Имуноблотинг –(от английски „blot“ - петно) - метод за идентифициране на антигени (или антитела) с помощта на известни серуми (или антигени). Това е комбинация от гел електрофореза и ELISA. Първоначално бактериалните клетки или вириони се унищожават с помощта на ултразвук, а след това всички антигени на вируса или бактериалните клетки се разделят чрез електрофореза и се получава търговски реагент върху специален нитроцелулозен филм. При извършване на имуноблотинг серумът на пациента, който се изследва, се нанася върху филм с известни антигени. След инкубиране и промиване на несвързани антитела, преминете към ELISA - антисерум към човешки имуноглобулини, маркирани с ензим и хромогенен субстрат, който променя цвета си при взаимодействие с ензима, се нанася върху филма. При наличие на антиген-антитяло-антисерум към имуноглобулин-ензимни комплекси върху носителя се появяват цветни петна. Методът на имуноблотинг ви позволява отделно да откривате антитела срещу различни патогенни антигени (например при HIV инфекция имуноблотингът открива антитела срещу gp120, gp24 и други вирусни антигени).

Радиоимуноанализ (RIA)

Методът се основава на реакция антиген-антитяло, като се използва радионуклидно маркиран антиген или антитяло. 125I, 14C, 3H, 51Cr и други радионуклиди се използват като етикети. Получените имунни комплекси се изолират от системата и тяхната радиоактивност се определя на броячи (β-лъчение). Интензитетът на радиацията е правопропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърдофазовият вариант на RIA, използващ белязани антитела или антигени, сорбирани в ямките на полистиролови панели, е широко разпространен.

RIA се използва за откриване на антигени на микроби, вируси, различни хормони, ензими, лекарства, имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в минимални концентрации от 10-12-10-15 g / l.

Контролни въпроси

Реакция на имунна бактериолиза: какъв вид е реакцията; какво е антиген, какво е антитяло, механизъм на реакция, методи на получаване, практическо приложение. Реакция на имунна хемолиза: необходими съставки, процедура; управление, практическо приложение. Реакция на локална хемолиза в гел (реакция на Jerne): принцип на реакцията, начин на формулиране, практическо приложение. Реакция на свързване на комплемента: принцип на реакцията; какво се образува, когато имунният серум взаимодейства със специфичен антиген; какво се случва с комплемента, ако той присъства по време на това взаимодействие? Каква е съдбата на комплемента, ако няма специфичен афинитет между антигена и антителата? Каква реакция може да се използва, за да се определи какво се е случило с комплемента; защо се използва тази конкретна реакция; Какъв е видимият положителен резултат от RSC? Защо? Какво свойство на комплемента се използва в първата фаза на RSC? Във втората фаза? Ако крайният резултат от RSC е хемолиза, това означава ли положителен или отрицателен резултат? Обяснете резултатите: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Назовете съставките на първата система RSK и съставките на втората система RSK. Защо тест серумът трябва да бъде инактивиран? Как се титрува комплементът? Хемолитичен серум: какво съдържа, как се получава, какъв е титърът и как се определя? Какви животни се използват за получаване на RSC компоненти? Методология за настройка на RSC на студено. При стадиране коя от следните реакции изисква участието на комплемента: преципитация, флокулация, аглутинация, откриване на непълни антитела, имунна бактериолиза, имунна хемолиза, Jerne, RSC? Имунофлуоресцентна реакция (RIF) - посочва последователността на събитията в директната реакция на Кунс; необходими съставки. Какво е антиген, какво е антитяло, с какво се маркират антителата, как се отчита резултатът от реакцията, как изглежда положителният резултат? Практическо приложение - какво може да се определи с помощта на тази реакция? Реакция на индиректна имунофлуоресценция - посочете последователността на събитията по време на тази реакция, необходимите съставки, какъв е антигенът, какви имунни серуми се използват; практическа употреба; предимство на непряката RIF в сравнение с директната реакция. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) – принцип на реакцията; необходими съставки; посочва последователността от събития при извършване на реакция за откриване на антиген в материала, който се тества; необходими съставки; Какво се случва, когато резултатът е положителен, как изглежда? Посочете последователността от действия при извършване на ELISA за откриване на антитела в тестовия серум; необходими съставки; какво се случва, ако резултатът е положителен? Имуноблотинг – принцип на реакцията; основни етапи; необходими съставки; как се отчита резултатът; ползи от реакцията. Радиоимуноанализ (РИА) - какви са основните етапи на реакцията; С какво се маркират антитела или антигени, как се отчита резултатът? Имуноелектронна микроскопия - принцип на метода; основни етапи; необходими съставки; с какво са белязани антителата? как се отчита резултатът от реакцията. Имобилизационни реакции – принцип на метода, техника на поставяне, компоненти, протоколиране на резултатите.

Задачи за изпълнение по време на процеса на самоподготовка.

Попълнете таблицата „Имунни реакции“ във връзка с реакциите, обсъждани в тази тема.

Имунни реакции

Работа на студентите по време на практически урок

Започнете работата веднага с настройка на фаза 1 на RSK, но го запишете в бележника си по-късно (вижте по-долу).

