• Клинична фармакология

  Фармакологично действие - антивирусно, противотуморно и имуномодулиращо.

  Това е високо пречистен рекомбинантен протеин с молекулно тегло 19 300 далтона. Получен от клонинг на Е. coli чрез хибридизиране на бактериален плазмид с човешкия левкоцитен ген, кодиращ синтеза на интерферон. За разлика от интерферона, алфа-2а има аргинин на позиция 23. Той има антивирусен ефект, който се дължи на взаимодействие със специфични мембранни рецептори и индукция на РНК и в крайна сметка синтеза на протеини. Последните от своя страна предотвратяват нормалното възпроизвеждане на вируса или неговото освобождаване. Има имуномодулираща активност, която е свързана с активиране на фагоцитозата, стимулиране на образуването на антитела и лимфокини. Има антипролиферативен ефект върху туморните клетки.

  • Фармакокинетика

    При интрамускулно приложение 70% навлизат в системното кръвообращение. Биотрансформира се главно в бъбреците и в малка степен в черния дроб. Интерферон алфа-2b се екскретира от тялото чрез бъбреците.

• Показания за употреба
  • Хроничен хепатит В.
  • Хроничен хепатит С.
  • Mycosis fungoides.
  • Първичен Т-клетъчен лимфосарком.
  • Косматоклетъчна левкемия.
  • Множествен миелом (генерализирани форми).
  • Хронична миелоидна левкемия.
  • Злокачествен меланом.
  • Рак на пикочния мехур (повърхностен).
  • Базалноклетъчен карцином.
  • Заострена кондиломатоза.
  • Сарком на Капоши (включително със СПИН).
  • Неходжкинов лимфом (като част от комбинирана терапия).

• Начин на употреба и дози

  Индивидуално, в зависимост от показанията и схемата на лечение.

  • За косматоклетъчна левкемия

    Възрастни се прилагат интрамускулно или подкожно по 2 милиона IU/m2 3 пъти седмично.

  • За саркома на Капоши

    30 милиона IU/m 2 3 пъти седмично.

• Противопоказания
  • Тежки сърдечно-съдови заболявания.
  • Тежка чернодробна и/или бъбречна дисфункция.
  • Епилепсия и/или сериозни функционални нарушения на централната нервна система.
  • Хроничен хепатит със заплаха от развитие на чернодробна цироза.
  • Чернодробни заболявания във фазата на декомпенсация.
  • Хроничен хепатит по време на или след предходна терапия с имуносупресори (с изключение на състоянието след прекъсване на краткосрочна терапия с кортикостероиди).
  • Автоимунен хепатит.
  • История на автоимунни заболявания.
  • Реципиентите на трансплантант са имуносупресирани.
  • Съществуващи заболявания на щитовидната жлеза.
  • Свръхчувствителност към интерферон алфа-2b.

• Употреба по време на бременност и кърмене

  Употребата по време на бременност е възможна в случаите, когато очакваната полза за майката надвишава потенциалния риск за плода. Жените с детероден потенциал трябва да използват надеждни методи за контрацепция, докато използват интерферон алфа-2b.

  Ако е необходимо да се използва по време на кърмене, трябва да се реши въпросът за спиране на кърменето.

• Взаимодействие

  Интерфероните могат да засилят невротоксичните, миелотоксичните или кардиотоксичните ефекти на лекарствата, предписани преди това или едновременно с тях.

• Специални условия

  Не трябва да се използва при пациенти с анамнеза за психични разстройства. Да се ​​използва с повишено внимание при пациенти с анамнеза за белодробни заболявания (включително хронична обструктивна белодробна болест), захарен диабет с тенденция към кетоацидоза, повишено съсирване на кръвта (включително анамнеза за тромбофлебит и белодробна емболия), състояния на тежка миелодепресия.

  Преди започване и систематично по време на лечението трябва да се проследяват чернодробната функция, периферната кръв, биохимичните кръвни показатели и креатинина. По време на лечението трябва да се осигури адекватна хидратация на организма. При пациенти с хроничен хепатит С трябва да се проследяват нивата на тироид-стимулиращия хормон по време на лечението.

  При хроничен хепатит В, придружен от намаляване на синтетичната функция на черния дроб (което се проявява в намаляване на нивата на албумин или увеличаване на протромбиновото време), трябва да се оценят очакваните ползи и възможните рискове от терапията. Употребата при съпътстващ псориазис е оправдана в случаите, когато очакваната полза от терапията надвишава потенциалния риск. При съпътстващ захарен диабет или артериална хипертония е необходимо изследване на очното дъно преди и по време на лечението. Ако има анамнеза за хронична сърдечна недостатъчност, инфаркт на миокарда и/или предишни или съществуващи аритмии, лечението с интерферон алфа-2b трябва да се провежда под стриктно наблюдение на лекар.

  • Влияние върху способността за шофиране и работа с машини

    Ефект върху способността за шофиране и работа с машини В началото на терапията трябва да се въздържате от потенциално опасни дейности, които изискват повишено внимание, бързи психомоторни реакции, докато ефектът на интерферон алфа-2b се стабилизира.

  Интерферон алфа-2b под формата на прах за инжекции и инжекционен разтвор е включен в Списъка на жизненоважни и основни лекарства.

Странични ефекти на интерферон бета.

Изобретението се отнася до генното инженерство, биотехнологиите, медицината, фармакологията. Нов рекомбинантен мултикопиен плазмиден ДНК pSX50, кодиращ синтеза на човешки левкоцитен алфа-2b интерферон, чиято експресия е под контрола на лактозни и триптофанови промотори и терминатор на транскрипция. В резултат на трансформация на клетки от реципиентния щам E. coli BL21 с рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50 се получава щам E. coli SX50 - продуцент на рекомбинантен левкоцитен човешки алфа-2b интерферон с продуктивност до 0,9-1,0 g от алфа-2b интерферон от 1 литър хранителна среда. Методът за получаване на рекомбинантен алфа-2b интерферон се основава на използването на създаден рекомбинантен щам на Е. coli SX50 и включва неговото дълбоко култивиране върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати в процеса на биосинтеза , механично разрушаване на клетките на микроорганизма при високо налягане, разтваряне на агрегирания протеин в концентриран разтвор на гуанидин хидрохлорид, последвано от ренатуриране на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти и неговото пречистване с помощта на тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху Хелатиращи Sepharose Fast Flow смоли, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли като Sephsrose Fast Flow SM и гел филтрационна хроматография върху смоли тип Superdex 75. Методът дава възможност да се получи интерфероново вещество с повече от 99% чистота според електрофореза в редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро и повече от 98% според RF HPLC и без пирогени (LAL тест) в количества най-малко 400-800 mg на 1 литър хранителна среда. 3 п. и 3 длъжности заплата, 6 ил.

