Интерферон алфа 2b човешки какво. Медицински справочник geotar. Признание от научната общност

вещество-разтвор: опРег. №: LSR-007009/08

Клинична и фармакологична група:

Форма за освобождаване, състав и опаковка

вещество -решение.

бутилки (1) - картонени опаковки.

Описание на активните компоненти на лекарството " Интерферон алфа-2b»

фармакологичен ефект

Интерферон. Това е високо пречистен рекомбинантен протеин с молекулно тегло 19 300 далтона. Получен от клонинг на Escherichia coli чрез хибридизиране на бактериални плазмиди с човешкия левкоцитен ген, кодиращ синтеза на интерферон. За разлика от интерферона, алфа-2а има аргинин на позиция 23.

Има антивирусен ефект, който се дължи на взаимодействие със специфични мембранни рецептори и индукция на синтеза на РНК и в крайна сметка на протеини. Последните от своя страна предотвратяват нормалното възпроизвеждане на вируса или неговото освобождаване.

Има имуномодулираща активност, която е свързана с активиране на фагоцитозата, стимулиране на образуването на антитела и лимфокини.

Има антипролиферативен ефект върху туморните клетки.

Показания

Остър хепатит B, хроничен хепатит B, хроничен хепатит C.

Косматоклетъчна левкемия, хронична миелоидна левкемия, бъбречноклетъчен карцином, сарком на Капоши, дължащ се на СПИН, кожен Т-клетъчен лимфом (фунгоидна микоза и синдром на Sézary), злокачествен меланом.

Дозов режим

Прилага се интравенозно или подкожно. Дозата и схемата на лечение се определят индивидуално, в зависимост от показанията.

Страничен ефект

Грипоподобни симптоми:често - треска, втрисане, болки в костите, ставите, очите, миалгия, главоболие, повишено изпотяване, световъртеж.

От храносмилателната система:възможен намален апетит, гадене, повръщане, диария, запек, нарушен вкус, сухота в устата, загуба на тегло, лека коремна болка, леки промени в чернодробните функционални тестове (обикновено се нормализират след лечение).

От централната нервна система и периферната нервна система:рядко - замаяност, влошаване на умствената дейност, нарушение на съня, нарушение на паметта, тревожност, нервност, агресивност, еуфория, депресия (след продължително лечение), парестезия, невропатия, тремор; в някои случаи - суицидни тенденции, сънливост.

От страна на сърдечно-съдовата система:възможно - тахикардия (с треска), артериална хипотония или хипертония, аритмия; в някои случаи - нарушения на сърдечно-съдовата система, коронарна артериална болест, инфаркт на миокарда.

От страна на дихателната система:рядко - болка в гърдите, кашлица, лек задух; в някои случаи - пневмония, белодробен оток.

От страна на хематопоетичната система:възможна лека левкопения, тромбоцитопения, гранулоцитопения.

Дерматологични реакции:възможен сърбеж, обратима алопеция.

Други:рядко - мускулна скованост; в отделни случаи - антитела към естествени или рекомбинантни интерферони.

Противопоказания

Тежки сърдечно-съдови заболявания, декомпенсирана чернодробна цироза, тежка депресия, психоза, алкохолна или наркотична зависимост, повишена чувствителност към интерферон алфа-2b.

Бременност и кърмене

Употребата по време на бременност е възможна само ако очакваната полза от лечението за майката надвишава потенциалния риск за плода.

Не е известно дали интерферон алфа-2b се екскретира в кърмата. Ако е необходимо да се използва по време на кърмене, трябва да се реши въпросът за спиране на кърменето.

Жените в детеродна възраст трябва да използват надеждна контрацепция по време на лечението.

Употреба при чернодробна дисфункция

Противопоказан при декомпенсирана чернодробна цироза. Да се ​​прилага с повишено внимание при пациенти с увредена чернодробна функция.

Употреба при бъбречно увреждане

Да се ​​използва с повишено внимание при пациенти с увредена бъбречна функция.

специални инструкции

Да се ​​използва с повишено внимание при пациенти с увредена бъбречна, чернодробна, костно-мозъчна хематопоеза или склонност към опити за самоубийство.

При пациенти със заболявания на сърдечно-съдовата система е възможна аритмия. Ако аритмията не намалява или се увеличава, дозата трябва да се намали 2 пъти или лечението да се спре.

По време на лечението е необходимо наблюдение на неврологичния и психичния статус.

При тежко потискане на хематопоезата на костния мозък е необходимо редовно изследване на състава на периферната кръв.

Интерферон алфа-2b има стимулиращ ефект върху имунната система и трябва да се използва с повишено внимание при пациенти, склонни към автоимунни заболявания поради повишен риск от автоимунни реакции.

Лекарствени взаимодействия

Лекарствени взаимодействия

Интерферон алфа-2b инхибира метаболизма на теофилин и намалява неговия клирънс.

Всмукване

При подкожно или интрамускулно приложение на интерферон алфа-2b неговата бионаличност варира от 80% до 100%. След приложение на интерферон алфа-2b Tmax в кръвната плазма е 4-12 часа, T1 / 2 - 2-6 часа 16-24 часа след приложението рекомбинантният интерферон не се открива в кръвния серум.

Метаболизъм

Метаболизмът се извършва в черния дроб.

Алфа интерфероните могат да нарушат окислителните метаболитни процеси, намалявайки активността на микрозомалните чернодробни ензими на системата на цитохром Р450.

Премахване

Екскретира се главно чрез бъбреците чрез гломерулна филтрация.

Предозиране

Няма данни за предозиране на Altevir®.

Условия за съхранение

Лекарството трябва да се съхранява на място, недостъпно за деца, в съответствие със SP 3.3.2-1248-03 при температура от 2 ° до 8 ° C; не замразявайте.

Взаимодействие с други лекарства

Лекарствените взаимодействия между Altevir и други лекарства не са напълно проучени. Altevir® трябва да се използва с повишено внимание едновременно със хипнотици и седативи, наркотични аналгетици и лекарства, които потенциално имат миелосупресивен ефект.

Когато Altevir и теофилин се предписват едновременно, трябва да се следи концентрацията на последния в кръвния серум и, ако е необходимо, да се промени режимът на дозиране.