1. Реакция на имунна хемолиза. Вижте демонстрационна реакция на имунна хемолиза, скицирайте я под формата на диаграма, обяснете резултата в експерименталните и контролните епруветки.

2. Реакция на фиксиране на комплемента

а) анализирайте RSK според таблицата;

б) начертайте в тетрадка схема на настройката на RSC под формата на таблица;

в) поставете втората фаза на RSK (първата фаза се поставя в началото на урока);

г) анализира диагностичните препарати, необходими за RSC;

г) вземете предвид резултата. Формулирайте заключение за наличието на специфични антитела в тестовия серум.

3. Реакция на имунофлуоресценция. Разгледайте таблицата, направете схема на реакцията в тетрадката си; погледнете диагностичните серуми; определя какво съдържа серумът, как се приготвя, за каква реакция (директна или индиректна RIF) се използва. Вижте демонстрационния резултат от RIF във флуоресцентен микроскоп.

4. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). В тетрадката си съставете схема за настройка на реакция в две версии: за откриване на антиген в изследвания материал и за откриване на антитела в серума. Прегледайте комплекта съставки за ХИВ и хепатит B. Определете какво съдържа всяка съставка и за какво се използва.

5. Имуноблотинг. Направете схема на реакцията в тетрадката си; гледайте демонстрацията - резултатът от реакцията.

6. Радиоимуноанализ (RIA). Направете схема на реакцията в тетрадката си.

7. Имунна електронна микроскопия (IEM). Вижте демонстрацията - резултата от реакцията, начертайте схема на реакцията в тетрадката си, посочете със стрелки антигена (вируса) и белязаните антитела.

Имуноблотингът е високочувствителен метод за откриване на протеини, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

В общ смисъл имуноблотингът се отнася до анализ на смес от протеини, прехвърлени върху твърда мембранна опора, към която те са свързани чрез ковалентни връзки, последвано от имунооткриване.

Можете да анализирате смес от протеини, директно нанесени върху субстрата - dot blot анализ - или след предварителното й фракциониране чрез електрофокусиране, дискова електрофореза или двуизмерна електрофореза - Western blot анализ.

Патогенните антигени се разделят с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел, след което се прехвърлят от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и се проявяват с помощта на ELISA.

Компаниите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. . След това, след инкубация, пациентът се промива от несвързани антитела и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензим . Комплексът, образуван върху лентата (антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig) се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензим.

Тази методология се използва и за избор на клонове на бактерии, фаги или вируси, които експресират целевите клонирани генни продукти.

Прехвърлянето на протеини към мембраната се извършва или пасивно, или с помощта на електротрансферно оборудване. Ефективността на преноса на протеини към мембраната се влияе от много фактори, като например молекулното тегло на протеините, порьозността на гела, времето за пренос и състава на използвания буферен разтвор (транс-буфер).

В зависимост от целите и условията на експеримента се избират условия на трансфер, които дават най-добри резултати. Като субстрати обикновено се използват нитроцелулоза, поливинилиден дифлуорид (PVDF) или положително заредени найлонови мембрани. Нитроцелулозата може да свърже до 80 - 100 μg протеин на 1 cm2.

Протеините с ниско молекулно тегло (с молекулно тегло под 20 kDa) могат да бъдат загубени в резултат на измивания.Това дава възможност за предварително изследване на полиморфизма на определени генетични локуси въз основа на дължините на съответните ДНК рестрикционни фрагменти.

Освен това, използвайки Southern хибридизация, можете лесно да разберете дали целевият ген има място на хидролиза от определен рестрикционен ензим във вътрешната си част, което ви позволява да изберете оптималната стратегия за клониране на изследвания регион на генома.

Използвайки подобна схема, молекулите на РНК могат да бъдат прехвърлени от агарозен гел към нитроцелулозен филтър. Този метод беше наречен Northern blotting, за разлика от Southern blotting, тъй като името Southern означава „южен“ на английски.

Прехвърлянето на протеини върху филтри от гела съответно се нарича Western blotting. Големите протеини (>100 kDa), денатурирани в разтвор на натриев додецилсулфат (SDS), могат да бъдат лошо прехвърлени към мембраната, ако етанолът присъства в транс буфера. Алкохолът значително подобрява преноса на протеини от SDS-полиакриламидния гел, но стеснява порите в гела, което води до задържане на големи протеини.

PVDF мембраната е оптимизирана за имунооткриване и е способна да задържа до 160 μg/cm2 специфично свързани протеини с много ниски нива на неспецифично свързване.

Имуноблотинг

Важно свойство на тази мембрана е възможността за многократна употреба. Найлоновите мембрани Zeta-Probe ефективно свързват SDS протеини в отсъствието на алкохол и това свързване е устойчиво на последващо третиране. Протеините с ниско молекулно тегло също се задържат ефективно. С висок капацитет на свързване от приблизително 480 μg протеин на cm2, мембраните Zeta-Probe позволяват откриването на следи от протеин в тестовите смеси.

След като антигенът е имобилизиран върху мембраната, останалите места на свързване се блокират с разтвори на желатин, говежди серумен албумин или обезмаслено мляко.

