и методика цветной люминесцентной микрофото- и киносъемки с использованием электронно-оптических усилителей яркости, позволяющих на несколько порядков уменьшить экспозицию и проводить регистрацию динамики процессов, происходящих в живых клетках.

Для количественной регистрации интенсивности люминесценции структур микрообъектов - цитофлюориметрии - применяют преимущественно фотоэлектрические методы с использованием фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в качестве чувствительного регистрирующего прибора (см. Фотоумножители). Используют также метод регистрации интенсивности люминесценции клеток и их структур в определенных участках спектра - цитоспектрофлюориметрию. Преимущества цитофлюориметрии перед абсорбционной цитофотометрией - ее более высокая чувствительность, отсутствие влияния характера распределения вещества в клетке пли структуре клетки на результаты измерений.

Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюориметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование - окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.

Отечественная промышленность выпускает различную аппаратуру для Л. м. Наиболее широко используется микроскоп МЛ-2, выпускаемый в нескольких вариантах. Производится также серия унифицированных люминесцентных микроскопов «Люмам», а также люминесцентные осветители с кварцевыми галогенными лампами (ОИ-28, ОИ-30).

Микроскопы серии «Люмам» состоят из унифицированных узлов, различные комбинации которых позволяют получить три рабочие модели (Р1 - РЗ) и три исследовательские (И1 - И3), отличающиеся друг от друга комплектацией и возможностями использования (рис.).

Осветители ОИ-28 и ОИ-30 устанавливают на обычные биологические микроскопы; они предназначены для освещения объектов сверху через опак-иллюминатор светом, возбуждающим видимую люминесценцию.

Осветитель ОИ-30 отличается тем, что в его комплект входят контактные объективы.

Л. м. широко применяют в вирусологии, микробиологии, гематологии, клин, цитодиагностике (особенно в онкологии для обнаружения малигнизированных клеток), в цитогенетике для изучения хромосом. С этой целью на протяжении длительного времени используют флюорохром акридиновый оранжевый; применяют также флюорохромы бромистый этидий (этидиум бромид) и йодистый пропидий (припидиум йодид), преимущественно для цитофлюориметрии ДНК, а также люминесцентные варианты реакции Фейльгена. Акридиновый оранжевый получил распространение в люминесцентной микроскопии нуклеопротеидов благодаря тому, что комплексы, образованные этим флюорохромом с двуспиральной ДНК, обладают зеленой люминесценцией, а комплексы с РНК и односпиральной ДНК - красной люминесценцией. Известны также люминесцентно-цитохим. методы выявления белков и липидов. Для качественного и количественного изучения локализации белков в клетках используют проционовые красители, флюорескамин, а липидов - 3,4-бензпирен, фосфин ЗР и др. Тетрациклин и его производные применяют для люминесцентно-микроскопического изучения костной ткани и некоторых изменений в клетках при малигнизации.

Л. м. в сочетании с прямым флюорохромированием фиксированных препаратов используют при бактериоскопической диагностике для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий, гонококков, возбудителей дифтерии, возбудителей малярии в мазках крови и др. Преимущества этого метода заключаются в его более высокой чувствительности по сравнению с обычными методами окраски (напр., окраски по Цилю-Нельсену). Флюорохромирование применяют также в санитарно-бактериол. исследованиях для обнаружения и подсчета микроорганизмов в воде и почве. Одним из методов люминесцентномикроскопической диагностики является обнаружение микроколоний на мембранных фильтрах после кратковременного подращивания и флюорохромирования.

Еще в 1940 г. Штруггер предложил использовать акридиновый оранжевый для дифференциации живых и мертвых бактерий, однако последующие исследования показали недостаточную надежность этого метода. В связи с этим для определения жизнеспособности клеток (в частности, при воздействии на них цитотоксических факторов) используют диацетат флюоресцеина или его сочетание с бромистым этидием. Нелюминесцирующий эфир флюоресцеина расщепляется эстеразами жизнеспособной клетки с освобождением ярко люминесцирующего зеленым флюоресцеина, а бромистый этидий обусловливает красную люминесценцию только мертвых клеток.

Для изучения физ.-хим. состояния мембран клеток используют так наз. гидрофобные флюоресцентные пробы. С этой целью клетки обрабатывают веществами, которые не люминесцируют в р-ре, но начинают люминесцировать, связываясь с гидрофобными участками мембран клетки, причем интенсивность и цвет люминесценции зависят от хим. строения и физ.-хим. состояния структур, с к-рыми связаны эти флюорохромы. Одним из наиболее распространенных веществ такого рода является 1-анилино-S-нафталин-сульфоновая к-та (1,8 АНС).

Методом изучения физ.-хим. состояния макромолекул, с к-рыми связаны флюорохромы в различных клеточных структурах, является также поляризационная люминесцентная микроскопия.

Существенное преимущество Л. м. перед другими методами микроскопического исследования - возможность прижизненного (цветн. рис. 1-3) и суправитального флюорохромирования с использованием очень низких малотоксичных концентраций флюорохромов. При этом различные флюорохромы могут связываться с разными структурами клеток. Акридиновый оранжевый, напр., накапливается в лизосомах живой клетки, и они начинают люминесцировать красным светом. Такую же люминесценцию приобретают фагоцитированные бактерии внутри фагосом. Тетрациклин связывается с митохондриями клеток или их аналогами у бактерий и люминесцирует желто-зеленым светом, причем интенсивность люминесценции (количество связавшегося тетрациклина) зависит от чувствительности бактерий к этому антибиотику.

Возможно также флюорохромирование клеток и тканей in situ для изучения их с помощью контактной Л. м.

Люминесцентная микроскопия вирусов применяется при лаб. диагностике вирусных заболеваний для выявления вирусного антигена в клетках, изучения хим. состава внутриклеточных вирусных включений, определения относительной концентрации вирусных антигенов и нуклеиновых к-т по интенсивности специфической флюоресценции и т. д. В зависимости от целей исследования в качестве объектов используют мазки, отпечатки, соскобы тканей или препараты клеточных культур.

В современной вирусологии наиболее распространены два метода Л. м.: 1) идентификация и дифференциация нуклеиновых к-т вирусов в инфицированных клетках и очищенных вирусных суспензиях с помощью флюорохромов аминоакридинов; 2) выявление вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции.

Из аминоакридинов чаще применяют акридиновый оранжевый, придающий молекулам двуспиральных нуклеиновых к-т (как правило, ДНК) зеленую, а односпиральных нуклеиновых к-т (как правило, РНК) рубиново-красную флюоресценцию (цветн. рис. 4-8). Метод применим как на нативных препаратах, так и после фиксации в ацетоне, жидкости Карнуа и др. Результаты окраски в значительной мере зависят от концентрации (обычно 1: 10 000 - 1: 100 000) и pH флюорохрома.