Чертежи за RF патент 2242516

Изобретението се отнася до генетично модифицирани лекарствени продукти, получени по биотехнологичен път, а именно до методи за промишлено производство на рекомбинантен човешки левкоцитен интерферон алфа-2b за медицински цели (наричан по-нататък интерферон), както и до рекомбинантни продуциращи щамове на Escherichia coli (E. coli) и плазмидна ДНК, кодираща синтеза на интерферон.

Интерфероните са протеинови молекули с молекулно тегло от 15 000 до 21 000 далтона, произведени и секретирани от клетките в отговор на вирусна инфекция или други патогени. Има три основни групи интерферони: алфа, бета и гама. Самите тези групи не са хомогенни и могат да съдържат няколко различни молекулни вида интерферон. По този начин са идентифицирани повече от 14 генетични разновидности на интерферон алфа, които представляват интерес и се използват широко в медицината като антивирусни, антипролиферативни и имуномодулиращи средства.

Известни са методи за получаване на човешки левкоцитен интерферон от левкоцити на човешка донорска кръв, индуцирани от вируси и други индуктори (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Основният недостатък на тези методи за производство на интерферони е вероятността от заразяване на крайния продукт с човешки вируси, като вирус на хепатит B и C, вирус на имунна недостатъчност и др.

Понастоящем методът за производство на интерферон чрез микробиологичен синтез е признат за по-обещаващ, което прави възможно получаването на целевия продукт със значително по-висок добив от сравнително евтини изходни материали. Подходите, използвани тук, позволяват да се създадат варианти на структурен ген, които са оптимални за бактериална експресия, както и регулаторни елементи, които контролират неговата експресия.

Като изходни микроорганизми се използват различни щамове на Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатъкът на използването на P. pastoris като производител на интерферон (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //Високо ниво на експресия на човешки IFN-2b в Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), Условията на ферментация на този вид дрожди са изключително трудни, необходимостта от стриктно поддържане на концентрацията на индуктора, по-специално на метанола, по време на процеса на биосинтеза. Недостатъкът на използването на Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) е сложността на процеса на ферментация при ниско ниво на експресия (10 mg интерферон на 1 литър културална среда). По-продуктивно е използването на щамове Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Известни са голям брой плазмиди и създадени на тяхна база щамове E. coli, които експресират интерферон: щамове E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмиди Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli щам pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli щам pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli щам SG 20050 с плазмид p280/21FN (Kravchenko V.V. и др., Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, no. 9, pp. и др. Недостатъкът на технологиите, базирани на използването на тези щамове, е тяхната нестабилност, както и недостатъчното ниво на експресия на интерферон.

Наред с характеристиките на използваните щамове, ефективността на процеса до голяма степен зависи от използваната технология за изолиране и пречистване на интерферона.

Съществува известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на Ps клетки. putida, разрушаване на биомаса, третиране с полиетиленимин, фракциониране с амониев сулфат, хидрофобна хроматография върху фенилсилохром С-80, рН фракциониране на лизата, неговото концентриране и диафилтрация, йонообменна хроматография върху целулоза DE-52, елуиране в рН градиент, йон обменна хроматография на получения елуент върху целулоза SM -52, концентриране чрез преминаване през филтърна касета и гел филтруване върху Sephadex G-100 (SU 1640996). Недостатък на този метод, освен сложната многоетапна ферментация, е и многоетапността на процеса при получаване на крайния продукт.

Съществува и известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на щам E. coli SG 20050/pIF16 в LB бульон в колби в термостатиран шейкър, центрофугиране на биомасата, промиване с буферен разтвор и ултразвукова обработка за унищожаване на клетките. Полученият лизат се центрофугира, промива се с 3М разтвор на урея в буфер, разтваря се в разтвор на гуанидин хлорид в буфер, обработва се с ултразвук, центрофугира се, окислителна сулфитолиза, диализа срещу 8 М урея, ренатурация и крайна двустепенна хроматография върху CM- 52 целулоза и сефадекс G-50 (RU 2054041). Недостатъците на този метод са неговата относително ниска производителност на основните етапи на процеса на изолиране и пречистване. Това се отнася особено за ултразвуковата обработка на продукта, диализата и окислителната сулфитолиза, което води до нестабилност в добива на интерферон, както и до невъзможността този метод да се използва за промишлено производство на интерферон.

Като най-близък аналог (прототип) може да се посочи метод за получаване на човешки левкоцитен интерферон, който се състои в култивиране на рекомбинантен щам на Е. coli, замразяване на получената биомаса при температура не по-висока от -70 ° C, размразяване, унищожаване на клетки от микроорганизми с лизозим, отстраняване на ДНК и РНК чрез въвеждане в ДНКазния лизат и пречистване на изолираната неразтворима форма на интерферон чрез промиване с буферен разтвор с детергенти, разтваряне на утайката на интерферон в разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатуриране и едноетапно пречистване чрез йони обменна хроматография. Щамът E. coli SS5, получен с помощта на рекомбинантния плазмид pSS5, съдържащ три промотора: Plac, P t7 и P trp, и алфа-интерфероновия ген с въведени нуклеотидни замествания се използва като продуцент.

Експресията на интерферон от щама E. coli SS5, съдържащ този плазмид, се контролира от три промотора: P lac, P t7 и P trp. Нивото на експресия на интерферон е около 800 mg на 1 литър клетъчна суспензия (RU 2165455).