Когато Altevir се използва в комбинация с химиотерапевтични лекарства (цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, тенипозид), рискът от развитие на токсични ефекти се увеличава.

Страничен ефект

Общи реакции: много често - треска, слабост (те са дозозависими и обратими реакции, изчезват в рамките на 72 часа след прекъсване на лечението или неговото прекратяване), втрисане; по-рядко - неразположение.

От страна на централната нервна система: много често - главоболие; по-рядко - астения, сънливост, замаяност, раздразнителност, безсъние, депресия, суицидни мисли и опити; рядко - нервност, тревожност.

От опорно-двигателния апарат: много често - миалгия; по-рядко - артралгия.

От храносмилателната система: много често - загуба на апетит, гадене; по-рядко - повръщане, диария, сухота в устата, промяна на вкуса; рядко - коремна болка, диспепсия; възможно е обратимо повишаване на активността на чернодробните ензими.

От сърдечно-съдовата система: често - понижено кръвно налягане; рядко - тахикардия.

Дерматологични реакции: по-рядко - алопеция, повишено изпотяване; рядко - кожен обрив, сърбеж.

От страна на хемопоетичната система: възможна е обратима левкопения, гранулоцитопения, понижени нива на хемоглобина, тромбоцитопения.

Други: рядко - загуба на тегло, автоимунен тиреоидит.

Съединение

човешки рекомбинантен интерферон алфа-2b 3 милиона IU

Помощни вещества: натриев ацетат, натриев хлорид, динатриева сол на етилендиамин тетраоцетна киселина, Tween-80, декстран 40, вода за инжекции.

Начин на употреба и дози

Прилага се подкожно, интрамускулно и интравенозно. Лечението трябва да започне от лекар. След това, с разрешение на лекаря, пациентът може самостоятелно да приложи поддържаща доза (в случаите, когато лекарството се предписва подкожно или интрамускулно).

Хроничен хепатит B: Altevir® се прилага подкожно или интрамускулно в доза от 5-10 милиона IU 3 пъти седмично в продължение на 16-24 седмици. Лечението се спира след 3-4 месеца употреба при липса на положителна динамика (според изследване на ДНК на вируса на хепатит В).

Хроничен хепатит С: Altevir® се прилага подкожно или интрамускулно в доза от 3 милиона IU 3 пъти седмично в продължение на 24-48 седмици. При пациенти с рецидивиращ ход на заболяването и пациенти, които преди това не са били лекувани с интерферон алфа-2b, ефективността на лечението се увеличава с комбинирана терапия с рибавирин. Продължителността на комбинираната терапия е най-малко 24 седмици. Терапията с Altevir трябва да се провежда в продължение на 48 седмици при пациенти с хроничен хепатит С и 1-ви генотип на вируса с висок вирусен товар, при които РНК на вируса на хепатит С не се открива в кръвния серум до края на първите 24 седмици. на лечение.

Ларингеална папиломатоза: Altevir® се прилага подкожно в доза 3 милиона IU/m2 3 пъти седмично. Лечението започва след хирургично (или лазерно) отстраняване на туморната тъкан. Дозата се избира, като се вземе предвид поносимостта на лекарството. Постигането на положителен отговор може да изисква лечение в продължение на 6 месеца.

Косматоклетъчна левкемия: препоръчваната доза Altevir за подкожно приложение при пациенти след или без спленектомия е 2 милиона IU/m2 3 пъти седмично. В повечето случаи нормализирането на един или повече хематологични параметри настъпва след 1-2 месеца лечение, възможно е да се увеличи периодът на лечение до 6 месеца. Този режим на дозиране трябва да се спазва непрекъснато, освен ако не се появи бърза прогресия на заболяването или симптоми на тежка непоносимост към лекарството.

Хронична миелоидна левкемия: препоръчителната доза Altevir като монотерапия е 4-5 милиона IU/m2 на ден подкожно дневно. За поддържане на броя на левкоцитите може да е необходима доза от 0,5-10 милиона IU/m2. Ако лечението позволява да се постигне контрол на броя на левкоцитите, тогава за поддържане на хематологична ремисия лекарството трябва да се използва в максималната поносима доза (4-10 милиона IU / m2 дневно). Лекарството трябва да се преустанови след 8-12 седмици, ако терапията не доведе до частична хематологична ремисия или клинично значимо намаляване на броя на левкоцитите.

Неходжкинов лимфом: Altevir® се използва като адювантна терапия в комбинация със стандартни схеми на химиотерапия. Лекарството се прилага подкожно в доза от 5 милиона IU/m2 3 пъти седмично в продължение на 2-3 месеца. Дозата трябва да се коригира в зависимост от поносимостта на лекарството.

Меланом: Altevir® се използва като адювантна терапия, когато има висок риск от рецидив при възрастни след отстраняване на тумора. Altevir® се прилага интравенозно в доза от 15 милиона IU/m2 5 пъти седмично в продължение на 4 седмици, след това подкожно в доза от 10 милиона IU/m2 3 пъти седмично в продължение на 48 седмици. Дозата трябва да се коригира в зависимост от поносимостта на лекарството.

Множествен миелом: Altevir® се предписва в периода на постигане на стабилна ремисия в доза от 3 милиона IU / m2 3 пъти седмично подкожно.

Сарком на Капоши, дължащ се на СПИН: оптималната доза не е установена. Лекарството може да се използва в дози от 10-12 милиона IU/m2/ден подкожно или интрамускулно. Ако заболяването се стабилизира или се повлияе от лечението, терапията продължава, докато настъпи регресия на тумора или се наложи спиране на лекарството.

Рак на бъбреците: оптималната доза и схема не са установени. Препоръчва се лекарството да се прилага подкожно в дози от 3 до 10 милиона IU/m2 3 пъти седмично.

Приготвяне на разтвор за интравенозно приложение

Изтеглете обема от разтвора Altevir, необходим за приготвяне на необходимата доза, добавете го към 100 ml стерилен 0,9% разтвор на натриев хлорид и го приложете в продължение на 20 минути.

Описание на продукта

Инжекционният разтвор е прозрачен, безцветен.