Метод иммунофлюоресценции используют для идентификации вирусов в клетках, изучения динамики накопления вирусного антигена в клетке, определения внутриклеточной локализации скоплений вируса, выяснения природы вирусных включений, изучения антигенной структуры вирусов, дифференциации близкородственных вирусов, титрования вирусов в клеточных культурах, выявления антигенов опухолеродных вирусов в тканях и клетках, изучения патогенеза вирусных заболеваний, контроля вирусной контаминации клеточных культур, исследования хрон, вирусных инфекций и т. д. Метод применим как в прямой, так и в непрямой модификациях. Для правильной интерпретации результатов исследования важно учитывать концентрацию и чистоту применяемых антител и их конъюгатов с флюорохромами, сроки и температуру фиксации препаратов (обычно ацетоном) и обработки их антителами. Наиболее часто для метки антител используют изотиоцианат флюоресцеина (ФИТЦ), дающий характерное зеленое свечение (цветн. рис. 9), и сульфохлорид лиссамин-родамина В 200, светящийся оранжево-красным светом.

Метод иммунофлюоресценции допускает также выявление в клетках и тканях антител к вирусным антигенам.

Л. м. вирусов применяют для диагностики таких инфекций, как оспа, герпес, эпидемический паротит и др. Особое значение имеет Л. м. в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, когда отпечатки со слизистой оболочки носа больных (риноцитограммы) обрабатывают с помощью названных выше методов с целью выявления антигенов или определения типа нуклеиновых к-т. Т. о. проводят дифференциальную диагностику между инфекциями, вызванными вирусами гриппа А2 или В, парагриппа, аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом или сочетаниями названных вирусов. Возможна также диагностика путем Л. м. клеточных культур, инфицированных материалом больных. Окончательный диагноз во всех случаях ставят по сочетанию данных Л. м. с результатами вирусол, и серол, исследований больных.

Люминесцентная микроскопия органов и тканей - один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патол, гистологии. Основными преимуществами Л. м. являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим, методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение, возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин В2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин B1 в щелочном р-ре переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной к-ты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид- голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохим, количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.

Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами (см.). Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитол, и гистол, препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда (участки ишемии имеют зелено-желтую люминесценцию). Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы, как кофеин 5 и родамин, могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин 3Р применяют для определения липидов, с этой же целью используют р-р 3,4-бензпирена в насыщенном р-ре кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин Т. S. окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью р-ра морина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов р-ром солохрома черного удается выявить алюминий (желто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в легких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).

С помощью метода иммунофлюоресценции можно выявить гормоны, антигены и антитела (цветн. рис. 9), различные продукты обмена, идентифицировать гистогенетически незрелые опухоли, различные инф. заболевания и т.д. Развитие иммунохимии еще больше расширило возможности этого метода. Появилась возможность определять с помощью искусственных гаптенов небелковые вещества в тканях и клетках.

Библиография: Барский И. Я., Поляков Н. И. и Якубенас В. А. В. Контактная микроскопия, М., 1976, библиогр.; Ершов Ф. И. Люминесцентное микроскопическое выявление ранних изменений нуклеиновых кислот и липидов в инфицированных клетках, Вопр, вирусол., .No 1, с. 3, 1964, библиогр.; 3еленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой, М., 1971, библиогр.; 3 у б-жицкий Ю. Н. Метод люминесцентной микроскопии, Л., 1964, библиогр.; К а р-мышеваВ.Я. Применение метода флюоресцирующих антител в вирусологии, М., 1979; M e й с e л ь М. Н. Флуоресцентная микроскопия и цитохимия в общей микробиологии, в кн.: Усп. микробиол., под ред. А. А. Имшенецкого, т. 7, с. 3, М., 1971; Михайлов И. Ф. и Дьяков С. И. Люминесцентная микроскопия, М., 1961, библиогр.; Струков А. И. и Кондратьев В. С. Люминесцентно-микроскопический метод в патологоанатомической практике, Арх. патол., т. 28, № 8, с. 77, 1966, библиогр.; Фридман И. А. и Кустаров Н. П. Люми-несцентные цитологические исследования в акушерско-гинекологической практике, Л., 1974, библиогр.; Automation in microbiology and immunology, ed. by C.-G. Hed£n a. T. Illeni, N. Y., 1975; The automation of uterine cancer cytologv, ed. by G. L. Wied a.o., Chicago, 1976; С a s-persson T. a.o. DNA-binding fluoro-chromes for-the study of the organization of the metaphase nucleus, Exp. Cell Res., v. 58, p. 141, 1969; Fluorescence techniques in cell biology, ed. by A. A. Thaer a. M. Ser-netz, N.Y., 1973; Vaillier J. a. Vaillier D. Characterization of cell subpopulations of the thymus by a hydro-phobic fluorescent probe, l-anilino-8-naph-thalene sulphonate, Clin. exp. Immunol v. 30, p. 283, 1977.

М. Я. Корн; В. А. Варшавский (пат. ан.), Я. E. Хесин (вир.).

Поглощение и последующее переизлучение света органическими и неорганическими образцами обычно является результатом распространённого физического явления, называемого либо флуоресценцией, либо фосфоресценцией. Испускание света посредством флуоресценции происходит почти одновременно с поглощением возбуждающего света, благодаря относительно малому времени задержки между поглощением и испусканием фотона, которое обычно не превышает микросекундного интервала. При более длительном интервале между поглощением и испусканием света это явление называется фосфоресценцией.

Рис. 1. Эпи-флуоресцентный микроскоп

Впервые флуоресценция была описана в 1852 году британским учёным Джорджем Стоксом, который и ввёл в употребление этот термин при проведении экспериментов с флюоритом (плавиковым шпатом), испускающим красный свет при облучении ультрафиолетом. Стокс заметил, что длина волны флуоресцентного испускания всегда больше длины волны света возбуждения. Первые исследования в 19-м веке показали, что многие образцы (включая минералы, кристаллы, смолы, лекарственное сырьё, масла, хлорофилл, витамины и неорганические соединения) флуоресцируют при облучении их ультрафиолетом. Тем не менее, применение флуорохромов в биологических исследованиях для окрашивания компонентов тканей, бактерий и других болезнетворных организмов началось лишь в 1930-х годах. Некоторые из этих красителей были крайне специфичны и стимулировали развитие флуоресцентной микроскопии.

Благодаря некоторым показателям, трудно достижимым традиционной контрастной оптической микроскопией, флуоресцентная микроскопия стала важным инструментом как в биологических и биомедицинских исследованиях, так и в материаловедении. Применение наборов флуорохромов позволило выделять высоко специфичные клетки и субмикроскопические клеточные компоненты среди не флуоресцирующих веществ. С помощью флуоресцентного микроскопа, на самом деле, можно обнаруживать даже отдельные молекулы. С помощью флуоресцентного мультиокрашивания различные красители могут идентифицировать несколько молекул-мишеней одновременно. И хотя пространственное разрешение флуоресцентного микроскопа ограничено снизу дифракционным пределом, зависящим от специфических характеристик образца, обнаружение флуоресцирующих молекул ниже этого предела вполне возможно.