Недостатъкът на този метод е ниската технологична ефективност на използването на ензимно разрушаване на клетки, ДНК и РНК на микроорганизма и едноетапно хроматографско пречистване на интерферон. Това причинява нестабилност в процеса на освобождаване на интерферон, води до намаляване на качеството му и ограничава възможността за използване на горната схема за промишлено производство на интерферон. Недостатъците на този плазмид и щама, базиран на него, са използването в плазмида на силен нерегулиран промотор на фага Т7 в щам Е. coli BL21 (DE3), в който генът на Т7 РНК полимераза се намира под промотора на lac оперон и който винаги е „течащ“. Следователно, синтезът на интерферон се извършва непрекъснато в клетката, което води до дисоциация на плазмида и намаляване на жизнеспособността на клетките на щама и в резултат на това до намаляване на добива на интерферон.

Целта на това изобретение е да се конструира рекомбинантен промишлен продуцентски щам на E. coli, като се използва нова рекомбинантна плазмидна ДНК с високо ниво на биосинтеза на интерферон и да се разработи ефективна промишлена технология за производство на интерфероново вещество за медицинска употреба, съответстващо на качеството към "Европейската фармакопея" за веществото интерферон алфа-2b.

Този проблем беше решен чрез създаване на рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50 и щам Escherichia coli SX50, депозирани във Всеруската колекция от индустриални щамове на Федералното държавно унитарно предприятие Държавен изследователски институт по генетика, номер VKPM B-8550,

както и метод за производство на рекомбинантен алфа-2b интерферон, базиран на използването на рекомбинантен щам на Е. coli SX50 и включващ неговото дълбоко култивиране върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати в процеса. на биосинтеза, механично разрушаване на клетките на микроорганизма при високо налягане, разтваряне на агрегиран протеин в концентриран разтвор на гуанидин хидрохлорид, последвано от ренатуриране на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти и тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху смоли като като Chelating Sepharose Fast Flow, имобилизирана с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли като CM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху смоли като Superdex 75.

Съгласно изобретението се предлага нова рекомбинантна мултикопийна плазмидна ДНК pSX50, кодираща синтеза на човешки левкоцитен алфа-2b интерферон, чиято експресия е под контрола на лактозни и триптофанови промотори и транскрипционен терминатор. Плазмидът pSX50 има 3218 базови двойки (bp) и се характеризира с наличието на следните фрагменти:

Последователността от нуклеотид 1 до нуклеотид (nt) 176 включва 176 bp ДНК фрагмент, съдържащ триптофановия промотор (P trp);

Последователност от 177 нт. до 194 n. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ последователността на Shine Delgarno, отговорна за започването на транслацията;

Последователност от 195 нт. до 695 n. включва ДНК фрагмент с размер 501 bp, съдържащ последователността на гена за интерферон със следните нуклеотидни замествания: в позиция 37, заместване на A с C, на позиция 39, заместване на G с T, на позиция 40, заместване на A с C, на позиция 42, заместване на G с T, на позиция 67, заместване на A с C, на позиция 69, заместване на G с T, на позиция 70, заместване на A с C, на позиция 72, заместване на A с T, на позиция 96, замяна на G с A, на позиция 100, замяна на A с C, в на позиция 102, замяна на A с T, на позиция 114, замяна на A с C, на позиция 120, замяна на C с G, в позиция 126, замяна на G с A, в позиция 129, замяна на G с A, в позиция 330, замяна на C с G, в позиция 339 замяна на G с A, в позиция 342 замяна на G с A, в позиция 487 заместваща A с C, в позиция 489 заместваща A с T, в позиция 495 заместваща G с A;

Последователност от 696 нт. съгласно 713 n. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ синтетичен полилинкер;

Последователност от 714 нт. до 1138 г. н. включва ДНК фрагмент от плазмид pKK223-3 с 4129 nt. до 4553 n. с размер 425 bp, съдържащ последователността на стриктния терминатор на транскрипция rrnBT 1 T 2;

Последователност от 1139 г. б. до 1229 n. включва ДНК фрагмент от плазмид pUC19 с 2487 nt. до 2577 n. с размер 91 bp, съдържащ промотора на β-лактомазния ген (ген за устойчивост на ампицилин - Amp R);

Последователност от 1230 г. б. до 2045 n. включва ДНК фрагмент на pUC4K плазмид със 720 nt. до 1535 г. сл. Хр с размер 816 bp, съдържащ структурната област на kan гена;

Последователност от 2046 г. б. до 3218 n. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 1625 до 453 nt. 1173 bp по размер, съдържащ последователността, отговорна за плазмидната репликация (ori) и lac промотора (P lac).

Фигури 1-5 показват конструктивни диаграми и физическа карта на pSX50 плазмида.

Фигура 6 показва пълната нуклеотидна последователност, определена за плазмид pSX50.

Escherichia coli щам SX50 беше получен чрез трансформиране на Escherichia coli BL21 клетки с pSX50 плазмид, използвайки традиционна технология за генно инженерство. Щамът E.Coli SX50 се характеризира със следните характеристики.

Културни и морфологични характеристики

Клетките са малки, прави, удебелени пръчковидни, грам-отрицателни, неспорови. Клетките растат добре върху прости хранителни среди. При отглеждане върху Difco агар се образуват кръгли, гладки, изпъкнали, мътни, лъскави, сиви колонии с гладки ръбове. При отглеждане в течна среда (в минимална среда с глюкоза или в LB бульон) се образува интензивно равномерно помътняване.

Физически и биологични характеристики

Аероб. Температурният диапазон за растеж е 4-42°C с оптимално рН 6,5-7,5.

Като източник на азот се използват както минерални соли в амониева и нитратна форма, така и органични съединения под формата на аминокиселини, пептон, триптон, екстракт от дрожди и др.

Като източник на въглерод се използват аминокиселини, глицерол и въглехидрати. Резистентност към антибиотици. Клетките проявяват резистентност към канамицин (до 100 μg/ml).

Щам Escherichia coli 8X50 е производител на интерферон.

Метод, условия и състав на средата за съхранение на щама

В L-арапе с добавяне на канамицин до концентрация 20 mcg/ml под масло, в L-бульон, съдържащ 15% глицерол и подходящи антибиотици в ампули при температура минус 70°C, в лиофилизирано състояние в ампули при температура плюс 4°C.

Escherichia coli щам SX50 е идентифициран съгласно Bergey's Guide (1974) като щам на вида Escherichia coli.