С повишено внимание (предпазни мерки)

Употреба при чернодробна дисфункция

Употреба при бъбречно увреждане

Лекарството е противопоказано при тежка бъбречна и / или чернодробна недостатъчност (включително причинена от наличието на метастази).

специални инструкции

Преди лечение с Altevir за хроничен вирусен хепатит B и C се препоръчва извършване на чернодробна биопсия за оценка на степента на увреждане на черния дроб (признаци на активен възпалителен процес и/или фиброза). Ефективността на лечението на хроничен хепатит С се увеличава при комбинирана терапия с Altevir и рибавирин. Употребата на Altevir не е ефективна при развитие на декомпенсирана чернодробна цироза или чернодробна кома.

Ако по време на лечението с Altevir се появят нежелани реакции, дозата на лекарството трябва да се намали с 50% или лекарството трябва временно да се преустанови, докато изчезнат. Ако нежеланите реакции продължават или се появяват отново след намаляване на дозата или се наблюдава прогресия на заболяването, лечението с Altevir трябва да се прекрати.

Ако нивото на тромбоцитите спадне под 50x109/l или нивото на гранулоцитите под 0,75x109/l, се препоръчва дозата на Altevir да се намали 2 пъти с проследяване на кръвните изследвания след 1 седмица. Ако тези промени продължават, лекарството трябва да се прекрати.

Ако нивото на тромбоцитите намалее под 25x109/l или нивото на гранулоцитите под 0,5x109/l, се препоръчва преустановяване на Altevir® с проследяване на кръвните изследвания след 1 седмица.

При пациенти, получаващи препарати с интерферон алфа-2b, в кръвния серум могат да бъдат открити антитела, които неутрализират неговата антивирусна активност. В почти всички случаи титрите на антителата са ниски, появата им не води до намаляване на ефективността на лечението или появата на други автоимунни нарушения.

Употреба по време на бременност и кърмене

Лекарството е противопоказано по време на бременност и кърмене (кърмене).

Форма за освобождаване

Инжекционният разтвор е прозрачен, безцветен.
1 мл
човешки рекомбинантен интерферон алфа-2b 3 милиона IU
Помощни вещества: натриев ацетат, натриев хлорид, динатриева сол на етилендиамин тетраоцетна киселина, Tween-80, декстран 40, вода

Срок на годност от датата на производство

18 месеца

Показания за употреба

Като част от комплексната терапия при възрастни:

С хроничен вирусен хепатит В без признаци на чернодробна цироза;

За хроничен вирусен хепатит С при липса на симптоми на чернодробна недостатъчност (монотерапия или комбинирана терапия с рибавирин);

С папиломатоза на ларинкса;

При генитални брадавици;

За косматоклетъчна левкемия, хронична миелоидна левкемия, неходжкинов лимфом, меланом, мултиплен миелом, сарком на Капоши, дължащ се на СПИН, прогресиращ рак на бъбреците.

Противопоказания

Анамнеза за тежко сърдечно-съдово заболяване (неконтролирана хронична сърдечна недостатъчност, скорошен миокарден инфаркт, тежки нарушения на сърдечния ритъм);

Тежка бъбречна и/или чернодробна недостатъчност (включително причинена от наличието на метастази);

Епилепсия, както и тежки нарушения на централната нервна система, особено изразени чрез депресия, суицидни мисли и опити (включително анамнеза);

Хроничен хепатит с декомпенсирана чернодробна цироза и при пациенти, получаващи или наскоро лекувани с имуносупресори (с изключение на завършено краткосрочно лечение с кортикостероиди);

Автоимунен хепатит или друго автоимунно заболяване;

Лечение с имуносупресори след трансплантация;

Заболяване на щитовидната жлеза, което не може да се контролира с общоприетите терапевтични методи;

Декомпенсирани белодробни заболявания (включително ХОББ);

Декомпенсиран захарен диабет;

Хиперкоагулация (включително тромбофлебит, белодробна емболия);

Тежка миелодепресия;

Бременност;

Период на кърмене (кърмене);

Свръхчувствителност към компонентите на лекарството.

фармакологичен ефект

Интерферон. Altevir® има антивирусно, имуномодулиращо, антипролиферативно и противотуморно действие.

Интерферон алфа-2b, взаимодействайки със специфични рецептори на клетъчната повърхност, инициира сложна верига от промени вътре в клетката, включително индукция на синтеза на редица специфични цитокини и ензими, и нарушава синтеза на вирусна РНК и вирусни протеини в клетката. Резултатът от тези промени е неспецифична антивирусна и антипролиферативна активност, свързана с предотвратяването на вирусната репликация в клетката, инхибирането на клетъчната пролиферация и имуномодулиращия ефект на интерферона. Интерферон алфа-2b стимулира процеса на представяне на антиген към имунокомпетентни клетки, има способността да стимулира фагоцитната активност на макрофагите, както и цитотоксичната активност на Т-клетките и клетките "естествени убийци", участващи в антивирусния имунитет.

Предотвратява клетъчната пролиферация, особено туморните клетки. Има инхибиторен ефект върху синтеза на някои онкогени, което води до инхибиране на туморния растеж.

Странични ефекти на интерферон бета.

Изобретението се отнася до генното инженерство, биотехнологиите, медицината, фармакологията. Нов рекомбинантен мултикопиен плазмиден ДНК pSX50, кодиращ синтеза на човешки левкоцитен алфа-2b интерферон, чиято експресия е под контрола на лактозни и триптофанови промотори и терминатор на транскрипция. В резултат на трансформация на клетки от реципиентния щам E. coli BL21 с рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50 се получава щам E. coli SX50 - продуцент на рекомбинантен левкоцитен човешки алфа-2b интерферон с продуктивност до 0,9-1,0 g от алфа-2b интерферон от 1 литър хранителна среда. Методът за получаване на рекомбинантен алфа-2b интерферон се основава на използването на създаден рекомбинантен щам на Е. coli SX50 и включва неговото дълбоко култивиране върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати в процеса на биосинтеза , механично разрушаване на клетките на микроорганизма при високо налягане, разтваряне на агрегирания протеин в концентриран разтвор на гуанидин хидрохлорид, последвано от ренатуриране на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти и неговото пречистване с помощта на тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху Хелатиращи Sepharose Fast Flow смоли, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли като Sephsrose Fast Flow SM и гел филтрационна хроматография върху смоли тип Superdex 75. Методът дава възможност да се получи интерфероново вещество с повече от 99% чистота според електрофореза в редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро и повече от 98% според RF HPLC и без пирогени (LAL тест) в количества най-малко 400-800 mg на 1 литър хранителна среда. 3 п. и 3 длъжности заплата, 6 ил.