Многие образцы, будучи облучёнными, демонстрируют автофлуоресценцию (без применения флуорохромов), и это явление широко используется в ботанике, петрологии и полупроводниковой промышленности. И напротив, изучение тканей животных или болезнетворных организмов часто осложнено либо чрезвычайно слабой, либо, наоборот, сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Гораздо более важное значение в этом случае имеет внесение в ткани флуорохромов (или флуророфоров), возбуждаемых на определённой длине волны и испускающих свет с необходимой интенсивностью. Флуорохромы являются красителями, которые, самостоятельно прикрепляясь к видимым или невидимым структурам, обладают при этом высокой избирательностью по отношению к мишеням и высоким квантовым выходом (отношением числа испущенных к числу поглощённых фотонов). Бурный рост применения флуоресцентной микроскопии тесно связан с появлением новых синтетических и естественных флуорофоров, имеющих определённые профили интенсивности возбуждения и испускания и «нацеленных» на заданные биологические мишени.

Основы процессов возбуждения и испускания

Принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца на длинах волн в необходимом и точно определённом интервале с последующим выделением гораздо более слабой испускаемой флуоресценции из потока возбуждающего света. В хорошо настроенном микроскопе достигать глаза или приёмного устройства должен лишь испускаемый свет, таким образом, чтобы наблюдаемые флуоресцирующие структуры накладывались на высоко контрастный очень тёмный (или чёрный) фон. Темнота фона, в общем, определяет пределы обнаружения, поскольку возбуждающий свет обычно в сотни тысяч, или даже миллионы, раз ярче испускаемой флуоресценции.

На рисунке 1 схематически изображён в разрезе современный эпифлуоресцентный микроскоп, предназначенный для наблюдений как в проходящем, так и в отражённом свете. Вертикальный осветитель, расположенный в центре, на одном конце имеет источник света (обозначенный на схеме как эпископический модуль) и насадку с фильтрами - на другом. В основе конструкции лежит микроскоп, работающий в отражённом свете, длина волны которого больше длины волны возбуждения. Автором вертикального осветителя для флуоресцентной микроскопии в отражённом свете считается Джон С. Плоем (Johan S. Ploem). Многочастотный свет от дуговой лампы или другого источника, проходя через селективный светофильтр возбуждения, преобразуется во флуоресцентном вертикальном осветителе в свет с определённой длиной волны (или в заданном волновом интервале), обычно из ультрафиолетового, синего или зелёного участков спектра. Пропущенный фильтром возбуждения поток отражается от поверхности дихроматического (также называемого дихроичным) зеркала или светоделителя и, пройдя через объектив, освещает образец интенсивным светом. Если образец флуоресцирует, испускаемый свет, собираемый объективом, опять проходит через дихроичное зеркало, после чего фильтруется запирающим (или эмиссионным) фильтром, который блокирует свет на длинах волн возбуждения. Важно заметить, что флуоресценция является единственным в оптической микроскопии режимом, при котором образец после облучения излучает свой собственный свет. Испускаемый свет переизлучается сферически во всех направлениях, независимо от расположения источника облучающего света.

Метод эпифлуоресцентного освещения является преобладающим в современной микроскопии. Вертикальный осветитель отражённого света располагается между тубусами наблюдения и револьверной головкой объективов. Осветитель устроен таким образом, что возбуждающий свет на пути к образу и от образца проходит через один и тот же объектив микроскопа, который в данной конфигурации сначала выступает в качестве конденсора, а на обратном пути собирает испущенный свет флуоресценции. Осветители этого типа имеют несколько преимуществ. Объектив флуоресцентного микроскопа выступает, во-перых, в качестве хорошо настроенного конденсора, а во-вторых, в качестве собирающего свет устройства, с помощью которого формируется изображение. Будучи одним и тем же компонентом, объектив/конденсор всегда превосходно отюстирован. Большая часть возбуждающего света, достигающего образца, проходит сквозь него без взаимодействия и не возвращается на объектив, а освещаемая область ограничена той частью образца, которая наблюдается через окуляры (в большинстве случаев). Если микроскоп правильно сконфигурирован для освещения по Кёллеру, то, в отличие от некоторых методов, усиливающих контраст, при наблюдении на нём доступна полная числовая апертура объектива. Кроме того, он позволяет комбинировать режимы наблюдения в проходящем и отражённом свете, режим формирования цифрового изображения, или выбирать один из них.

Рис. 2. Флуоресцентные фильтры

Как показано на рисунке 1, на заднем конце вертикального осветителя отражённого света расположен блок дуговой лампы (обычно ртутной или ксеноновой). Распространяясь вдоль осветителя перпендикулярно оптической оси микроскопа, возбуждающий свет проходит сквозь собирающие линзы, регулируемую и центрируемую апертурную диафрагму, а затем через регулируемую центрируемую полевую диафрагму (см. рисунок 1). После этого свет попадает на фильтр возбуждения, где происходит отбор длин волн из требуемого интервала и блокирование остальных длин волн. После прохождения фильтра возбуждения, отобранные длины волн достигают дихроичного светоделительного зеркала, являющегося специальным интерференционным фильтром, эффективно отражающим коротковолновый и эффективно пропускающим длинноволновый свет. Дихроичный светоделитель наклонён под углом 45 градусов по отношению к падающему на него возбуждающему свету и отражает его под углом 90 градусов через объектив оптической системы прямо на образец. Флуоресценция, испускаемая освещённым образцом, собирается объективом, выполняющим теперь уже свою обычную функцию, а именно формирование изображения. Поскольку испускаемые длины волн больше длин волн возбуждения, они проходят через дихроичное зеркало вверх к наблюдательным тубусам или электронному детектору.

Большинство рассеянного возбуждающего света, достигая дихроичного зеркала, отражается им обратно к световому источнику, хотя небольшая его доля может пройти насквозь или поглощается внутренним покрытием зеркала. Но до того, как испущенная флуоресценция достигнет окуляра или детектора, она должна пройти запирающий или заграждающий фильтр Эти фильтры блокируют (заграждают) любой остаточный возбуждающий свет, но пропускают более длинные волны испускаемого света. В большинстве осветителей отражённого света фильтр возбуждения, дихроичное зеркало и запирающий фильтр объединены в оптический блок (часто называемый кубом), как показано на рисунке 2. Современные флуоресцентные микроскопы могут вмещать от четырёх до шести фильтр-кубов (обычно на насадке карусельного или на выдвижного типа; см. рисунок 1) и позволяют пользователю легко устанавливать сменные фильтры возбуждения, запирающие фильтры и дихроичные зеркала.

Конструкция вертикального осветителя должна позволять пользователю настраивать микроскоп для освещения по Кёллеру, при котором обеспечивается яркое и равномерное освещение по всему полю зрения. Откорректированные конденсорные линзы оптической системы обеспечивают сопряжённость изображения центрируемой апертурной диафрагмы с задней апертурой фокусирующего объектива. В современных осветителях, изображение предварительно-сфокусированной, центрируемой полевой диафрагмы является сопряженныи со сфокусированным образом и плоскостью фиксированной диафрагмы окуляра.