Метод за промишлено производство на алфа-2b интерферон

Характеристика на предложения метод е разработването на технология, която позволява изолирането на интерферон от неразтворима форма, която се натрупва по време на ферментацията, което прави възможно значително опростяване на технологичната схема на процеса на изолиране и увеличаване на добива на целевия продукт.

Методът се състои в култивиране на щам Escherichia coli SH50 в хранителна среда, с постоянно добавяне на хранителни субстрати, за предпочитане глюкоза и екстракт от дрожди, в процеса на биосинтеза, за предпочитане с намалено съдържание на триптофан, механично разрушаване на клетките на микроорганизмите при високо налягане 700-900 бара, разтваряне на интерферон в буферен разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатурация на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти, последвано от тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху хелатиращи сефарозни смоли тип Fast Flow, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообменна хроматография върху йонообменни смоли тип CM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху смоли като Superdex 75.

Оптималните условия за провеждане на отделните етапи на производство на интерферон са следните:

Ферментацията се извършва с непрекъснато добавяне на субстрати през целия процес, което предизвиква високо ниво на експресия на интерферон;

Разрушаването на клетките се извършва в дезинтегратор тип Gaulin при налягане 900 bar;

Отстраняването на разтворими клетъчни компоненти (ДНК, РНК, протеини, липополизахариди и др.) се извършва чрез измиване на неразтворимата форма на интерферон с буферни разтвори, съдържащи детергенти (тритон XI00, урея и др.);

Получената утайка, съдържаща интерферон, се разтваря в буферен разтвор на 6 М гуанидин хидрохлорид;

Интерфероновата ренатурация се извършва във физиологичен буферен разтвор, съдържащ хаотропни агенти;

Тристепенно хроматографско пречистване на интерферон се извършва върху Chelating Sepharose Fast Flow, имобилизиран с Cu +2 йони, върху катионобменна смола SM Sepharose Fast Flow и гел филтрационна хроматография върху Superdex 75 тип смола;

След всяко хроматографско пречистване се извършва стерилизираща филтрация през апирогенни филтри с размер на порите 0,22 микрона.

Добивът на интерферон в резултат на използването на описания метод е приблизително 400-800 mg интерферон на 1 литър хранителна среда. Качеството на получения продукт отговаря на стандартите и изискванията на "Европейската фармакопея" за веществото алфа-2b интерферон.

Съществените разлики между предложения метод и прототипа са:

Използването на дизайн на щам с по-висока продуктивност, което позволява да се получи по-голямо количество интерферон от 1 литър хранителна среда по време на биосинтезата;

Използването на ефективно механично унищожаване на клетъчната биомаса, което прави възможно получаването на по-чист екстракт от неразтворимата форма на интерферон за по-кратко време, с по-малко загуби;

Използването на физиологични буферни разтвори по време на ренатурация в присъствието на хаотропни агенти прави възможно увеличаването на добива на правилно ренатурираната форма на интерферон;

Тристепенното хроматографско пречистване на интерферон дава възможност да се получи интерфероново вещество с чистота над 99% според електрофореза в редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро и повече от 98% според RF HPLC и практически без пирогени (LAL тест).

Същността и предимствата на заявената група изобретения са илюстрирани със следните примери.

Пример 1. Конструиране на рекомбинантен плазмид pSH50

Методът за конструиране на плазмид pSX50 включва следните стъпки:

Конструиране на векторен плазмид pSX10;

1. конструиране на плазмид pSX3 (2641 bp)

2. конструиране на векторен плазмид pSX10 (2553 bp)

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX41 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX43 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX45 (3218 bp);

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX50 (3218 bp).

Конструиране на векторен плазмид pSX10

Векторният плазмид pSX10 е вектор pUC19, в който кодиращата последователност на гена на бета лактомазата, която осигурява резистентност към ампицилин, е заменена от кодиращата последователност на kan гена и съдържа терминатора на транскрипция от плазмида pKK223-3.

Конструирането на векторния плазмид pSS10 се извършва на два етапа:

Получаване на плазмид pSX3 (2641 bp), който е плазмид pUC19, в който кодиращият регион на amp гена е заменен с кодиращия регион на kan гена;

Получаване на векторния плазмид pSX10 (2553 bp), който е плазмид pSX3, в който ДНК фрагмент, кодиращ терминатора на транскрипция rBT1T2, е вмъкнат зад BamHI мястото.

За да се получи плазмид pSX3, се извършват пет цикъла на ДНК амплификация с помощта на PCR (полимеразна верижна реакция). По време на първия кръг, като се използва pUC19 плазмидна ДНК като матрица, се амплифицира ДНК фрагмент с размер 1828 bp. (фрагмент PU1-PU2) с помощта на праймери:

Тази и следващите PCR реакции се провеждат при следните условия: 20 mM Tis-HCl, рН 8,8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 mM от всеки dNTP, 1,25 единици. Pfu ДНК полимераза, 100 ng ДНК. Процесът на амплификация се състои от следните етапи: нагряване при 95°C за 5 min, 35 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 2 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. След амплификация (и след последващи амплификации), ДНК фрагментът се пречиства чрез електрофореза в 1% агарозен гел. По време на втория и третия кръг, като се използва pUC4K плазмидна ДНК като матрица, се амплифицира 555 bp ДНК фрагмент. (фрагмент KM1-KM2), използвайки праймери:

и амплификация на ДНК фрагмент от 258 bp. (KMZ-KM4) от грундове

В петия цикъл на PCR, фрагменти (PU1-PU2) и (KM1-KM4) се комбинират при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 5 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. ДНК, получена след последния PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°С, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира и се извършва рестрикционен анализ. В резултат на това се получава плазмид pSX3 с размер 2641 bp.