След това мембраната се инкубира в разтвор на поликлонални или моноклонални антитела към изследвания антиген. След измиване на несвързаните антитела, мембраната се инкубира в разтвор на вторични антитела, които са конюгат на ензимите алкална фосфатаза (АР) или пероксидаза от хрян (HRP) с антивидови антитела (кози антитела срещу заешки, миши или човешки имуноглобулини ) или протеини A (протеин на Staphylococcus aureus) или G (протеин на Streptococcus sp.), имащи висок афинитет към Fc областта на имуноглобулините.

Откриването на образуваните имунни комплекси се извършва химически или хемилуминесцентно. Субстрати за химическата реакция при използване на конюгати на алкална фосфатаза са 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP) или син тетразол (NBT), а при използване на конюгати на пероксидаза от хрян - 4-хлоро-1-нафтол и водороден пероксид .

В резултат на ензимни реакции върху мембраната се образува цветна лента или петно ​​на мястото на локализиране на комплекса антиген-антитяло.

Чувствителността на този метод е 100 pg протеин при използване на AP конюгати и 100-500 pg при използване на HRP конюгати. Хемилуминесцентното откриване на имунни комплекси позволява откриването на по-малко от 5 pg антиген. Принципът на този метод е, че когато HRP реагира с водороден пероксид и цикличен диацилхидразин луминол, се излъчва светлина с дължина на вълната 428 nm, която може да бъде записана върху фоточувствителен филм.

Реакцията на имуноблотинг (IB) е разработена на базата на ELISA. Това е най-специфичният и чувствителен метод за имунохимичен анализ. Имуноблотингът (от англ. blot - петно, петно) съчетава ELISA с електрофореза. Използва се за откриване не на сложни антитела срещу HIV, а на антитела към отделните му структурни протеини (протеини p24, гликопротеини gp120, gp 41 и др.). Отнася се за експертни (потвърждаващи) реакции за диагностициране на HIV инфекция.

Реакцията протича на няколко етапа:

Вирусът се разрушава на компоненти - антигени (p24, gp120, gp 41 и др.), Които се подлагат на електрофореза в полиакриламиден гел, т.е. разделяне на антигени на фракции по молекулно тегло.

2. Гелът е покрит с нитроцелулозна мембрана и антигенните фракции се прехвърлят към него чрез електрофореза. Нитроцелулозата се държи като попивателна хартия. Мембраната се нарязва на ленти. Компаниите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени.

Имуноблотинг - допълнителен индиректен метод

Ленти, покрити с HIV антигени, се потапят в серума на субекта и след това се измиват, за да се отстрани несвързаният материал.

4. Лентите се инкубират с антиглобулинов серум, маркиран с пероксидаза и се промиват.

Добавя се субстратът и се отбелязва броят на цветните фракции (петна), които съответстват на зоната на локализация на комплекса AG-AT.

Наличието на ленти в определени области на лентата потвърждава наличието в тествания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени. Резултатът от имуноблотинга се счита за положителен, ако върху мембраната се виждат ивици, съответстващи на всеки два от трите HIV антигена - p24, gp41 и gp 120 (фиг. 37).

ЧЕРТЕЖИ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

Основна литература

Медицинска микробиология, вирусология и имунология: учебник за студенти по медицина. университети 2-ро изд., рев. и допълнителни — 702 стр. Изд. А.А. Воробьова. М.: MIA, 2012.

2. Микробиология, вирусология и имунология: ръководство за лабораторни упражнения: учебник/(В. Б. Сбойчаков и др.); редактиран от В. Б. Сбойчакова, М. М. Карапатс. – М.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 с.: ил.

3. Медицинска микробиология, имунология и вирусология [Електронен ресурс]: учебник за мед.

университети - 760 стр. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. Санкт Петербург: Спецслит, 2010.

4. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 тома / Т. 1. - 448 с. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М.: Geotar Media, 2010.

5. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. - 480 с. Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М.: Geotar Media, 2010.

допълнителна литература

1. Имунодиагностични реакции: учебник / комп.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Хуснаризанова, Ю. З. Габидулин, М. М. Алсинбаев - Уфа: Издателство на Държавната бюджетна образователна институция за висше професионално образование BSMU на Министерството на здравеопазването на Русия, 2016. - 86 с.

2. Характеристики на някои свойства, които определят патогенния потенциал на съвместно култивирани вариации на бактерии Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научна публикация / Ю. З. Габидулин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин - Уфа, 2015 г. - 250 с.

Начало » Имуноблот – какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Имуноблот - какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Какво е имуноблот? Това е често срещан метод за лабораторна диагностика на човешки вирусни инфекции. Това е един от най-точните и надеждни начини за откриване на наличието на ХИВ.

За надеждност той е дори по-голям от ензимно-свързания имуносорбентен анализ (elisa). Резултатите от имуноблот се считат за окончателни и убедителни Обща информация

Имуноблот - какво е това? За да разпознаете дадено лице като ХИВ, трябва да се подложите на лабораторен тест за изследване на кръвния серум за наличие на антитела.