Ламповый блок осветителя обычно содержит заграждающий фильтр, блокирующий инфракрасный свет. Сам ламповый блок не должен пропускать наружу ультрафиолетового излучения. Желательно, к тому же, чтобы в него был встроен автоматический выключатель, на случай его открытия во время работы. Ламповый блок должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать возможный взрыв дуговой лампы в процессе работы. В современных ламповых блоках гнездо лампы оборудовано регулировочными ручками для центрирования изображения дуговой лампы в задней апертуре объектива (при освещении по Келлеру эти плоскости сопряжены). На пути света, обычно ближе к ламповому блоку, но перед фильтром возбуждения, желательно поставить задвижку, чтобы полностью блокировать возбуждающий свет, если не ведётся наблюдение образца. К тому же, в оснащение осветителя должны входить нейтральные светофильтры (на насадке барабанного, карусельного или выдвижного типа) для того, чтобы иметь возможность понизить интенсивность возбуждающего освещения.

Стоксов сдвиг

При переходе электронов из возбуждённого в основное состояние теряется колебательная энергия. В результате этой потери энергии спектр испускания возбуждённого флуророфора обычно сдвигается в сторону более длинных волн в сравнении со спектром поглощения или возбуждения (необходимо помнить, что длина волны обратно пропорциональна её энергии). Это известное явление называется правилом Стокса или стоксовым сдвигом. При увеличении стоксова сдвига становится легче разделять возбуждающий и испускаемый свет с помощью комбинаций флуоресцентных светофильтров.

Пик интенсивности испускания флуророфора обычно ниже пика интенсивности его поглощения и приходится на волну с большей длиной. Кривая испускания (спектральная кривая) часто является зеркальным (или близко к этому) отображением кривой возбуждения, но сдвинутой в сторону более длинных волн, как показано на рисунке 3, где представлен полезный своими спектральными характеристиками краситель Alexa Fluor 555, который поглощает в жёлто-зелёной, а испускает в жёлто-оранжевой области. Для достижения максимальной интенсивности флуоресценции, флуророфор (часто называемый красителем) возбуждается на длинах волн, близких к пику кривой возбуждения или приходящихся на самый её пик, при этом испускаемый свет регистрируется в максимально широком диапазоне, включающем пик испускания. Отбор возбуждающих и испускаемых длин волн производится с помощью интерференционных фильтров (рисунок 2). В дополнение следует отметить, что спектральные характеристики оптической системы микроскопа также зависят от коэффициентов пропускания стекла (на которые влияют просветляющие покрытия), количества линз и зеркал и чувствительности детекторов.

Рис. 3. Кривые поглощения и испускания флуорофора

Эффективность разделения и регистрации длин волн возбуждения и испускания достигается во флуоресцентной микроскопии правильным выбором светофильтров, блокирующих или, наоборот, пропускающих свет определённых длин волн в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной области спектра. Контроль возбуждающего света производится в вертикальных флуоресцентных осветителях благодаря тому, что в их конструкции предусмотрено использование легко сменяемых фильтров (нейтральных и интерференционных светофильтров возбуждения), вставляемых на пути света к образцу и на обратном пути между образцом и тубусами наблюдения или системой приёма сигнала. Ввиду низкой интенсивности флуоресцентного свечения (о чём говорилось выше), необходимо чтобы источник возбуждающего света имел достаточную яркость для максимально возможного усиления слабого испускаемого света, а также, чтобы флуорохромы обладали соответствующими поглощательными характеристиками и квантовым выходом. Это, возможно, является ключевыми критериями флуоресцентной микроскопии.

Эффективность поглощения отдельным флуророфором фотона возбуждающего света является функцией эффективного молекулярного сечения, а вероятность такого события называется коэффициентом поглощения. Бо?льшие значения коэффициента поглощения говорят о том, что поглощение фотона (или кванта) в данном интервале длин волн более вероятно. Квантовым выходом обозначается отношение числа испущенных к числу поглощенных квантов (обычно оно лежит в интервале от 0,1 до 1,0). То, что квантовый выход принимает значения меньшие 1, является следствием потери энергии безызлучательным способом, например через тепло или фотохимическую реакцию, когда не происходит её переизлучения, приводящего к флуоресценции. Коэффициент поглощения, квантовый выход, средняя сила света, а также время высвечивания являются важными факторами, влияющими на интенсивность флуоресценции и определяющими целесообразность применения этого метода.

Фединг, тушение и фотообесцвечивание

Целый ряд условий может влиять на вероятность флуоресцентного переизлучения, часто приводя к падению интенсивности флуоресценции. Общим термином для обозначения уменьшения интенсивности флуоресцентного испускания является фединг, охватывающий все явления, которые для более подробного описания могут быть разделены на явления тушения и фотообесцвечивания. Фотообесцвечиванием называется необратимый распад флуоресцентных молекул в возбуждённом состоянии, вызванный их взаимодействием с молекулярным кислородом до момента испускания. Это явление используется в методе восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), очень эффективном при изучении диффузионных свойств и движения биологических макромолекул. В основе метода лежит фотообесцвечивание лазерным пучком чётко определённой области в образце с последующим наблюдением скорости и характера восстановления флуоресценции в фотообесцвеченной области. Связанный с этим метод затухания флуоресценции в обесцвеченных изображениях (FLIP) применяется для исследования уменьшения флуоресценции в областях, прилегающих к фотообесцвеченной области. Как и FRAP, этот метод является эффективным инструментом в исследовании подвижности молекул и динамики в живых клетках.

Рис. 4. Скорость фотообесцвечивания мультиокрашенных образцов

На рисунке 4 представлен типичный пример фотообесцвечивания (фединга), наблюдаемого в серии цифровых изображений мультиокрашенной культуры фибробластов кожи индийского мунтжака, снятых в различные моменты времени. Ядра были окрашены дериватом бис-бензимидазола (хёхст 33258, синее свечение), а митохондрии и актиновый цитоскелет - красителем MitoTracker Red CMXRos (красное свечение) и дериватом фаллоидина, присоединённым к Alexa Fluor 488 (зелёное свечение), соответственно. Снимки производились через каждые две минуты, а комбинация флуоресцентных светофильтров была настроена таким образом, чтобы возбуждение всех трёх флуорофоров происходило одновременно, при одновременной регистрации комбинированных испускаемых сигналов. На рисунке 4(а) видно, что интенсивность всех трёх флуророфоров относительно высока, но интенсивность хёхста (синий) начинает быстро падать уже через две минуты и почти совсем пропадает через 6–8 минут. Красители митохондрий и актина оказываются более устойчивыми к фотообесцвечиванию, но и их интенсивность значительно падает за время наблюдения (10 минут).

Релаксация из возбуждённого состояния путём тушения, приводящая к падению интенсивности флуоресценции, происходит различными безизлучательными способами и часто возникает из-за окислителей или из-за присутствия солей, тяжёлых металлов и галогенных соединений. В некоторых случаях тушение происходит как результат передачи энергии другой молекуле (именуемой акцептором), которая находится близко к возбуждённому флуророфору (донору). Это явление называется резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Именно этот механизм стал основой эффективного метода изучения молекулярных взаимодействий и ассоциаций на расстояниях, значительно меньших разрешающей способности оптических микроскопов.