За да се получи векторният плазмид pSX10, се извършват три кръга на ДНК амплификация с помощта на PCR. В първия кръг, като се използва pSX3 плазмидна ДНК като шаблон, се амплифицира 2025 bp ДНК фрагмент. (фрагмент 10.1-10.2) с помощта на праймери:

По време на втория кръг, като се използва ДНК на плазмид pKK223-3 като шаблон, се амплифицира ДНК фрагмент с размер 528 bp. (фрагмент KK1-KK2) с помощта на праймери:

В третия кръг на PCR, фрагменти (10.1-10.2) и (KK1-KK2) се комбинират при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 5 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) и инкубиране за 10 min при 72°C. ДНК, получена след последния PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°С, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира и се извършва рестрикционен анализ. В резултат на това се получава плазмид pSX10 с размер 2553 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX41

Рекомбинантният плазмид pSX41 е Hind III - BamHI ДНК фрагмент на векторен плазмид pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI ДНК фрагмент от 168 bp, кодиращ промотора на триптофановия оперон на Е. coli (P trp), EcoRI-XbaI синтетичен ДНК фрагмент от 20 bp, кодиращ SD последователността (Shine-Delgarno) и XbaI-BamHI ДНК фрагмент от 501 bp, кодиращ човешкия интерферон алфа 2b ген.

За да се получи Hind III - BamHI ДНК фрагмент на векторен плазмид pSX3 (2529 bp), ДНК на плазмид pSX3 се третира с рестрикционни ензими HindIII и BamHI, последвано от електрофоретично пречистване в 1% агарозен гел. Hind III EcoRI ДНК фрагмент от 168 bp, кодиращ промотора на триптофановия оперон (P trp), се получава чрез PCR, като се използва обща ДНК на E. coli като матрица и праймери TRP1 и PRP2, последвано от третиране на амплифицирания фрагмент с Hindll и EcoRI рестрикция ензими:

За да се получи EcoRI-Xbal синтетичен ДНК фрагмент от 20 bp, кодиращ SD последователността (Shine-Delgarno), се синтезират следните комплементарни олигонуклеотиди:

XbaI-BamIII ДНК фрагмент с размер 501 bp, кодиращ гена на човешки алфа 2b интерферон, се получава чрез PCR, използвайки тотална човешка ДНК като матрица и праймери IFN1 и IFN2, последвано от обработка на амплифицирания фрагмент с Xbal и BamIII рестрикционни ензими:

След това електрофоретично пречистените фрагменти се комбинират, лигират се с ензима Т4 фагова лигаза, ДНК се трансформира в клетки от щам E. coli DH5 и се поставят върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX41 с размер 3218 bp. След това се извършва мутагенеза стъпка по стъпка на гена на интерферона, за да се повиши нивото на експресия на целевия продукт. Мутагенезата на интерфероновия ген се състои в замяна на триплети, които рядко се срещат в Е. coli, кодиращи съответните аминокиселини, с триплети, които често се срещат в Е. coli, кодиращи същите аминокиселини. ДНК мутагенезата на интерфероновия ген се извършва с помощта на PCR метода.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX43

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX43, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX41 като шаблон и праймери IFN3 и IFN4:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX43 с размер 3218 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX45

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX45, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX43 като шаблон и праймери IFN5 и IFN6:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX45 с размер 3218 bp.

Конструиране на рекомбинантен плазмид pSX50.

За да се получи рекомбинантният плазмид pSX50, един цикъл на ДНК амплификация се извършва чрез PCR, като се използва ДНК на плазмида pSX45 като шаблон и праймери IFN7 и IFN8:

PCR се провежда при следните условия: нагряване при 95°C за 5 минути, 20 PCR цикъла (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) и инкубиране за 20 min при 72°C. ДНК, получена след PCR, се трансформира директно в клетки от E. coli щам DH5 и се поставя върху LA среда, съдържаща 20 μg/ml канамицин. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37°C, клоновете се елиминират, плазмидната ДНК се изолира, извършва се рестрикционен анализ и се определя първичната ДНК структура. В резултат на това се получава плазмид pSX50 с размер 3218 bp.

Пример 2. Получаване на щам Е. coli SX50 - продуцент на интерферон

Интерферон-продуциращият щам E. coli SX50 се получава чрез трансформиране на клетки от щам E. coli BL21 с рекомбинантния плазмид pSX50. Произвеждащият интерферон щам се отглежда в 30 литров ферментатор до оптична плътност от 25.0-30.0 p.u. в среда М9, съдържаща 1% казеинов кисел хидролизат (Difco), 1% глюкоза, 40 µg/ml канамицин, при температура 38-39°С. По време на процеса на ферментация се извършва непрекъснато добавяне на хранителен субстрат с помощта на гравиметричен контролер.

Пример 3. Метод за изолиране на интерферон от Е. coli щам SX50

Интерферонът се получава на 4 етапа:

Етап 1. Култивиране на Е. coli щам SX50.

Етап 2. Изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон.

Етап 3. Разтваряне и ренатурация на интерферон.

Етап 4. Хроматографско пречистване на интерферон.

Етап 1. Култивиране на Е. coli щам SX50

Отгледан инокулум на Е. coli щам SX50 в обем от 3 литра богата LB среда за 12 часа при 26°C се въвежда асептично във ферментатор, съдържащ 27 литра стерилна среда, съдържаща М9, 1% казеинов кисел хидролизат, 1% глюкоза, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 mg/ml канамицин. Култивирането във ферментатор се извършва при температура 38-39°C, като се поддържа pH 7±0,15 чрез автоматично титруване с 40% разтвор на натриев хидроксид. Концентрацията на разтворен кислород в диапазона (50±10)% от насищането се поддържа чрез промяна на скоростта на бъркалката от 100 до 800 rpm и подаване на въздух от 1 до 15 l/min. Концентрацията на субстратите, по-специално на глюкозата и екстракта от дрожди, се измерва по време на ферментацията и тяхната концентрация се поддържа чрез промяна на скоростта на подаване на концентрирани разтвори чрез перисталтични помпи с помощта на гравиметричен контролер.

Натрупването на интерферон в неразтворима форма се наблюдава с помощта на фазово контрастна микроскопия, електрофореза с 15% полиакриламиден гел (SDS-PAAG) и високоефективна хроматография с обърната фаза (RF HPLC). Ферментацията се спира, когато се достигне максималната оптична плътност (~ 25-30 p.u.) и синтезът на интерферон спира. В края на ферментацията културалната течност се отделя чрез центрофугиране в проточен ротор при скорост на въртене 5000-10000 rpm. Биомасата се опакова в найлонови торби и се замразява при минус 70°C.