Секциите Western blot се наричат ​​още Western blots. Използва се за откриване на човешки вирусни инфекции като допълнителен експертен метод. Това е необходимо за потвърждаване на ELISA - лабораторен тест, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV в кръвта. Повторна проверка на имуноблот положителен ELISA.

Счита се за най-чувствителния, сложен и скъп.

Мишена

Какво е имуноблот? Този метод за лабораторно изследване на кръвен серум за наличие на антитела срещу вируса.

По време на специални изследвания общите вирусни протеини са открити в гела и върху нитроцелулозни мембрани.

Имуноблотинг (откриване на антитела в серуми на пациенти срещу определени патогенни антигени)

Процедурата Western blot секция е предназначена за определяне на HIV инфекцията на различни етапи. На първия етап пречистеният вирус от съставните му части се подлага на електрофореза и включените в него антигени се разделят по молекулно тегло.

Вирусът на човешката имунна недостатъчност се възпроизвежда в живи клетки, заложени в неговата генетична информация. На този етап човек става носител на ХИВ вируса, ако сте били заразени.

Спецификата на това заболяване е, че не се проявява дълго време. Вирусът разрушава лимфоцитите, поради което имунитетът на човека намалява и тялото става неспособно да се бори с инфекциите.

Ако ХИВ се лекува правилно и своевременно, пациентът ще доживее до дълбока старост. Липсата на лечение неизбежно води до смърт. От момента на заразяване, но без лечение, максималният срок е не повече от десет години.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първия и втория тип.

Ако човек е заразен, след две седмици антителата могат да бъдат открити много по-късно. Особеност на ХИВ е, че количеството антитела нараства бързо и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, заболяването може да не се прояви две или повече години. Методът ELISA не винаги точно показва наличието на заболяването, изисквайки потвърждение на резултатите от PCR и Western blot срезове, ако ензимният имуноанализ показа положителен резултат.

Показания за

Какъв вид „имуноблотинг“ вече е открит, но кой се въвежда в изследването?

Причината за изследване за вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) ще бъде положителен резултат от ELISA. Необходимо е да се премине през ензимно-свързан имуносорбентен анализ при пациенти, на които предстои операция. Освен това трябва да направите анализ на жените, които планират бременност, както и тези, които са безразборни. Western blot срезове се предписват на пациенти с HIV инфекция, ако резултатите от Elisa са двусмислени.

Следните тревожни симптоми могат да бъдат причина да се свържете с лекар: бърза загуба на тегло; слабост, загуба на функция; чревни разстройства (диария), която продължава три седмици; дехидратация; треска; увеличени лимфни възли в тялото; развитие на кандидоза, туберкулоза , пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Не е необходимо пациентът да се подготвя преди даряването на венозна кръв.

Не яжте 8-10 часа преди теста. В деня преди кръводаряването не се препоръчва да се пие алкохол или кафе, да се правят тежки физически упражнения или да се тревожи.

Къде да направите анализа?

Къде мога да се изследвам за ХИВ?

ELISA, имуноблот анализ, извършен в градски частни клиники, дава резултати в рамките на един ден. Възможна е и спешна диагностика. В обществените институции медицинските тестове Elisa и Western blot секциите са безплатни в съответствие със законодателството на Руската федерация.

Задължителен скрининг за инфекциозни заболявания при бременни жени и пациенти, нуждаещи се от хоспитализация или операция Как се провежда това изследване?

Как се извършва ELISA? Имуноблот положителен/отрицателен потвърждава или опровергава резултатите от Елайза. Процедурата е доста проста. Специалистът взема венозна кръв, което отнема по-малко от пет минути.

След вземане на пробата мястото на инжектиране трябва да се дезинфекцира и да се покрие с превръзка. Вземането на проби се извършва на празен стомах, така че след процедурата няма да навреди да ядете блок черен шоколад или сладка топла напитка.

За да получите направление за безплатен тест в обществена медицинска институция, трябва да посетите терапевт.

Като цяло, имуноблотът не се различава от другите кръвни тестове чрез събиране. Методологията на изследването е проста. Ако вирусът присъства в кръвта на човек, тялото започва да произвежда антитела, за да го унищожи. За всеки вирус има много протеинови антигени. Откриването на тези антитела е в основата на метода на Western blot раздела. Цена

Колко време е анализът? ХИВ имуноблотът е един от най-евтините тестове.

Средно методите за имуноанализ варират от 500 до 900 рубли. Секциите Western blot са изследване на тестове, чиято цена варира от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR) ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Тълкуване на резултатите

Най-често срещаните методи за диагностициране на HIV инфекцията са ензимно-свързан имуносорбентен анализ и имуноблот.

Те се използват за определяне на антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус в серума. Инфекцията обикновено се потвърждава с два теста: скрининг и потвърждаващ. Резултатите трябва да бъдат интерпретирани от лекар, който поставя диагнозата и назначава лечение. Ако имуноблотът е положителен, това означава, че в човешкото тяло има вирус.

Положителният резултат не трябва да бъде причина за независимо лечение, тъй като всеки пациент може да има своя собствена картина на заболяването.