Флуоресцентные источники света

Неблагоприятным следствием низкой интенсивности испускания в большинстве приложений флуоресцентной микроскопии является низкое число фотонов, достигающих окуляра, либо приёмного устройства. В большинстве случаев, эффективность собираемости фотонов в оптических микроскопах меньше 30 процентов, а концентрации многих флуророфоров на оптическом пути меняются от микромолярных до наномолярных концентраций. Чтобы интенсивность возбуждающего света была достаточной для регистрации флуоресценции, необходимы мощные компактные источники света, такие как небольшие дуговые лампы с высокой энергией излучения. Наиболее распространёнными являются ртутные лампы мощностью от 50 до 200 ватт и ксеноновые лампы мощностью от 75 до 150 ватт (см. рисунок 5). Эти лампы обычно питаются от внешнего источника постоянного тока, достаточного для того, чтобы зажечь дуговой разряд через ионизацию паров высокого давления и поддерживать его горение с минимальным мерцанием.

Внешний источник питания дуговой лампы микроскопа обычно снабжён таймером для отслеживания количества отработанных часов. Дуговые лампы теряют световую отдачу и часто разрушаются при эксплуатации дольше установленного срока службы (200–300 часов). Ртутные лампы не обеспечивают равномерной интенсивности в спектральном диапазоне от УФ до ИК. Максимум их интенсивности приходится на ближний ультрафиолет. Отчётливые пики интенсивности возникают на 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578 нанометрах. На других длинах волн видимого спектра интенсивность стабильна, хотя и не так высока (но всё же достаточна для большинства приложений). Но мощность лампы сама по себе не является определяющим для эффективности освещения параметром. И напротив, существенным параметром, который в первую очередь должен приниматься во внимание, является средняя светимость с учётом яркости источника, геометрии дуги и углового распределения излучения.

Рис. 5. Дуговые флуоресцентные лампы

В последние несколько лет оптическая микроскопия переживает подъём в применении лазерных источников света, особенно аргоновых ионных и аргоново-криптоновых (ионных) лазеров. Преимущества этих лазеров заключаются в их небольшом размере, малой расходимости пучка, высокой степени монохроматичности и высокой средней светимости. Они получили широкое применение в сканирующей конфокальной микроскопии, которая стала мощным инструментом создания высоко контрастных флуоресцентных изображений за счёт исключения внефокусных засветок, идущих из фокальной плоскости образца. В конфокальных микроскопах это достигается благодаря сканированию образца фокальной точкой или линией с одновременным формированием изображения через сопряжённую апертуру. Оптические срезы образцов могут храниться в памяти компьютера микроскопа и реконструироваться в окончательное изображение, отображаемое на мониторе.

Обозначения фильтров

Общая терминология, принятая для обозначения комбинаций фильтров во флуоресцентной микроскопии, стала весьма запутанной из-за различных аббревиатур и кодов, применяемых разными производителями для маркировки своих фильтров. В принципе, существуют три основных категории фильтров: фильтры возбуждения (часто просто называемые возбудителями), запирающие (эмиссионные) фильтры и дихроичные светоделители (или дихроичные зеркала). Прежде флуоресцентные светофильтры состояли исключительно из цветного стекла или желатина, вставленного между двумя стеклянными пластинами. Однако сегодня имеет место тенденция к производству высокочувствительных фильтров с интерференционной оптикой для пропускания или задержки света строго определённых длин волн, обладающей, к тому же, высоким коэффициентом пропускания. Дихроичные светоделители являются специальными интерференционными фильтрами, предназначенными для отражения или пропускания света определённых длин волн, помещаемых на световом пути под углом 45 градусов (см. рисунки 1и 2). Запирающие фильтры изготавливаются на основе либо цветного стекла, либо интерференционных покрытий (либо их комбинации).

Для обозначения характеристик фильтров возбуждения производителями применяется различная аббревиатура. Ультрафиолетовое стекло, например, обозначается как UG, а синее стекло - BG. На узкополосных фильтрах часто можно встретить обозначение KP (K от немецкого «kurz», что переводится как «короткий») или просто SP. Интерференционные фильтры сейчас маркируются некоторыми производителями аббревиатурой IF. Узкополосные интерференционные фильтры возбуждения особенно эффективны при малом стоксовом сдвиге.

Сокращения и аббревиатуры для запирающих фильтров бывают следующими: LP или L для широкополосных фильтров, Y или GG для жёлтого (от немецкого «gelb» - «жёлтый») стекла, R или RG для красного стекла, OG или O для оранжевого стекла, K для щелевых фильтров (от немецкого «kante» - край), и BA для запирающих фильтров. Если в маркировке фильтра стоит число, как например ВА515, оно обозначает длину волны (в нанометрах), на которой он имеет половину от максимального коэффициента пропускания.

Дихроичные светоделители также маркируются различными аббревиатурами: CBS обозначает хроматический светоделитель, DM - дихроичное зеркало, TK - щелевой делитель (от немецкого «teiler kante»), FT - делитель цвета (от немецкого"farb teiler») и RKP - узкополосный отражатель. Все эти обозначения являются взаимозаменяемыми; кроме того, оптическое стекло всех современных дихроичных светоделителей всегда покрывается интерференционными покрытиями (а не органическими или металлическими красящими веществами). Эти тонкие интерференционные плёнки обладают высоким коэффициентом отражения коротких волн и высоким коэффициентом пропускания длинных волн. Дихроичные светоделители наклонены под углом 45 градусов по отношению свету возбуждения, падающему на оптический блок через флуоресцентный осветитель отражённого света. Их основной функцией является перенаправление определённых (более коротких) возбуждающих волн на объектив и на расположенный за ним образец. Эти специальные фильтры имеют и дополнительные функции, заключающиеся в пропускании более длинных волн флуоресценции к запирающему фильтру и в отражении рассеянного возбуждающего света обратно в направлении лампового блока.

Рис. 6. Среднеполосный фильтр синего возбуждения Nikon B-2E

На рисунке 6 представлены кривые пропускания для комбинации типичных флуоресцентных светофильтров, применяемых в современных микроскопах. Спектр фильтра возбуждения (красная кривая) демонстрирует высокую степень пропускания (приблизительно 75 процентов) в диапазоне от 450 до 490 нанометров с центральной длиной волны (CWL) 470 нанометров. Дихроичное зеркало (жёлтая кривая) отражает волны в спектральном диапазоне фильтра возбуждения, но пропускает, с относительно высоким коэффициентом, более короткие и более длинные волны. Необходимо заметить, что нулевое пропускание дихроичного зеркала соответствует 100 процентному отражению. Отчётливый провал в кривой пропускания между 450 и 500 нанометрами, который соответствует пику отражения, служит для перенаправления волн из полосы пропускания фильтра возбуждения под углом 90 градусов на образец. Последним звеном в этой последовательности является эмиссионный или запирающий фильтр (белая кривая), который пропускает волны в зелёном участке видимого спектра в интервале от 520 до 560 нанометров. Для обеспечения почти полного разделения отражённых и пропущенных волн границы полос отражения и пропускания различных накладываемых друг на друга спектров должны быть как можно круче. Синусоидальная часть кривой спектра дихроичного зеркала, называемая звоном, является результатом процесса нанесения тонких плёнок. Высокая эффективность этой комбинации фильтров - пример значительных успехов в технологии тонких покрытий интерференционных фильтров.