Етап 2. Изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон

300-400 g замразена биомаса от Е. coli щам SX50 се суспендира в 3000 ml буфер 1 (20 mM Tris-HCl, рН 8.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100). Суспензията преминава през поточен хомогенизатор тип Gaulin, поддържа се при налягане от 900 bar и се центрофугира в поточен ротор при 15 000 rpm. Получената утайка се промива при подобни условия последователно с буфери 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M урея) и буфер 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) и накрая интерферон утайка се суспендира в 200 ml буфер 3. В този случай времето за изолиране и пречистване на неразтворимата форма на интерферон е не повече от 5 часа.

Етап 3. Разтваряне и ренатурация на интерферон

Към суспензията на неразтворимата форма на интерферон, получена в предишния етап, добавете сух гуанидин хидрохлорид до концентрация 6 М, добавете дитиотреитол до концентрация 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 до концентрация 50 mM, NaCl до концентрация от 150 mM и Triton X100 до концентрация от 0.1%, инкубирайте при стайна температура в продължение на 2 часа.Неразтвореният материал се отделя чрез стерилизиращо филтруване през мембрани с диаметър на порите от 0.22 микрона.

Ренатурирането на интерферон се извършва чрез бавно разреждане на получения разтвор 100-200 пъти с буфер 4 (20 mM Tris-HCl рН 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA). След което сместа за ренатуриране се инкубира при непрекъснато разбъркване в продължение на 12-15 часа при температура 4-8°С. След това се добавя магнезиев сулфат до концентрация от 1 тМ и агрегираният материал се отстранява чрез стерилизиращо филтруване през мембранен филтър с диаметър на порите 0,22 микрона.

Етап 4. Хроматографско пречистване на интерферон

Хроматографското пречистване на интерферон се извършва на три етапа.

1. Полученият ренатуриран интерферон първо се пречиства с помощта на афинитетна хроматография върху смола с хелатиращ сефароза Fast Flow (Amersham Biosciences), имобилизирана с Cu +2 йони. За да направите това, разтворът на интерферон се нанася в колона с Cu +2 хелатираща сефароза Fast Flow и интерферонът се елуира с 0,1 М буфер с лимонена киселина, рН 2,2.

2. Във втория етап на хроматографско пречистване разтворът на интерферон се прилага към CM Sepharose Fast Flow тип катионобменна смола (Amersham Biosciences) и интерферонът се елуира с градиент от разтвори (0,0-0,5 М NaCl) в 50 mM Na(CH3COO) буфер, рН 5.5.

3. Пречистването на мономерната форма на интерферон от остатъците от полимерни форми на интерферон се извършва на третия етап на пречистване на интерферон чрез гел филтриране върху смола Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографията се провежда в буфер от 50 тМ Na(CH3COO), рН 5.0, съдържащ 0.15 М NaCl.

Описаният метод за изолиране и пречистване на интерферон дава възможност да се получат 4-8 g високо пречистен интерферон в един цикъл на изолиране за 7-10 дни от биомаса, получена от 10 литра хранителна среда. Качеството на получения интерферон напълно отговаря на изискванията на “Европейската фармакопея” за веществото интерферон алфа-2b, а именно:

Концентрацията на интерферон е не по-малка от 2×10 8 IU/ml;

Специфичната активност на интерферона е не по-малка от 2,0 × 10 8 IU / mg;

Електрофоретичната чистота на лекарството е най-малко 99% при редуциращи и нередуциращи условия при оцветяване на гелове със сребро;

Изоелектричната точка на изолирания интерферон е в областта на рН 5,8-6,3;

Пептидната карта на изолирания интерферон не се различава фундаментално от пептидната карта за европейския стандартен интерферон алфа 2b CRS;

Както следва от дадените примери, претендираната група от изобретения дава възможност за получаване на интерферон алфа-2b с висок добив, като се използва сравнително проста и надеждна технология.

ИСК

1. Рекомбинантна плазмидна ДНК pSX50, кодираща синтеза на рекомбинантен човешки алфа-2b интерферон, характеризираща се с това, че има размер от 3218 базови двойки (bp) и се състои от следните фрагменти: последователността от 1 до 176 нуклеотида (bp) включва фрагмент ДНК от 176 bp, съдържащ триптофанов промотор (P trp), последователност от 177 до 194 nt. включва синтетичен ДНК фрагмент с размер 18 bp, съдържащ последователността на Shine Delgarno, отговорна за инициирането на транслацията, последователност от 195 до 695 nt. включва ДНК фрагмент от 501 bp, съдържащ гена на интерферон алфа-2b с нуклеотидни замествания: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С) ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), последователност от 696 до 713 nt. включва синтетичен ДНК фрагмент от 18 bp, съдържащ синтетичен полилинкер, последователност от 714 до 1138 nt. включва ДНК фрагмент на плазмид pKK223-3 от 4129 до 4553 nt. 425 bp по размер, съдържащ последователността на стриктния терминатор на транскрипция rrnBT 1 T 2, последователност от 1139 до 1229 nt. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 2487 до 2577 nt. 91 bp по размер, съдържащ промотора на -лактомазния ген (ген за устойчивост на ампицилин -Amp R), последователност от 1230 до 2045 nt. включва ДНК фрагмент на pUC4K плазмид със 720 nt. до 1535 г. сл. Хр 816 bp в размер, съдържащ структурната област на kan гена, последователност с 2046 bp. до 3218 n. включва ДНК фрагмент на плазмид pUC19 от 1625 до 453 nt. 1173 bp по размер, съдържащ последователността, отговорна за плазмидната репликация (ori) и lac промотора (P lac).

2. Бактериалният щам Eschcerichia coli SX50, трансформиран с рекомбинантния плазмид съгласно претенция 1, е производител на рекомбинантен човешки левкоцитен интерферон алфа-2b.

3. Метод за производство на човешки интерферон алфа-2b, включващ култивиране на щам Escherichia coli SX5 съгласно претенция 2 в хранителна среда с постоянно добавяне на хранителни субстрати по време на процеса на биосинтеза, механично унищожаване на клетки от микроорганизми при налягане от 700°С. 900 bar, разтваряне на интерферон в буферен разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатурация на интерферон във физиологични буферни разтвори в присъствието на хаотропни агенти, тристепенно хроматографско пречистване на интерферон върху Chelating Sepharose Fast Flow смоли, имобилизирани с Cu +2 йони, йонообмен хроматография върху CM Sepharose Fast Flow тип йонообменни смоли и гел филтрационна хроматография върху Superdex 75 тип смоли.