Чертежи за RF патент 2242516

Изобретението се отнася до генетично модифицирани лекарствени продукти, получени по биотехнологичен път, а именно до методи за промишлено производство на рекомбинантен човешки левкоцитен интерферон алфа-2b за медицински цели (наричан по-нататък интерферон), както и до рекомбинантни продуциращи щамове на Escherichia coli (E. coli) и плазмидна ДНК, кодираща синтеза на интерферон.

Интерфероните са протеинови молекули с молекулно тегло от 15 000 до 21 000 далтона, произведени и секретирани от клетките в отговор на вирусна инфекция или други патогени. Има три основни групи интерферони: алфа, бета и гама. Самите тези групи не са хомогенни и могат да съдържат няколко различни молекулни вида интерферон. По този начин са идентифицирани повече от 14 генетични разновидности на интерферон алфа, които представляват интерес и се използват широко в медицината като антивирусни, антипролиферативни и имуномодулиращи средства.

Известни са методи за получаване на човешки левкоцитен интерферон от левкоцити на човешка донорска кръв, индуцирани от вируси и други индуктори (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Основният недостатък на тези методи за производство на интерферони е вероятността от заразяване на крайния продукт с човешки вируси, като вирус на хепатит B и C, вирус на имунна недостатъчност и др.

Понастоящем методът за производство на интерферон чрез микробиологичен синтез е признат за по-обещаващ, което прави възможно получаването на целевия продукт със значително по-висок добив от сравнително евтини изходни материали. Подходите, използвани тук, позволяват да се създадат варианти на структурен ген, които са оптимални за бактериална експресия, както и регулаторни елементи, които контролират неговата експресия.

Като изходни микроорганизми се използват различни щамове на Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатъкът на използването на P. pastoris като производител на интерферон (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //Високо ниво на експресия на човешки IFN-2b в Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), Условията на ферментация на този вид дрожди са изключително трудни, необходимостта от стриктно поддържане на концентрацията на индуктора, по-специално на метанола, по време на процеса на биосинтеза. Недостатъкът на използването на Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) е сложността на процеса на ферментация при ниско ниво на експресия (10 mg интерферон на 1 литър културална среда). По-продуктивно е използването на щамове Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Известни са голям брой плазмиди и създадени на тяхна база щамове E. coli, които експресират интерферон: щамове E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмиди Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli щам pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli щам pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli щам SG 20050 с плазмид p280/21FN (Kravchenko V.V. и др., Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, no. 9, pp. и др. Недостатъкът на технологиите, базирани на използването на тези щамове, е тяхната нестабилност, както и недостатъчното ниво на експресия на интерферон.

Наред с характеристиките на използваните щамове, ефективността на процеса до голяма степен зависи от използваната технология за изолиране и пречистване на интерферона.

Съществува известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на Ps клетки. putida, разрушаване на биомаса, третиране с полиетиленимин, фракциониране с амониев сулфат, хидрофобна хроматография върху фенилсилохром С-80, рН фракциониране на лизата, неговото концентриране и диафилтрация, йонообменна хроматография върху целулоза DE-52, елуиране в рН градиент, йон обменна хроматография на получения елуент върху целулоза SM -52, концентриране чрез преминаване през филтърна касета и гел филтруване върху Sephadex G-100 (SU 1640996). Недостатък на този метод, освен сложната многоетапна ферментация, е и многоетапността на процеса при получаване на крайния продукт.

Съществува и известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на щам E. coli SG 20050/pIF16 в LB бульон в колби в термостатиран шейкър, центрофугиране на биомасата, промиване с буферен разтвор и ултразвукова обработка за унищожаване на клетките. Полученият лизат се центрофугира, промива се с 3М разтвор на урея в буфер, разтваря се в разтвор на гуанидин хлорид в буфер, обработва се с ултразвук, центрофугира се, окислителна сулфитолиза, диализа срещу 8 М урея, ренатурация и крайна двустепенна хроматография върху CM- 52 целулоза и сефадекс G-50 (RU 2054041). Недостатъците на този метод са неговата относително ниска производителност на основните етапи на процеса на изолиране и пречистване. Това се отнася особено за ултразвуковата обработка на продукта, диализата и окислителната сулфитолиза, което води до нестабилност в добива на интерферон, както и до невъзможността този метод да се използва за промишлено производство на интерферон.

Като най-близък аналог (прототип) може да се посочи метод за получаване на човешки левкоцитен интерферон, който се състои в култивиране на рекомбинантен щам на Е. coli, замразяване на получената биомаса при температура не по-висока от -70 ° C, размразяване, унищожаване на клетки от микроорганизми с лизозим, отстраняване на ДНК и РНК чрез въвеждане в ДНКазния лизат и пречистване на изолираната неразтворима форма на интерферон чрез промиване с буферен разтвор с детергенти, разтваряне на утайката на интерферон в разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатуриране и едноетапно пречистване чрез йони обменна хроматография. Щамът E. coli SS5, получен с помощта на рекомбинантния плазмид pSS5, съдържащ три промотора: Plac, P t7 и P trp, и алфа-интерфероновия ген с въведени нуклеотидни замествания се използва като продуцент.

Експресията на интерферон от щама E. coli SS5, съдържащ този плазмид, се контролира от три промотора: P lac, P t7 и P trp. Нивото на експресия на интерферон е около 800 mg на 1 литър клетъчна суспензия (RU 2165455).