В основе системы условных обозначений, применяемых компанией Nikon, лежат смешанные термины, появившиеся в начале 1990-х годов. В то время все дополнительные комбинации фильтров Nikon производились методом напыления твёрдых покрытий, но сегодня при производстве многих фильтров, применяются передовые методы мягкого покрытия. И хотя мягкие покрытия более чувствительны к влажности и нагреву и требуют более аккуратного (по сравнению с твёрдыми покрытиями) обращения, они демонстрируют более высокие значения оптической плотности и обеспечивают бо?льшую лёгкость в тонкой настройке специфичных полос пропускания. Понимание условных обозначений комбинаций фильтров Nikon позволяет быстро подбирать необходимые фильтры для специфичных флуророфоров.

Первая буква в принадлежащей компании Nikon системе буквенно-цифровых обозначений указывает на область спектра возбуждения (например, UV, V, B, и G являются сокращениями от английских слов «ultraviolet» - ультрафиолетовый, «violet» - фиолетовый, «blue» - синий, и «green» - зелёный, соответственно). Число, следующее за кодировкой спектра возбуждения, обозначает ширину полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 соответствует узкополосному возбуждению, 2 - среднеполосному, и 3 - широкополосному возбуждению. И, наконец, одна или несколько букв, следующих за числом, соответствующим ширине полосы возбуждения, обозначают характеристики запирающего фильтра. Буква A указывает на стандартный широкополосный запирающий фильтр с самой низкой длиной волны отсечки, B обозначает широкополосный запирающий фильтр, имеющий более высокую волну отсечки. Обозначение E (от английского «enhanced» - усиленный) в полосовых эмиссионных фильтрах указывает на улучшенные характеристики в смысле сокращения интерференционного взаимодействия разделяемых сигналов. Обозначение E/C указывает на комбинацию мягких интерференционных покрытий, разработанных специально для работы с такими специфическими красителями, как DAPI, FITC, TRITC и техасский красный.

Флуоресцентный световой баланс

Оценка световых потоков в типичном флуоресцентном микроскопе позволяет в общих чертах составить представление об ограничениях, которые неизбежно возникнут при формировании цифровых изображений или при визуальном наблюдении образцов. В качестве источника облучения для нашей оценки возьмём стандартную 75-ваттную ксеноновую дуговую лампу, средняя плотность светового потока которой приблизительно равна 400 канделам на квадратный миллиметр (другие источники представлены в таблице 1). При направлении излучаемого света на 490-нанометровый интерференционный фильтр (с полосой пропускания 10 нанометров и коэффициентом пропускания 75 процентов) через него пройдёт около 2 милливатт выходного потока лампы. После отражения от дихроичного зеркала с коэффициентом 0,9 световой поток в 1,8 милливатт направляется к задней апертуре объектива микроскопа в качестве возбуждающего пучка.

Для объектива кратностью 100х с числовой апертурой 1,4 освещённая область образца составит 12×10 E(-6) квадратных сантиметров, если диаметр поля зрения считать равным приблизительно 40 микрометрам. Тогда световой поток, падающий на образец, будет около 150 ватт на квадратный сантиметр, что соответствует плотности потока 3.6×10 E(20) фотонов на квадратный сантиметр. Таким образом, интенсивность освещения образца примерно в 1000 раз больше интенсивности освещения земной поверхности в обычный солнечный день.

Флуоресцентное свечение при таком световом потоке зависит от поглощательных и эмиссионных свойств флуророфора, его концентрации в образце и длине оптического пути образца. Математически производимая флуоресценция (F) описывается уравнением:

F = σ Q I

Где σ - сечение молекулярного поглощения, Q - квантовый выход, а I - падающий световой поток, рассчитанный выше. Предполагая, что флюоресцеин является флуророфором с сечением поглощения (σ) 3×10 E(-16) квадратных сантиметров, получаем Q равным 0.99, что приводит к флуоресценции F в 100000 фотонов в секунду на одну молекулу. При концентрации красителя в 1 микромоль на литр, равномерно распределённом в диске диаметром 40 и толщиной 10 микрометров (объём, равный 12 пиколитрам), получаем приблизительно 1.2×10 E(-17) молей красителя или 7,2 миллиона молекул на оптическом пути. При одновременном возбуждении всех молекул скорость флуоресценции составит 7,2×10 E(11) фотонов в секунду (что является произведением F и числа молекул красителя). Возникает вопрос: сколько испущенных фотонов будет зарегистрировано, и как долго может продолжаться такая скорость испускания?

Табл. 1. Плотность световой энергии различных источников света

Эффективность регистрации фотонов определяется эффективностью их собирания и квантовым выходом детектора. Объектив с числовой апертурой 1,4 и стопроцентным пропусканием (что является нереальным условием) имеет максимальную эффективность собирания фотонов, ограниченную углом приёма около 30 процентов. Коэффициент пропускания дихроичного зеркала равен 85 процентам, а запирающего фильтра - 80 процентам. Результирующая эффективность собирания составляет в этом случае 20 процентов или 140 миллиардов фотонов в секунду. Если в качестве детектора взять традиционный прибор с зарядовой связью (ПЗС), его квантовый выход на волне зелёного флюоресцеина (525 нанометров) составит 50 процентов. Таким образом, детектироваться будут 70 миллиардов фотонов в секунду, или около 10 процентов от испускаемых при флуоресценции. Даже идеальным детектором (со 100-процентным квантовым выходом) может улавливаться только около 20 процентов фотонов флуоресценции.

Длительность флуоресцентного свечения зависит от скорости разрушения флуророфоров, являющегося следствием фотообесцвечивания. Измерения показывают, что каждая молекула флюоресцеина в кислородосодержащем солевом растворе до своего разрушения успевает испустить около 36000 фотонов. В безкислородном окружении скорость фоторазрушения сокращается примерно в десять раз. Таким образом, молекула флюоресцеина может дать 360000 фотонов. В совокупности все красители в нашем примере (7,2 миллиона молекул) способны испустить минимум 2,6×10 E(11) и максимум 2,6×10 E(12) фотонов. При скорости испускания одной молекулой 100000 фотонов в секунду (согласно вышеприведённым оценкам), получаем длительность флуоресцентного свечения до фоторазрушения равной от 0,3 до 3 секунд. В случае регистрации 10 процентов от числа испущенных фотонов сигнал детектора будет составлять 7,2×10 E(10) электронов в секунду.

Таким образом, если ПЗС имеет 1000×1000-пиксельную камеру, этот сигнал будет распределён среди одного миллиона светочувствительных элементов, то есть приблизительно по 72000 электронов на каждый из них. Для научно-исследовательского ПЗС с 9-микрометровыми светочувствительными элементами зарядовая ёмкость составляет около 80000 электронов, а шум считывания меньше 10 электронов. В этом случае отношение сигнал-шум будет, в основном, определяться фотонным флуктуационным шумом, равным квадратному корню сигнала, то есть около 268. Почти во всех случаях такой высокий уровень сигнала может продолжаться лишь короткое время, до наступления фоторазрушения. Для продления времени наблюдения большинство микроскопистов сокращает интенсивность облучающего потока, чтобы возбуждалась, а следовательно, и разрушалась только часть из общего числа молекул флуророфора. Таким образом, отношение сигнал-шум редко достигает теоретического максимума и обычно во флуоресцентной микроскопии лежит в диапазоне от 10 до 20.