Качественият анализ включва скрининг и сертифициране. Ако вирусът не бъде открит при пациента, резултатът е „отрицателен“. Когато този сертификат бъде открит, се извършват допълнителни скринингови изследвания. Имуноблот анализ, който потвърждава или опровергава скрининга. Ако тест лентите се появят в определени тъмни области (локализация на протеини), се поставя диагноза ХИВ.

Ако резултатите са съмнителни, тогава тестовете се извършват в рамките на три месеца.

За да предотвратите инфекция с вируса на човешката имунна недостатъчност, е възможно, ако спазвате определени правила: избягвайте случаен сексуален контакт, използвайте презервативи по време на контакт, не използвайте наркотици.

Ако заболяването се открие при бременна жена, важно е да следвате препоръките на лекуващия лекар и не забравяйте да тествате за наличие на вируса.

Какво е Western blotting?

Идентифицирането на протеини в сложни смеси или екстракти от различни тъкани е един от често срещаните проблеми. С помощта на инструмент като специфични антитела е възможно да се определи изследваният протеин с минимални времеви и финансови разходи.

При Western blotting метода, на първия етап, смес от протеини се разделя чрез електрофореза в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS), след което се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електроблотинг.

Същността на този метод е, че след електрофореза гелът се поставя върху нитроцелулозна мембрана между слоевете филтърна хартия. Сглобеният по този начин „сандвич“ се поставя в електрическо поле, така че комплексите протеин-SDS да се движат през плочата на гела и да се обездвижват (в резултат на неспецифична сорбция) върху повърхността на нитроцелулозната мембрана.

Свързването на комплекса протеин-SDS с нитроцелулозната мембрана включва предимно сили от електрическо естество, като това взаимодействие е многоточково и води до „разпръскване“ на протеините по повърхността на мембраната. Така след електротрансфер се получава реплика на гел върху нитроцелулоза с протеини, разположени по същия начин, както в полиакриламиден гел.

След SDS електрофореза, електротрансфер и сорбция на протеини от гела върху нитроцелулозна мембрана, третичната конформация на протеина е силно променена, ако като цяло е правилно да се говори за съществуването на третична структура за протеина след такова сурово третиране. Следователно, за имунохимично откриване на изследвания протеин обикновено се използват само моно- или поликлонални антитела, специфични за линейни области на протеиновата молекула.

51. Имуноензимен анализ, имуноблотинг. Механизъм, компоненти, приложение.

Антителата, специфични за конформационни епитопи (или региони, включващи контакти между субединици), обикновено не са подходящи за използване при Western blotting.

След трансфер на протеин, мембраната се инкубира последователно с антитела, специфични за изследвания протеин, и след това с вторични антитела, специфични за Fc фрагментите на първичните антитела, конюгирани с ензимен (или някакъв друг) етикет (фиг.

1 А). В случай, че първичните антитела, специфични за изследвания антиген, са директно конюгирани с етикета, не са необходими вторични антитела (фиг. 1 B). Имунните комплекси, образувани на мястото на локализиране на изследвания протеин, се „проявяват“ с помощта на хромогенен субстрат (в зависимост от вида на етикета).

Чувствителността и специфичността на метода зависи до голяма степен от това какви антитела се използват в изследването.

Използваните антитела трябва да са специфични за уникална аминокиселинна последователност, характерна само за изследвания протеин. В противен случай е възможно взаимодействие (особено в случай на сурови протеинови екстракти) на антитела с няколко протеинови молекули, което от своя страна ще доведе до появата на няколко цветни ивици върху мембраната.

Идентифицирането на изследвания протеин в този случай често е трудно или дори невъзможно.

Вторият важен фактор, който трябва да имате предвид при избора на антитела, е афинитетът. Колкото по-висок е афинитетът на използваните антитела, толкова по-ярки и ясни са оцветените протеинови ленти, толкова по-висока е чувствителността на метода. Когато се използват антитела с висок афинитет, може да се постигне чувствителност от 1 ng или дори по-висока.

За визуализиране на резултата от взаимодействието между мембранно свързан антиген и антитела се използват вторични антитела, конюгирани с агенти, способни да произведат определен сигнал при определени условия.

Обикновено като такъв агент се използва ензим (пероксидаза или фосфатаза), чийто реакционен продукт е оцветен и се утаява върху мембраната под формата на неразтворима утайка.

Също така е възможно да се използват флуоресцентни етикети в този метод.

Ориз. 1. Схема на имунохимично оцветяване на изследвания протеин: А - използване на вторични антитела, конюгирани с ензимен маркер; B - първичното антитяло е директно конюгирано с ензимен маркер.

Протокол:

I. Приготвяне на гел и мембрана и протеинов електротрансфер

След електрофореза, полиакриламидният гел се поставя във вана с попиващ ​​буфер (25 mM Tris, рН 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол).

Два листа филтърна хартия, изрязани по формата на попивателната касета и навлажнени с попивателен буфер, се поставят върху частта от касетата, която ще гледа към анода. След това върху филтърната хартия се поставя нитроцелулозна мембрана, предварително навлажнена със същия буфер, като се уверява, че между мембраната и хартията няма въздушни мехурчета.