4. Методът съгласно претенция 3, при който култивирането се извършва върху хранителна среда с намалено съдържание на триптофан с непрекъснато добавяне на хранителни субстрати, за предпочитане глюкоза и екстракт от дрожди.

5. Метод съгласно претенция 3, при който преди разтваряне на интерферона, той се пречиства чрез отстраняване на разтворими клетъчни компоненти, включително ДНК, РНК, протеини, липополизахариди, промиване с буферни разтвори, съдържащи детергенти като Triton XI 00, урея.

6. Метод съгласно претенция 3, при който след всяко хроматографско пречистване се извършва стерилизиращо филтруване през филтри с размер на порите 0,22 микрона.

2018-02-02T17:43:00+03:00

Доказана ефективност на интерферон алфа 2b

Светът за първи път научи за интерферона, естествен протеин в човешкото тяло, през 1957 г., когато учените Алик Айзъкс и Жан Линденман откриха феномена на интерференцията, сложен механизъм на биологични процеси, благодарение на които тялото е в състояние да се бори с различни заболявания. Но през миналия век вероятно не са подозирали, че този протеин ще стане основен компонент на много лекарства.

Интерфероните са протеини, които се произвеждат от клетките на тялото, когато вирусите ги нахлуят. Благодарение на тях се активират гени, отговорни за синтеза на защитни вътреклетъчни молекули, които осигуряват антивирусен ефект чрез потискане на синтеза на вирусни протеини и предотвратяване на неговото възпроизвеждане. С други думи, тези протеини (те се наричат ​​още цитокини) в тялото ни действат като мощни защитници, които пазят здравето ни и бдят стриктно, за да можем, ако е необходимо, незабавно да отблъснем атаката на вирусите и да победим болестта.

За да защити тялото, заразено с вируси, интерферонът се произвежда от почти всички клетки на нашето тяло. Освен това образуването му може да бъде стимулирано не само от вируси, но и от бактериални токсини, така че този протеин е ефективен и срещу някои бактериални инфекции. По този начин можем да заключим, че този цитокин е много важен компонент на човешката имунна система. Без него човечеството отдавна щеше да бъде победено от множество вируси и бактерии.

Видове интерферони

Интерфероните са разделени на три вида: алфа, бета и гама, които се произвеждат от различни клетки.

• Интерферон алфа активира така наречените естествени клетки убийци - левкоцити, които унищожават вируси, бактерии и други "вражески" агенти.
• Интерферон бета се произвежда във фибробласти, епителни клетки и макрофаги, които абсорбират инфекциозни агенти.
• Интерферон гама се произвежда от Т-лимфоцити, основната му функция, подобно на други видове, е регулирането на имунитета.

Как е доказана ефективността на интерферона при ARVI?

Както е известно, в своята дейност, когато предписват терапия, лекарите разчитат на своя опит и вече изградена система от знания. Но медицината се развива бързо: всяка година по света се разработват нови ефективни методи за лечение и се патентоват нови лекарства. Ето защо имаше нужда от систематизиране на най-новите постижения и открития в медицината, което доведе до клинични препоръки и стандарти за лечение. Тези документирани алгоритми, базирани на доказан клиничен опит, описват необходимите инструкции за диагностика, лечение, рехабилитация, профилактика на заболявания и помагат на лекаря да вземе решения за избора на тактика на лечение в дадена ситуация.

Например, по въпросите на предоставянето на медицинска помощ на деца по проблема с острите респираторни вирусни инфекции и грипа, групата за развитие се състои от около 40 души и включва водещи руски специалисти в областта на инфекциозните заболявания от различни институции и различни отдели. Логично е, че експертите обръщат специално внимание на лекарства, които са в състояние да се справят с болестите възможно най-бързо и в същото време да имат минимални странични ефекти. Сега говорим за лекарства, съдържащи интерферон, които помагат в борбата с ARVI при възрастни и деца.

Както бе споменато по-горе, способността им да се борят с вируси е открита по време на изследване на смущенията от учени Айзъкс и Линденман. Те описват интерферона като „протеин, много по-малък от имуноглобулините, който се произвежда от клетките на тялото след инфекция с живи или инактивирани вируси; способен да инхибира растежа на различни вируси в дози, които не са токсични за клетките. Днес е известно, че тези протеини могат да се произвеждат от почти всички клетки на тялото в отговор на въвеждането на чужда информация, независимо от нейната етиология (вируси, гъбички, бактерии, вътреклетъчни патогени, онкогени). И основният им биологичен ефект се състои в процесите на разпознаване и отстраняване на тази чужда информация. С други думи, тези защитни молекули „знаят как“ нежно и точно да унищожат вирусите, които са окупирали клетките, без да увреждат самите клетки. Това е потвърдено от множество научни изследвания.

Що се отнася до методите за използване на лекарства, съдържащи интерферони, е необходимо да се споменат някои нюанси. Един от основните проблеми на терапията с интерферон е да се „достави“ ефективната доза от лекарството, без да се причиняват негативни последици. В някои случаи интрамускулното или интравенозно приложение на лекарства, съдържащи интерферон, води до странични ефекти като треска, втрисане, главоболие и други нежелани реакции. Тези симптоми не са критични за тялото и скоро изчезват, но в процеса на лечение причиняват дискомфорт.

Използването на супозитории, съдържащи интерферон алфа-2b, позволява да се сведат до минимум страничните ефекти от лечението с интерферон или да се направи без тях. Според научни изследвания, ректалното приложение на рекомбинантен човешки интерферон в първите дни на остра респираторна вирусна инфекция намалява продължителността на треската, бори се с хрема и ви позволява бързо да победите болестта 2. Интраназалното приложение на лекарства (когато лекарството се прилага върху носната лигавица), съдържащи интерферон алфа-2b, допълва лечението и осигурява оптимален ефект от лечението. Едно от лекарствата, които са подходящи за борба с грип и други остри респираторни вирусни инфекции във всеки стадий на заболяването, е ВИФЕРОН. Предлага се под формата на супозитории (свещи), гел и мехлем.

Кратки инструкции за употреба и поносимост на лекарства, съдържащи интерферон алфа-2b

Кой може да приема лекарства VIFERON:

• възрастни;
• деца от първите дни на живота;
• бременни от 4-та гестационна седмица.