Детектирование отдельных молекул

В идеальных условиях, часто бывает возможно зарегистрировать флуоресцентное свечение отдельной молекулы, если, конечно, оптический фон и шум детектора достаточно низки. Как говорилось выше, одна молекула флюоресцеина до своего разрушения фотообесцвечиванием может испустить до 300000 фотонов. При 20-процентной собираемости и эффективности детектирования будут зарегистрированы около 60000 фотонов. Применяя для экспериментов такого рода ПЗС на основе лавинных фотодиодов или электронного умножения, исследователям удавалось следить за поведением отдельных молекул в течение секунд и, даже, минут. Главной проблемой в таких случаях является подавление шума оптического фона. Из-за того, что многие материалы, применяемые в конструкции микроскопических линз и фильтров, проявляют определенную автофлуоресценцию, первоначальные усилия были направлены на производство компонентов с малой флуоресценцией. Однако, вскоре стало очевидным, что при использоваии во флуоресцентной микроскопии метода полного внутреннего отражения (ПВО, или TIR в английской аббревиатуре), необходимое сочетание низкого фона и высоко интенсивного потока возбуждающего света может быть достигнуто.

Рис. 7. Конфигурации инвертированного и ФМПВО (TIRF) микроскопов

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (ФМПВО или TIRFM в английской аббревиатуре) использует явление нераспространяющейся или быстрозатухающей волны, которая возникает при полном внутреннем отражении на границе двух сред с разными показателями преломления.

Схема с применением внешнего источника света представлена на рисунке 7(а). В этом методе пучок света (обычно расширенный лазерный пучок) проходит через призму с высоким показателем преломления (как у стекла или сапфира), прилегающую либо к стеклу, либо к водному раствору с более низким показателем преломления. Если свет направляется на призму под углом, большим критического, пучок будет полностью отражён от границы раздела. Явление отражения вызывает на поверхности раздела нераспространяющуюся волну, а именно, происходит генерация электромагнитного поля, проникающего в среду с меньшим показателем преломления на расстояние не большее 200 нанометров. Интенсивность света в нераспространяющейся волне достаточна для возбуждения флуророфоров, но из-за её чрезвычайно малой глубины, объём возбуждения очень мал. Результатом этого является низкоуровневый фон, поскольку объём образца, подвергшийся облучению, ничтожно мал (только та его часть, которая находится от поверхности в пределах 200-нанометрового расстояния).

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения может быть реализована и с использованием модифицированного метода эпи-освещения, применяемого в широкопольной микроскопии (как показано на рисунке 7(b)). Для этого метода требуются объективы с очень высокой числовой апертурой (по крайней мере, 1,4, но желательно - от 1,45 до 1,6) и частичное освещённое поле микроскопа, что достигается с помощью небольшого пятна или, для большей равномерности освещения, тонкого кольца, блокирующего часть светового потока. Для достижения критического угла, за которым наступает полное внутреннее отражение, необходимо, чтобы иммерсионная среда в линзах и покровное стекло микроскопа имели высокий показатель преломления. Как показано на рисунке 7(b), световые лучи, выходящие из передней линзы под углом меньшим критического (на рисунке он обозначен A(1)), уже не возвращаются в микроскоп. При достижении критического угла или его превышении (угол A(2) на рисунке 7(b)) происходит полное внутреннее отражение.

Для получения дополнительной информации при исследованиях, с методом полного внутреннего отражения часто сочетаются другие популярные передовые методы флуоресценции, такие как резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), а также спектроскопия. В сочетании, эти методы являются мощным инструментом в изучении отдельных флуророфоров и флуоресцентно окрашенных молекул. Преимущества изучения отдельных молекул только сейчас начинают осознаваться. Таким образом, сегодня диапазон исследований оптической микроскопии - от отдельных молекул до целых животных.

Заключение

Современные флуоресцентные микроскопы сочетают в себе мощь высококачественных оптических компонентов с компьютеризированным управлением и формированием изображений цифровым способом, что позволяет достигать уровня сложности, который далеко превосходит простое визуальное наблюдение. Сегодня микроскопия в значительной степени зависит от электронных способов формирования изображения, позволяющих быстро получать информацию при низких уровнях световых сигналов или на визуально не регистрируемых длинах волн. Эти технические усовершенствования являются не просто элементами внешнего оформления, но существенными компонентами оптического микроскопа, как сложной измерительной системы.

Время, когда оптическая микроскопия было чисто описательной дисциплиной или интеллектуальной игрушкой прошло. Сегодня получение оптического изображения является только первым шагом в анализе данных. Этот первый шаг осуществляется микроскопом в соединении с электронными детекторами, процессорами изображений, дисплеями, которые могут рассматриваться как расширение системы формирования изображений. Применяемое уже повсеместно компьютеризированное управление фокусировкой, положением предметного столика, оптическими компонентами, затворами, фильтрами и детекторами позволяет проводить такие манипуляции во время эксперимента, которые были просто невозможны для человека при работе на механических микроскопах. Все более возрастающее использование оптоэлектроники во флуоресцентной микроскопии привёло к разработке оптических пинцетов для манипулирования субклеточными структурами и частицами, к наблюдению отдельных молекуле, а также к появлению широкого круга сложнейших спектроскопических приложений.

Комбинации флуоресцентных фильтров

Комбинации эпи-флуоресцентных интерференционных и поглощающих фильтров помещаются в фильтр-кубы (или оптические блоки) и включают в себя фильтр возбуждения, дихроичный светоделитель (часто называемый зеркалом) и запирающий (или эмиссионный) фильтр, как показано на рисунке 1(а). Это руководство может быть полезно при подборе комбинации фильтров, соответствующей поглощательным и испускательным спектральным характеристикам хромофоров, применяемых в широкопольной флуоресцентной микроскопии. Спектральные кривые типичной комбинации высокопроизводительных полосовых фильтров в синем диапазоне возбуждения представлены на рисунке 1(b). Комбинации флуоресцентных фильтров компании Nikon поставляются с узкополосными, среднеполосными и широкополосными фильтрами возбуждения и соответствующими им эмиссионными фильтрами с определённой или широкой полосой пропускания.

Рис. 8. Спектральные кривые блока фцлуоресцентных светофильтров

Ультрафиолетовое возбуждение - в набор флуоресцентных фильтров ультрафиолетового возбуждения компании Nikon входят четыре тщательно сбалансированных комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком диапазоне синего, зелёного и красного участков видимого спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 330 до 380 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 40 и 50 нанометров. В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в четвертой оно имеет более низкую волну отсечки для совпадения с узкой полосой возбуждения. Комбинации ультрафиолетовых фильтров включают эмиссионные фильтры либо с заданной, либо с широкой полосой пропускания.