Недостатъкът на този метод е ниската технологична ефективност на използването на ензимно разрушаване на клетки, ДНК и РНК на микроорганизма и едноетапно хроматографско пречистване на интерферон. Това причинява нестабилност в процеса на освобождаване на интерферон, води до намаляване на качеството му и ограничава възможността за използване на горната схема за промишлено производство на интерферон. Недостатъците на този плазмид и щама, базиран на него, са използването в плазмида на силен нерегулиран промотор на фага Т7 в щам Е. coli BL21 (DE3), в който генът на Т7 РНК полимераза се намира под промотора на lac оперон и който винаги е „течащ“. Следователно, синтезът на интерферон се извършва непрекъснато в клетката, което води до дисоциация на плазмида и намаляване на жизнеспособността на клетките на щама и в резултат на това до намаляване на добива на интерферон.

Целта на това изобретение е да се конструира рекомбинантен промишлен продуцентски щам на E. coli, като се използва нова рекомбинантна плазмидна ДНК с високо ниво на биосинтеза на интерферон и да се разработи ефективна промишлена технология за производство на интерфероново вещество за медицинска употреба, съответстващо на качеството към "Европейската фармакопея" за веществото интерферон алфа-2b.

Този проблем беше решен чрез създаване на рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50 и щам Escherichia coli SX50, депозирани във Всеруската колекция от индустриални щамове на Федералното държавно унитарно предприятие Държавен изследователски институт по генетика, номер VKPM B-8550,

както и метод за производство на рекомбинантен алфа-2b интерферон, базиран на използването на рекомбинантен щам на Е. coli SX50 и включващ неговото дълбоко култивиране върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати в процеса. на биосинтеза, механично разрушаване на клетките на микроорганизма при високо налягане, разтваряне на агрегиран протеин в концентриран разтвор на гуанидин хидрохлорид, последвано от ренатуриране на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти и тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху смоли като като Chelating Sepharose Fast Flow, имобилизирана с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли като CM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху смоли като Superdex 75.

Съгласно изобретението се предлага нова рекомбинантна мултикопийна плазмидна ДНК pSX50, кодираща синтеза на човешки левкоцитен алфа-2b интерферон, чиято експресия е под контрола на лактозни и триптофанови промотори и транскрипционен терминатор. Плазмидът pSX50 има 3218 базови двойки (bp) и се характеризира с наличието на следните фрагменти:

Последователността от нуклеотид 1 до нуклеотид (nt) 176 включва 176 bp ДНК фрагмент, съдържащ триптофановия промотор (P trp);

Последователност от 177 нт. до 194 n. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ последователността на Shine Delgarno, отговорна за започването на транслацията;

Последователност от 195 нт. до 695 n. включва ДНК фрагмент с размер 501 bp, съдържащ последователността на гена за интерферон със следните нуклеотидни замествания: в позиция 37, заместване на A с C, на позиция 39, заместване на G с T, на позиция 40, заместване на A с C, на позиция 42, заместване на G с T, на позиция 67, заместване на A с C, на позиция 69, заместване на G с T, на позиция 70, заместване на A с C, на позиция 72, заместване на A с T, на позиция 96, замяна на G с A, на позиция 100, замяна на A с C, в на позиция 102, замяна на A с T, на позиция 114, замяна на A с C, на позиция 120, замяна на C с G, в позиция 126, замяна на G с A, в позиция 129, замяна на G с A, в позиция 330, замяна на C с G, в позиция 339 замяна на G с A, в позиция 342 замяна на G с A, в позиция 487 заместваща A с C, в позиция 489 заместваща A с T, в позиция 495 заместваща G с A;

Последователност от 696 нт. съгласно 713 n. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ синтетичен полилинкер;

Последователност от 714 нт. до 1138 г. н. включва ДНК фрагмент от плазмид pKK223-3 с 4129 nt. до 4553 n. с размер 425 bp, съдържащ последователността на стриктния терминатор на транскрипция rrnBT 1 T 2;

Последователност от 1139 г. б. до 1229 n. включва ДНК фрагмент от плазмид pUC19 с 2487 nt. до 2577 n. с размер 91 bp, съдържащ промотора на β-лактомазния ген (ген за устойчивост на ампицилин - Amp R);

Последователност от 1230 г. б. до 2045 n. включва ДНК фрагмент на pUC4K плазмид със 720 nt. до 1535 г. сл. Хр с размер 816 bp, съдържащ структурната област на kan гена;

Последователност от 2046 г. б. до 3218 n. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 1625 до 453 nt. 1173 bp по размер, съдържащ последователността, отговорна за плазмидната репликация (ori) и lac промотора (P lac).

Фигури 1-5 показват конструктивни диаграми и физическа карта на pSX50 плазмида.

Фигура 6 показва пълната нуклеотидна последователност, определена за плазмид pSX50.

Escherichia coli щам SX50 беше получен чрез трансформиране на Escherichia coli BL21 клетки с pSX50 плазмид, използвайки традиционна технология за генно инженерство. Щамът E.Coli SX50 се характеризира със следните характеристики.

Културни и морфологични характеристики

Клетките са малки, прави, удебелени пръчковидни, грам-отрицателни, неспорови. Клетките растат добре върху прости хранителни среди. При отглеждане върху Difco агар се образуват кръгли, гладки, изпъкнали, мътни, лъскави, сиви колонии с гладки ръбове. При отглеждане в течна среда (в минимална среда с глюкоза или в LB бульон) се образува интензивно равномерно помътняване.

Физически и биологични характеристики

Аероб. Температурният диапазон за растеж е 4-42°C с оптимално рН 6,5-7,5.

Като източник на азот се използват както минерални соли в амониева и нитратна форма, така и органични съединения под формата на аминокиселини, пептон, триптон, екстракт от дрожди и др.

Като източник на въглерод се използват аминокиселини, глицерол и въглехидрати. Резистентност към антибиотици. Клетките проявяват резистентност към канамицин (до 100 μg/ml).

Щам Escherichia coli 8X50 е производител на интерферон.

Метод, условия и състав на средата за съхранение на щама

В L-арапе с добавяне на канамицин до концентрация 20 mcg/ml под масло, в L-бульон, съдържащ 15% глицерол и подходящи антибиотици в ампули при температура минус 70°C, в лиофилизирано състояние в ампули при температура плюс 4°C.