След това гелът трябва внимателно да се постави върху мембраната, като отново се обръща особено внимание на това да се гарантира, че няма въздушни мехурчета между гела и мембраната. Оформянето на сандвича се завършва с два слоя навлажнена филтърна хартия, които се поставят върху повърхността на гела (фиг. 2). Полученият сандвич се захваща в касета и се поставя между електродите, така че мембраната да гледа към анода.

Ориз. 2. Схема на електротрансфер на протеини към мембраната.

II. Електрически трансфер

Електротрансферът на протеини към нитроцелулозна мембрана се извършва в буфер, съдържащ 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30-50 минути при постоянно напрежение от 100 V.

Времето на електротрансфер зависи от размера на протеините, които се прехвърлят; колкото по-голям е протеинът, толкова по-дълго отнема електротрансферът. Качеството на електротрансфера и местоположението на протеиновите ленти се оценяват чрез оцветяване на нитроцелулозната мембрана с 0,3% разтвор на Ponceau S в 1% оцетна киселина. Преди имунохимично оцветяване, мембраната трябва да се измие няколко пъти със слабо алкален воден разтвор на Tris, за да се отстрани багрилото, свързано с протеините.

III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

За да се блокират местата на неспецифично свързване на антитела, мембраната се инкубира при постоянно разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути в PBST (за по-добро блокиране може да се използва разтвор на PBST, съдържащ 10% обезмаслено мляко на прах).

След блокиране, мембраната се инкубира за един час при стайна температура при постоянно разбъркване в PBST, съдържащ 1-10 μg/ml специфични антитела.

Оптималната концентрация на антитела се избира емпирично и зависи от афинитета на взаимодействието на антителата с антигена.

В края на инкубацията, измийте мембраната 5 пъти с PBST и я прехвърлете в разтвор на вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. Разреждането на конюгата обикновено се посочва от производителя върху опаковката или се избира емпирично от изследователя. Инкубирайте мембраната в разтвора на вторичното антитяло за 1 час при постоянно разбъркване.

След цялостно промиване (смяна на буфера поне 5-6 пъти), PBST мембраната се прехвърля в хромогенен субстратен разтвор, съдържащ 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 μl 30% водороден пероксид в 10 ml 0,1 M Tris-HCl , pH 7,6.

Инкубацията се извършва при разбъркване в продължение на 5 - 10 минути. След приключване на инкубацията със субстрата, мембраната трябва да се измие с PBST, да се изсуши чрез попиване с филтърна хартия и незабавно да се направи електронно копие чрез сканиране в цвят. Ако мембраната изсъхне напълно, боядисаните протеинови ивици избледняват и изображението се оказва по-малко ярко и контрастно.

Забележка: DAB е токсичен и потенциален канцероген. Работете само с гумени ръкавици!

Навременната диагностика на ХИВ инфекцията става изключително важна мярка, тъй като ранното започване на лечението може до голяма степен да определи по-нататъшното развитие на заболяването и да удължи живота на пациента. През последните години се наблюдава значителен напредък в идентифицирането на тази ужасна болест: по-старите тестови системи се заменят с по-модерни, методите за изследване стават по-достъпни и тяхната точност значително се увеличава.

В тази статия ще говорим за съвременните методи за диагностициране на ХИВ инфекцията, чието познаване е полезно за навременно лечение на този проблем и поддържане на нормално качество на живот на пациента.

Методи за диагностика на ХИВ

В Русия се провежда стандартна процедура за диагностициране на ХИВ инфекцията, която включва две нива:

• ELISA тест система (скрининг анализ);
• имуноблотинг (IB).

За диагностика могат да се използват и други методи:

• бързи тестове.

ELISA тест системи

На първия етап от диагностицирането се използва скринингов тест (ELISA) за откриване на HIV инфекция, който се основава на HIV протеини, създадени в лаборатории, които улавят специфични антитела, произведени в тялото в отговор на инфекция. След взаимодействието им с реагентите (ензимите) на тест системата цветът на индикатора се променя. След това тези промени в цвета се обработват с помощта на специално оборудване, което определя резултата от направения анализ.

Такива ELISA тестове могат да покажат резултати в рамките на няколко седмици след въвеждането на HIV инфекцията. Този тест не определя наличието на вируса, но открива производството на антитела към него. Понякога в човешкото тяло производството на антитела срещу ХИВ започва след 2 седмици след инфекцията, но при повечето хора те се произвеждат на по-късна дата, след 3-6 седмици.

Има четири поколения ELISA тестове с различна чувствителност. През последните години все повече се използват трето и четвърто поколение тест системи, които са базирани на синтетични пептиди или рекомбинантни протеини и имат по-голяма специфичност и точност. Те могат да се използват за диагностициране на ХИВ инфекция, наблюдение на разпространението на ХИВ и осигуряване на безопасност при тестване на дарена кръв. Точността на тестовите системи ELISA III и IV поколение е 93-99% (тестовете, произведени в Западна Европа, са по-чувствителни - 99%).