Фиолетовое возбуждение - в набор флуоресцентных фильтров фиолетового возбуждения компании Nikon входят три комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале синего, зелёного и красного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 379 до 420 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 22 и 40 нанометров. В две комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в третьей оно имеет более низкую волну отсечки для совпадения с полосой возбуждения на более коротких волнах.

Сине-фиолетовое возбуждение - в набор флуоресцентных фильтров сине-фиолетового возбуждения компании Nikon входят четыре комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале голубого, зелёного и красного участков видимого спектра. Эти дополнительные наборы фильтров охватывают диапазон возбуждения от 400 до 446 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 20 и 40 нанометров. В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в четвертой оно имеет более высокую волну отсечки (на 5 нанометров) для соответствия другим компонентам.

Синее возбуждение - набор флуоресцентных фильтров синего возбуждения компании Nikon состоит из шести сбалансированных комбинаций, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале зелёного, жёлтого, красного и инфракрасного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 420 до 495 нанометров с шириной полосы пропускания 20, 30, 40 и 70 нанометров. В пять комбинаций входит одно и то же дихроичное зеркало, а в шестой оно имеет более низкую волну отсечки для увеличения принимаемого сигнала. Все полосные запирающие фильтры для фильтрационных наборов синего возбуждения компании Nikon имеют спектральную ширину 40 нанометров. Один из фильтров (B-3A) разработан для применения с освещением галогенной лампой с вольфрамовой нитью.

Зелёное возбуждение - набор флуоресцентных фильтров зелёного возбуждения компании Nikon состоит из шести блоков, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале жёлтого, оранжевого, красного и ближнего инфракрасного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 510 до 560 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 25, 30 и 50 нанометров (включая узкую, среднюю и широкую полосы возбуждения). В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало (565 нанометров), а остальные три имеет волну отсечки с большей длиной (570 и 575 нанометров). Два из шести фильтрационных наборов компании Nikon для зелёного возбуждения включают полосовые запирающие фильтры с полосами пропускания 60 и 75 нанометров.

Жёлтое возбуждение - набор флуоресцентных фильтров жёлтого возбуждения компании Nikon состоит из двух сбалансированных комбинаций, в которые включены эмиссионные (запирающие) фильтры с одной определённой полосой пропускания, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в оранжевом и красном участках спектра. Эти дополнительные комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 532 до 587 нанометров с шириной полосы пропускания 40 и 55 нанометров. В обе комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало (с отсечкой на 595 нанометрах). Два фильтрационных набора компании Nikon для жёлтого возбуждения включают полосовые запирающие фильтры с полосами пропускания 60 и 75 нанометров.

Красное возбуждение - комбинация флуоресцентных фильтров компании Nikon для красного возбуждения представлена одним блоком, который включает полосовой эмиссионный (запирающий) фильтр, способный избирательно пропускать флуоресцентное свечение в дальнем красном и ближним инфракрасном участках спектра. Середина полосы пропускания запирающего фильтра приходится на 700 нанометров, а её ширина - 75 нанометров (от 663 до 738 нанометров). Широкая 60-нанометровая полоса возбуждения от 590 до 650 нанометров захватывает оранжевые и красные длины волн. В комбинацию Cy5 HYQ входит дихроичное зеркало с отсечкой на 660 нанометрах, что на 10 нанометров больше отсечки полосы возбуждения.

Возбуждение жёлтого флуоресцентного белка (YFP) - для жёлтого флуоресцентного белка компанией Nikon разработана одна высококачественная сбалансированная комбинация, которая расширяет возможности регистрации флуоресцентного белка (обеспеченные тремя фильтрационными наборами для зелёного флуоресцентного белка (GFP)) благодаря использованию фильтров для вариантов GFP с большей длиной волны (YFP и EYFP). В блок фильтров YFP HYQ входят фильтры возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры с относительно узкой полосой пропускания, разработанные специально для соответствия спектральным характеристикам жёлтого флуоресцентного белка с усиленной флуоресценцией (усиленного YFP), что позволяет оценить флуоресценцию от дериватов YFP отдельно от остальных флуоресцентных белков.

Возбуждение в двух полосах - набор двухполосных флуоресцентных фильтров Nikon состоит из трёх тщательно сбалансированных комбинаций, включающих двухполосные фильтры (возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры), объединённые в одном блоке, избирательно пропускающем флуоресцентное свечение от двух флуорофоров одновременно. Каждый из фильтрационных блоков оптимально сочетается со специфичной флуорохромной парой, хотя также эффективно может работать и с другими парами флуоресцентных красителей, имеющих те же спектральные профили поглощения и испускания. Благодаря точному подбору полос, с крутыми межполосными переходами между участками отражения и пропускания, различные сигналы возбуждения и испускания разделяются с минимально перекрывающейся интерференцией.

Возбуждение в трёх полосах - трёхполосные флуоресцентные фильтры Nikon представлены двумя сбалансированными блоками, включающими трёхполосные фильтры (возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры), избирательно пропускающие флуоресцентное свечение от трёх флуорофоров одновременно. Каждый из фильтрационных блоков оптимально сочетается со специфичным набором из трёх флуорохромов, хотя также эффективно может работать и с другими комбинациями красителей, имеющих те же спектральные профили поглощения и испускания. Благодаря точному подбору полос, с крутыми межполосными переходами между участками отражения и пропускания, различные сигналы возбуждения и испускания разделяются с минимальной интерференцией между ними. Тройные кубы.

HYQ кубы - HYQ комбинации флуоресцентных фильтров Nikon представлены четырьмя тщательно сбалансированными высококачественными блоками, каждый из которых включает полосные эмиссионные (запирающие) фильтры для избирательного пропускания флуоресценции в пределах ограниченного диапазона. В обозначении каждого HYQ-фильтра отражено название флуорохрома, для которого он был разработан, но в пределах своих диапазонов возбуждения каждая комбинация может применяться для наблюдения различных флуорохромов с соответствующими характеристиками.

Базовый список блоков флуоресцентных фильтров Nikon

Первая буква в принадлежащей компании Nikon системе буквенно-цифровых обозначений указывает на участок спектра возбуждения (например, UV, V, B, и G являются сокращениями от английских слов «ultraviolet» - ультрафиолетовый, «violet» - фиолетовый, «blue» - синий, и «green» - зелёный, соответственно). Число, следующее за кодировкой спектра возбуждения, обозначает ширину полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 соответствует узкополосному возбуждению, 2 - среднеполосному, и 3 - широкополосному возбуждению. И, наконец, одна или несколько букв, следующих за числом, соответствующим ширине полосы возбуждения, обозначают характеристики запирающего фильтра. Буква A указывает на стандартный широкополосный запирающий фильтр с самой низкой длиной волны отсечки, B обозначает широкополосный эмиссионный фильтр, имеющий более высокую волну отсечки. Обозначение E (от английского «enhanced» - усиленный) в полосных эмиссионных фильтрах указывает на улучшенные характеристики в смысле сокращения интерференционного взаимодействия разделяемых сигналов. Обозначение E/C указывает на комбинацию мягких интерференционных покрытий, разработанных специально для работы с такими специфическими красителями, как DAPI, FITC, TRITC и техасский красный.

Рис. 1. Эпи-флуоресцентный микроскоп