Escherichia coli щам SX50 е идентифициран съгласно Bergey's Guide (1974) като щам на вида Escherichia coli.

Метод за промишлено производство на алфа-2b интерферон

Характеристика на предложения метод е разработването на технология, която позволява изолирането на интерферон от неразтворима форма, която се натрупва по време на ферментацията, което прави възможно значително опростяване на технологичната схема на процеса на изолиране и увеличаване на добива на целевия продукт.

Методът се състои в култивиране на щам Escherichia coli SH50 в хранителна среда, с постоянно добавяне на хранителни субстрати, за предпочитане глюкоза и екстракт от дрожди, в процеса на биосинтеза, за предпочитане с намалено съдържание на триптофан, механично разрушаване на клетките на микроорганизмите при високо налягане 700-900 бара, разтваряне на интерферон в буферен разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатурация на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти, последвано от тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху хелатиращи сефарозни смоли тип Fast Flow, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли тип CM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху смоли като Superdex 75.

Оптималните условия за провеждане на отделните етапи на производство на интерферон са следните:

Ферментацията се извършва с непрекъснато добавяне на субстрати през целия процес, което предизвиква високо ниво на експресия на интерферон;

Разрушаването на клетките се извършва в дезинтегратор тип Gaulin при налягане 900 bar;

Отстраняването на разтворими клетъчни компоненти (ДНК, РНК, протеини, липополизахариди и др.) се извършва чрез измиване на неразтворимата форма на интерферон с буферни разтвори, съдържащи детергенти (тритон XI00, урея и др.);

Получената утайка, съдържаща интерферон, се разтваря в буферен разтвор на 6 М гуанидин хидрохлорид;

Интерфероновата ренатурация се извършва във физиологичен буферен разтвор, съдържащ хаотропни агенти;

Тристепенно хроматографско пречистване на интерферон се извършва върху Chelating Sepharose Fast Flow, имобилизиран с Cu +2 йони, върху катионобменна смола SM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху Superdex 75 тип смола;

След всяко хроматографско пречистване се извършва стерилизираща филтрация през апирогенни филтри с размер на порите 0,22 микрона.

Добивът на интерферон в резултат на използването на описания метод е приблизително 400-800 mg интерферон на 1 литър хранителна среда. Качеството на получения продукт отговаря на стандартите и изискванията на "Европейската фармакопея" за веществото алфа-2b интерферон.

Съществените разлики между предложения метод и прототипа са:

Използването на дизайн на щам с по-висока продуктивност, което позволява да се получи по-голямо количество интерферон от 1 литър хранителна среда по време на биосинтезата;

Използването на ефективно механично унищожаване на клетъчната биомаса, което прави възможно получаването на по-чист екстракт от неразтворимата форма на интерферон за по-кратко време, с по-малко загуби;

Използването на физиологични буферни разтвори по време на ренатурация в присъствието на хаотропни агенти прави възможно увеличаването на добива на правилно ренатурираната форма на интерферон;

Тристепенното хроматографско пречистване на интерферон дава възможност да се получи интерфероново вещество с чистота над 99% според електрофореза в редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро и повече от 98% според RF HPLC и практически без пирогени (LAL тест).

Същността и предимствата на заявената група изобретения са илюстрирани със следните примери.

Пример 1. Конструиране на рекомбинантен плазмид pSH50

Методът за конструиране на плазмид pSX50 включва следните стъпки:

Конструиране на векторен плазмид pSX10;

1. конструиране на плазмид pSX3 (2641 bp)

2. конструиране на векторен плазмид pSX10 (2553 bp)

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX41 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX43 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX45 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX50 (3218 bp).

Конструиране на векторен плазмид pSX10

Векторният плазмид pSX10 е вектор pUC19, в който кодиращата последователност на гена на бета лактомазата, която осигурява резистентност към ампицилин, е заменена от кодиращата последователност на kan гена и съдържа терминатора на транскрипция от плазмида pKK223-3.

Конструирането на векторния плазмид pSS10 се извършва на два етапа:

Получаване на плазмид pSX3 (2641 bp), който е плазмид pUC19, в който кодиращият регион на amp гена е заменен с кодиращия регион на kan гена;

Получаване на векторния плазмид pSX10 (2553 bp), който е плазмид pSX3, в който ДНК фрагмент, кодиращ терминатора на транскрипция rBT1T2, е вмъкнат зад BamHI мястото.

За да се получи плазмид pSX3, се извършват пет цикъла на ДНК амплификация с помощта на PCR (полимеразна верижна реакция). По време на първия кръг, като се използва pUC19 плазмидна ДНК като матрица, се амплифицира ДНК фрагмент с размер 1828 bp. (фрагмент PU1-PU2) с помощта на праймери:

Тази и следващите PCR реакции се провеждат при следните условия: 20 mM Tis-HCl, рН 8,8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 mM от всеки dNTP, 1,25 единици. Pfu ДНК полимераза, 100 ng ДНК. Процесът на амплификация се състои от следните етапи: нагряване при 95°C за 5 min, 35 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 2 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. След амплификация (и след последващи амплификации), ДНК фрагментът се пречиства чрез електрофореза в 1% агарозен гел. По време на втория и третия кръг, като се използва pUC4K плазмидна ДНК като матрица, се амплифицира 555 bp ДНК фрагмент. (фрагмент KM1-KM2), използвайки праймери:

и амплификация на ДНК фрагмент от 258 bp. (KMZ-KM4) от грундове

В петия цикъл на PCR, фрагменти (PU1-PU2) и (KM1-KM4) се комбинират при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 5 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. ДНК, получена след последния PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°С, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира и се извършва рестрикционен анализ. В резултат на това се получава плазмид pSX3 с размер 2641 bp.