За извършване на ELISA тест се вземат 5 ml кръв от вената на пациента. Между последното хранене и анализа трябва да изминат най-малко 8 часа (обикновено се извършва сутрин на празен стомах). Препоръчително е да направите такъв тест не по-рано от 3 седмици след предполагаемата инфекция (например след незащитен полов акт с нов сексуален партньор).

Резултатите от теста ELISA се получават след 2-10 дни:

• отрицателен резултат: показва липса на HIV инфекция и не изисква контакт със специалист;
• фалшиво отрицателен резултат: може да се наблюдава в ранните стадии на инфекция (до 3 седмици), в по-късните стадии на СПИН при тежко потискане на имунната система и при неправилна подготовка на кръвта;
• фалшив положителен резултат: може да се наблюдава при някои заболявания и при неправилна подготовка на кръвта;
• положителен резултат: показва HIV инфекция, изисква провеждане на IB и пациентът да се свърже със специалист в центъра за СПИН.

Защо тестът ELISA може да даде фалшиво положителни резултати?

Фалшиво положителни резултати от теста ELISA за ХИВ могат да възникнат поради неправилна обработка на кръвта или при пациенти със следните състояния и заболявания:

• множествена миелома;
• инфекциозни заболявания, причинени от вируса на Epstein-Barr;
• състояние след ;
• автоимунни заболявания;
• на фона на бременност;
• състояние след ваксинация.

Поради описаните по-горе причини в кръвта могат да присъстват неспецифични кръстосано реагиращи антитела, чието производство не е провокирано от HIV инфекция.

През последните години честотата на фалшиво положителните резултати е намаляла значително поради използването на тестови системи от поколение III и IV, които съдържат по-чувствителни пептидни и рекомбинантни протеини (те се синтезират с помощта на генно инженерство in vitro). След въвеждането на такива ELISA тестове, честотата на фалшивите положителни резултати намалява значително и е около 0,02-0,5%.

Фалшиво положителен резултат не означава, че лицето е заразено с ХИВ. В такива случаи СЗО препоръчва провеждането на друг тест ELISA (задължително IV поколение).

Кръвта на пациента се изпраща в референтна или арбитражна лаборатория с маркировка „повтаряне“ и се изследва с помощта на тест система IV поколение ELISA. Ако резултатът от новия анализ е отрицателен, тогава първият резултат се счита за грешен (фалшиво положителен) и IS не се извършва. Ако резултатът е положителен или съмнителен по време на втория тест, пациентът трябва да се подложи на IB след 4-6 седмици, за да потвърди или отхвърли HIV инфекцията.

Имунен блотинг

Окончателна диагноза ХИВ инфекция може да бъде направена само след получаване на положителен резултат от имуноблотинг (IB). За извършването му се използва нитроцелулозна лента, върху която се нанасят вирусни протеини.

Вземането на кръв за IB се извършва от вена. След това се подлага на специална обработка и протеините, съдържащи се в серума му, се разделят в специален гел според техния заряд и молекулно тегло (манипулацията се извършва със специална апаратура под въздействието на електрическо поле). Нитроцелулозна лента се нанася върху гела от кръвен серум и се извършва блотинг („блотинг“) в специална камера. Лентата се обработва и ако използваните материали съдържат антитела срещу HIV, те се свързват с антигенните ленти на IB и се появяват като линии.

IB се счита за положителен, ако:

• според американските критерии на CDC - на лентата има две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
• според американските критерии на FDA лентата има две линии p24, p31 и линия gp41 или gp120/gp160.

В 99,9% от случаите положителният IB резултат показва HIV инфекция.

Ако няма линии, IB е отрицателен.

При идентифициране на линии с gr160, gr120 и gr41, IB е съмнително. Този резултат може да възникне, когато:

• онкологични заболявания;
• бременност;
• чести кръвопреливания.

В такива случаи се препоръчва да се повтори изследването с помощта на комплект от друга компания. Ако след допълнително IB резултатът остане съмнителен, тогава е необходимо наблюдение в продължение на шест месеца (IB се извършва на всеки 3 месеца).

Полимеразна верижна реакция

PCR тест може да открие РНК на вируса. Неговата чувствителност е доста висока и позволява откриване на HIV инфекция в рамките на 10 дни след заразяването. В някои случаи PCR може да даде фалшиво положителни резултати, тъй като неговата висока чувствителност може да реагира и на антитела към други инфекции.

Тази диагностична техника е скъпа и изисква специално оборудване и висококвалифицирани специалисти. Тези причини не позволяват извършването на масово тестване на населението.

PCR се използва в следните случаи:

• за откриване на ХИВ при новородени, родени от инфектирани с ХИВ майки;
• за откриване на ХИВ в „периода на прозореца” или при съмнителна ИБ;
• за контрол на концентрацията на ХИВ в кръвта;
• за изследване на донорска кръв.

PCR тестът сам по себе си не поставя диагноза ХИВ, а се провежда като допълнителен диагностичен метод за разрешаване на спорни ситуации.