За да се получи векторният плазмид pSX10, се извършват три кръга на ДНК амплификация с помощта на PCR. В първия кръг, като се използва pSX3 плазмидна ДНК като шаблон, се амплифицира 2025 bp ДНК фрагмент. (фрагмент 10.1-10.2) с помощта на праймери:

По време на втория кръг, като се използва ДНК на плазмид pKK223-3 като шаблон, се амплифицира ДНК фрагмент с размер 528 bp. (фрагмент KK1-KK2) с помощта на праймери:

В третия кръг на PCR, фрагменти (10.1-10.2) и (KK1-KK2) се комбинират при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 5 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. ДНК, получена след последния PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°С, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира и се извършва рестрикционен анализ. В резултат на това се получава плазмид pSX10 с размер 2553 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX41

Рекомбинантният плазмид pSX41 е Hind III - BamHI ДНК фрагмент на векторен плазмид pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI ДНК фрагмент от 168 bp, кодиращ промотора на триптофановия оперон на Е. coli (P trp), EcoRI-XbaI синтетичен ДНК фрагмент от 20 bp, кодиращ SD последователността (Shine-Delgarno) и XbaI-BamHI ДНК фрагмент от 501 bp, кодиращ човешкия интерферон алфа 2b ген.

За да се получи Hind III - BamHI ДНК фрагмент на векторен плазмид pSX3 (2529 bp), ДНК на плазмид pSX3 се третира с рестрикционни ензими HindIII и BamHI, последвано от електрофоретично пречистване в 1% агарозен гел. Hind III EcoRI ДНК фрагмент от 168 bp, кодиращ промотора на триптофановия оперон (P trp), се получава чрез PCR, като се използва обща ДНК на E. coli като матрица и праймери TRP1 и PRP2, последвано от третиране на амплифицирания фрагмент с Hindll и EcoRI рестрикция ензими:

За да се получи EcoRI-Xbal синтетичен ДНК фрагмент от 20 bp, кодиращ SD последователността (Shine-Delgarno), се синтезират следните комплементарни олигонуклеотиди:

XbaI-BamIII ДНК фрагмент с размер 501 bp, кодиращ гена на човешки алфа 2b интерферон, се получава чрез PCR, използвайки тотална човешка ДНК като матрица и праймери IFN1 и IFN2, последвано от обработка на амплифицирания фрагмент с Xbal и BamIII рестрикционни ензими:

След това електрофоретично пречистените фрагменти се комбинират, лигират се с ензима Т4 фагова лигаза, ДНК се трансформира в клетки от щам E. coli DH5 и се поставят върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX41 с размер 3218 bp. След това се извършва мутагенеза стъпка по стъпка на гена на интерферона, за да се повиши нивото на експресия на целевия продукт. Мутагенезата на интерфероновия ген се състои в замяна на триплети, които рядко се срещат в Е. coli, кодиращи съответните аминокиселини, с триплети, които често се срещат в Е. coli, кодиращи същите аминокиселини. ДНК мутагенезата на интерфероновия ген се извършва с помощта на PCR метода.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX43

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX43, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX41 като шаблон и праймери IFN3 и IFN4:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX43 с размер 3218 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX45

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX45, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX43 като шаблон и праймери IFN5 и IFN6:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX45 с размер 3218 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX50.

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX50, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX45 като шаблон и праймери IFN7 и IFN8:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX50 с размер 3218 bp.

Пример 2. Получаване на щам Е. coli SX50 - продуцент на интерферон

Интерферон-продуциращият щам E. coli SX50 се получава чрез трансформиране на клетки от щам E. coli BL21 с рекомбинантния плазмид pSX50. Произвеждащият интерферон щам се отглежда в 30 литров ферментатор до оптична плътност от 25.0-30.0 p.u. в среда М9, съдържаща 1% казеинов кисел хидролизат (Difco), 1% глюкоза, 40 µg/ml канамицин, при температура 38-39°С. По време на процеса на ферментация се извършва непрекъснато добавяне на хранителен субстрат с помощта на гравиметричен контролер.

Пример 3. Метод за изолиране на интерферон от Е. coli щам SX50

Интерферонът се получава на 4 етапа:

Етап 1. Култивиране на Е. coli щам SX50.

Етап 2. Изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон.

Етап 3. Разтваряне и ренатурация на интерферон.

Етап 4. Хроматографско пречистване на интерферон.

Етап 1. Култивиране на Е. coli щам SX50

Отгледан инокулум на Е. coli щам SX50 в обем от 3 литра богата LB среда за 12 часа при 26°C се въвежда асептично във ферментатор, съдържащ 27 литра стерилна среда, съдържаща М9, 1% казеинов кисел хидролизат, 1% глюкоза, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 mg/ml канамицин. Култивирането във ферментатор се извършва при температура 38-39°C, като се поддържа pH 7±0,15 чрез автоматично титруване с 40% разтвор на натриев хидроксид. Концентрацията на разтворен кислород в диапазона (50±10)% от насищането се поддържа чрез промяна на скоростта на бъркалката от 100 до 800 rpm и подаване на въздух от 1 до 15 l/min. Концентрацията на субстратите, по-специално на глюкозата и екстракта от дрожди, се измерва по време на ферментацията и тяхната концентрация се поддържа чрез промяна на скоростта на подаване на концентрирани разтвори чрез перисталтични помпи с помощта на гравиметричен контролер.

Натрупването на интерферон в неразтворима форма се наблюдава с помощта на фазово контрастна микроскопия, електрофореза с 15% полиакриламиден гел (SDS-PAAG) и високоефективна хроматография с обърната фаза (RF HPLC). Ферментацията се спира, когато се достигне максималната оптична плътност (~ 25-30 p.u.) и синтезът на интерферон спира. В края на ферментацията културалната течност се отделя чрез центрофугиране в проточен ротор при скорост на въртене 5000-10000 rpm. Биомасата се опакова в найлонови торби и се замразява при минус 70°C.

Етап 2. Изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон

300-400 g замразена биомаса от Е. coli щам SX50 се суспендира в 3000 ml буфер 1 (20 mM Tris-HCl, рН 8.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100). Суспензията преминава през поточен хомогенизатор тип Gaulin, поддържа се при налягане от 900 bar и се центрофугира в поточен ротор при 15 000 rpm. Получената утайка се промива при подобни условия последователно с буфери 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M урея) и буфер 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) и накрая интерферон утайка се суспендира в 200 ml буфер 3. В този случай времето за изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон е не повече от 5 часа.

Етап 3. Разтваряне и ренатурация на интерферон

Към суспензията на неразтворимата форма на интерферон, получена в предишния етап, добавете сух гуанидин хидрохлорид до концентрация 6 М, добавете дитиотреитол до концентрация 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 до концентрация 50 mM, NaCl до концентрация от 150 mM и Triton X100 до концентрация от 0.1%, инкубирайте при стайна температура в продължение на 2 часа.Неразтвореният материал се отделя чрез стерилизиращо филтруване през мембрани с диаметър на порите от 0.22 микрона.

Ренатурирането на интерферон се извършва чрез бавно разреждане на получения разтвор 100-200 пъти с буфер 4 (20 mM Tris-HCl рН 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA). След което сместа за ренатуриране се инкубира при непрекъснато разбъркване в продължение на 12-15 часа при температура 4-8°С. След това се добавя магнезиев сулфат до концентрация от 1 тМ и агрегираният материал се отстранява чрез стерилизиращо филтруване през мембранен филтър с диаметър на порите 0,22 микрона.

Етап 4. Хроматографско пречистване на интерферон

Хроматографското пречистване на интерферон се извършва на три етапа.

1. Полученият ренатуриран интерферон първо се пречиства с помощта на афинитетна хроматография върху смола с хелатиращ сефароза Fast Flow (Amersham Biosciences), имобилизирана с Cu +2 йони. За да направите това, разтворът на интерферон се нанася в колона с Cu +2 хелатираща сефароза Fast Flow и интерферонът се елуира с 0,1 М буфер с лимонена киселина, рН 2,2.

2. Във втория етап на хроматографско пречистване разтворът на интерферон се прилага към CM Sepharose Fast Flow тип катионобменна смола (Amersham Biosciences) и интерферонът се елуира с градиент от разтвори (0,0-0,5 М NaCl) в 50 mM Na(CH3COO) буфер, рН 5.5.

3. Пречистването на мономерната форма на интерферон от остатъците от полимерни форми на интерферон се извършва на третия етап на пречистване на интерферон чрез гел филтриране върху смола Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографията се провежда в буфер от 50 тМ Na(CH3COO), рН 5.0, съдържащ 0.15 М NaCl.

Описаният метод за изолиране и пречистване на интерферон дава възможност да се получат 4-8 g високо пречистен интерферон в един цикъл на изолиране за 7-10 дни от биомаса, получена от 10 литра хранителна среда. Качеството на получения интерферон напълно отговаря на изискванията на “Европейската фармакопея” за веществото интерферон алфа-2b, а именно:

Концентрацията на интерферон е не по-малка от 2×10 8 IU/ml;

Специфичната активност на интерферона е не по-малка от 2,0 × 10 8 IU / mg;

Електрофоретичната чистота на лекарството е най-малко 99% при редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро;

Изоелектричната точка на изолирания интерферон е в областта на рН 5,8-6,3;

Пептидната карта на изолирания интерферон не се различава фундаментално от пептидната карта за европейския стандартен интерферон алфа 2b CRS;

Както следва от дадените примери, претендираната група от изобретения дава възможност за получаване на интерферон алфа-2b с висок добив, като се използва сравнително проста и надеждна технология.

ИСК

1. Рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50, кодираща синтеза на рекомбинантен човешки алфа-2b интерферон, характеризираща се с това, че има размер от 3218 базови двойки (bp) и се състои от следните фрагменти: последователността от 1 до 176 нуклеотида (bp) включва фрагмент ДНК от 176 bp, съдържащ триптофанов промотор (P trp), последователност от 177 до 194 nt. включва синтетичен ДНК фрагмент с размер 18 bp, съдържащ последователността на Shine Delgarno, отговорна за инициирането на транслацията, последователност от 195 до 695 nt. включва ДНК фрагмент от 501 bp, съдържащ гена на интерферон алфа-2b с нуклеотидни замествания: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С) ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), последователност от 696 до 713 nt. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ синтетичен полилинкер, последователност от 714 до 1138 nt. включва ДНК фрагмент на плазмид pKK223-3 от 4129 до 4553 nt. 425 bp по размер, съдържащ последователността на стриктния терминатор на транскрипция rrnBT 1 T 2, последователност от 1139 до 1229 nt. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 2487 до 2577 nt. 91 bp по размер, съдържащ промотора на -лактомазния ген (ген за устойчивост на ампицилин -Amp R), последователност от 1230 до 2045 nt. включва ДНК фрагмент на pUC4K плазмид със 720 nt. до 1535 г. сл. Хр 816 bp в размер, съдържащ структурната област на kan гена, последователност с 2046 bp. до 3218 n. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 1625 до 453 nt. 1173 bp по размер, съдържащ последователността, отговорна за плазмидната репликация (ori) и lac промотора (P lac).

2. Бактериалният щам Eschcerichia coli SX50, трансформиран с рекомбинантния плазмид съгласно претенция 1, е производител на рекомбинантен човешки левкоцитен интерферон алфа-2b.

3. Метод за производство на човешки интерферон алфа-2b, включващ култивиране на щам Escherichia coli SX5 съгласно претенция 2 в хранителна среда с постоянно добавяне на хранителни субстрати по време на процеса на биосинтеза, механично унищожаване на клетки от микроорганизми при налягане от 700°С. 900 bar, разтваряне на интерферон в буферен разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатурация на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти, тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху Chelating Sepharose Fast Flow смоли, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообмен хроматография върху CM Sepharose Fast Flow тип йонообменни смоли и гел филтрационна хроматография върху Superdex 75 тип смоли.

4. Методът съгласно претенция 3, при който култивирането се извършва върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати, за предпочитане глюкоза и екстракт от дрожди.

5. Метод съгласно претенция 3, при който преди разтваряне на интерферона, той се пречиства чрез отстраняване на разтворими клетъчни компоненти, включително ДНК, РНК, протеини, липополизахариди, промиване с буферни разтвори, съдържащи детергенти като Triton XI 00, урея.

6. Метод съгласно претенция 3, при който след всяко хроматографско пречистване се извършва стерилизиращо филтруване през филтри с размер на порите 0,22 микрона.