Експресни методи

Едно от новостите в диагностиката на ХИВ са бързите тестове, чиито резултати могат да бъдат оценени в рамките на 10-15 минути. Най-ефективни и точни резултати се получават с помощта на имунохроматографски тестове, базирани на принципа на капилярния поток. Те представляват специални ленти, върху които се нанася кръв или други тестови течности (слюнка, урина). Ако има антитела срещу HIV, след 10-15 минути върху теста се появява цветна и контролна лента - положителен резултат. Ако резултатът е отрицателен, се появява само контролната лента.

Както при ELISA тестовете, резултатите от бързите тестове трябва да бъдат потвърдени от IB анализ. Само след това може да се постави диагноза HIV инфекция.

Има налични комплекти за бързи домашни тестове. Тестът OraSure Technologies1 (САЩ) е одобрен от FDA, предлага се без рецепта и може да се използва за откриване на ХИВ. След теста, ако резултатът е положителен, на пациента се препоръчва да се подложи на преглед в специализиран център за потвърждаване на диагнозата.

Други тестове за домашна употреба все още не са одобрени от FDA и техните резултати могат да бъдат много съмнителни.

Въпреки факта, че бързите тестове са по-ниски по точност от тестовете ELISA от IV поколение, те се използват широко за допълнително изследване на населението.

Можете да направите тестове за откриване на ХИВ инфекция във всяка клиника, централна областна болница или специализирани центрове за СПИН. На територията на Русия те се извършват абсолютно конфиденциално или анонимно. Всеки пациент може да очаква да получи медицинска или психологическа консултация преди или след теста. Ще трябва да платите само за тестове за ХИВ в търговските медицински институции, докато в държавните клиники и болници те се извършват безплатно.

Прочетете за начините, по които можете да се заразите с ХИВ и какви митове съществуват за възможностите да се заразите.

Името му е СПИН Вячеслав Залманович Тарантул

Имуноблотинг - допълнителен индиректен метод

В допълнение към ELISA, в определени случаи се използва процедура, наречена „имуноблотинг“ или „имуноблотинг“ (понякога наричана „Western blotting“) за тестване на HIV инфекция. Според препоръките на СЗО имуноблотингът се използва при диагностицирането на HIV инфекцията като допълнителен експертен метод, който трябва да потвърди резултатите от ELISA. Обикновено този метод проверява двойно положителен резултат от ELISA, тъй като се счита за по-чувствителен и специфичен, въпреки че е по-сложен и скъп. Но преди да подпише окончателната присъда на пациента, лекарят трябва да е напълно сигурен в правилността на диагнозата. Следователно въпросът за сложността и високата цена не може да бъде определящ тук.

Както по отношение на предназначението си, така и по метода на изпълнение, добре познатият израз „сложи го на попивателна машина“ е много подходящ за имуноблотинг. Имуноблотингът съчетава ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им върху нитроцелулозна мембрана („блотър“). Процедурата за имуноблот се състои от няколко етапа (фиг. 27). Първо, HIV, предварително пречистен и унищожен на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза и всички антигени, включени във вируса, се разделят по молекулно тегло. След това, използвайки метода на попиване (аналогично на изстискване на излишното мастило върху попивателна подложка), антигените се прехвърлят от гела към лента от нитроцелулоза или найлонов филтър, който вече съдържа спектър от протеини, характерни за HIV, невидими за окото. . След това тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху лентата и ако пробата съдържа специфични антитела, те се свързват с антигенните протеинови ленти, които стриктно съответстват на тях. В резултат на последващи манипулации (подобно на ELISA), резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. В крайна сметка наличието на ивици в определени области на лентата потвърждава наличието в тествания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

Имуноблотингът най-често се използва за потвърждаване на диагнозата HIV инфекция. СЗО счита за положителни серуми, в които чрез имуноблотинг се откриват антитела срещу всеки два протеина от обвивката на ХИВ. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41) в комбинация или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен и се препоръчва повторно тестване с помощта на комплект от различни серии или от друга компания. За по-сигурно, ако

Ориз. 27. За да се извърши имуноблотинг, в първия етап протеините, съдържащи се в кръвния серум, се разделят в гел според тяхното молекулно тегло и заряд с помощта на електрическо поле (чрез гел електрофореза). След това нитроцелулозна или найлонова мембрана се поставя върху гела и се "попива" (това е попиване). Това се извършва в специална камера, която позволява пълно пренасяне на материала от гела към мембраната. В резултат моделът на подреждане на протеини, който е върху гела, се възпроизвежда върху мембраната (петно), която след това може лесно да бъде манипулирана. Първоначално мембраната се третира с антитела към желания антиген и след измиване на несвързания материал се добавя радиоактивно белязан конюгат, който специфично се свързва с антителата (както при ELISA). Местоположението на получения антиген-антитяло-белязан конюгатен комплекс се определя чрез авторадиография с помощта на рентгенов филм. След проявата му става ясно дали има антигени в кръвта или не и след това резултатът остава съмнителен, препоръчва се проследяване за шест месеца (изследванията продължават на всеки три месеца).

В момента в Руската федерация се препоръчва използването на пет тестови системи за диагностициране на ХИВ инфекция, сред които има както руски, така и чуждестранни.