Признание от научната общност

Интерферон алфа-2b (VIFERON) е включен в три федерални стандарта за медицинска помощ като препоръчително лекарство за лечение на грип и ARVI, както и в три федерални протокола за лечение на тези заболявания. 1 Ако вземем предвид не само грипа и ARVI, но и други заболявания, тогава броят на стандартите и препоръките по отношение на това лекарство е още по-голям - интерферонът (VIFERON) е включен в 30 федерални стандарта за предоставяне на медицинска помощ на възрастни и деца, одобрени от Министерството на здравеопазването на Руската федерация, както и в 21 Протокол (Клинични указания) за предоставяне на медицинска помощ на възрастни, включително бременни жени и деца.

Принципът на действие на лекарството

Човешкият рекомбинантен интерферон алфа-2b, който е част от лекарството VIFERON, има антивирусни, имуномодулиращи свойства и потиска репликацията на РНК и ДНК вируси. Антивирусната терапия срещу грип може да започне във всяка фаза на заболяването. Това ще помогне за подобряване на състоянието и предотвратяване на развитието на усложнения 2. Лекарството VIFERON включва общопризнати високоактивни антиоксиданти: в супозитории това са витамини Е и С, в мехлеми - витамин Е, в гел - витамин Е, лимонена и бензоена киселина. На фона на такава антиоксидантна подкрепа се отбелязва повишаване на антивирусната активност на интерфероните.

Резултати от тестове за наркотици

VIFERON е преминал пълен цикъл от клинични изпитвания за широк спектър от различни заболявания във водещи клиники в Русия. Резултатът от проучванията е доказателство за терапевтичната и профилактична ефективност на лекарството VIFERON при различни инфекциозни и възпалителни заболявания при възрастни и деца, включително новородени и бременни жени. Научно доказано е, че сложният състав и форма на освобождаване осигуряват на лекарството VIFERON уникални фармакокинетични характеристики, с удължаване на действието на интерферона при липса на странични ефекти, присъщи на парентералните препарати на рекомбинантни интерферони 3.

За какви заболявания се използват лекарства на базата на интерферон?алфа-2 b

Лекарството VIFERON под формата на супозитории, гел и мехлем се използва за лечение на следните заболявания:

• ARVI, включително грип;
• херпес;
• папиломавирусна инфекция;
• ентеровирусна инфекция;
• ларинготрахеобронхит;
• хроничен хепатит B, C, D, включително тези, усложнени от цироза на черния дроб;
• бактериална вагиноза;
• кандидоза;
• микоплазмоза;
• уреаплазмоза;
• гарднерелоза.

Използването на лекарството VIFERON като част от комплексната антивирусна терапия позволява да се намалят терапевтичните дози на антибактериални и хормонални лекарства, както и да се намалят токсичните ефекти на тази терапия.

Общ лекар

1. http://www.rosminzdrav.ru, Заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
2. Нестерова И.В. „Лекарства с интерферон в клиничната практика: кога и как“, „Лекуващ лекар“, септември 2017 г.
3. ВИФЕРОН е комплексно антивирусно и имуномодулиращо лекарство за лечение на инфекциозни и възпалителни заболявания в перинатологията. (Ръководство за лекари), Москва, 2014 г.

Използвани източници: http://www.lsgeotar.ru

Mur_zilka 18.09.2009 г. в 14:56:57

Въпрос към фармацевтите! Viferon - човешки рекомбинантен интерферон алфа 2b. Направено от човешка кръв? Има ли опасност от заразяване с инфекции като ХИВ, хепатит???

Винаги съм бил предпазлив от интерферонови капки, след като прочетох надписа на опаковката „тествано, без СПИН“. Като знам как проверяват тук, просто не вярвам на този текст. Но имаше чувство на предпазливост.
Някой знае ли как се приготвя Viferon?

• Lady 18.09.2009 в 15:36:30

  рекомбинантни - не от кръв

  рекомбинантен - това е, когато бактерии с един необходим човешки ген, добавен към тях, произвеждат интерферон

  • Mur_zilka 18.09.2009 г. в 15:39:12

    Благодаря ти)

    • Mur_zilka 18.09.2009 г. в 16:16:42

      Намерих го онлайн: рекомбинантен - създаден чрез методите на генното инженерство.

      • Bat_mouse 20.09.2009 г. в 00:50:25

        А, и ме успокоиха.

        Мислех, че го правят и от кръвта на непроверени хора, които даряват кръв за пари....

        • BusinkaD 20.09.2009 г. в 22:21:57

          Това е, което наскоро прочетох за Viferon.

          Не съм го писал аз, цитирам го дословно от Rusmedserver.
          Като цяло правилата за търсене. Но ще отговоря подробно, за да можете да го разпечатате и да го занесете на лекар. Може би това ще помогне?

          И така, супозиториите Viferon съдържат рекомбинантен (генно инженерен, т.е. по същество биосинтетичен) интерферон, абсолютно идентичен с човешкия интерферон алфа 2 b. Това е нечовешки левкоцитен интерферон, който се получава от кръв (от човешки кръвни левкоцити). От епидемиологична гледна точка Viferon е доста безопасен.

          Това обаче има три аспекта.

          1. Интерферонът трябва да се прилага парентерално (подкожно или интрамускулно), т.к. слабо се абсорбира през лигавиците и се разрушава от стомашно-чревното съдържание. Тоест има основателни съмнения, че интерферон алфа, приложен ректално (особено в такива незначителни дози), изобщо попада в кръвта.

          2. Интерферон алфа има доказана ефективност при някои инфекциозни заболявания (хроничен вирусен хепатит) и при някои тумори (например рак на бъбреците, хронична миелоидна левкемия и др.), но е доказано, че при остри респираторни и остри чревни инфекции (вирусни или бактериален) интерферон алфа под всякаква форма е неефективен. Тези работи са извършени доста отдавна (в края на 80-те - началото на 90-те години), публикувани са и са добре известни на специалистите.

          3. Интерферон алфа е мощно и ефективно лекарство в някои случаи, но профилът му на безопасност не е идеален. Има доста странични ефекти. Просто за забавление, въведете в интернет търсене, например „Intron“ (това е интерферон алфа 2b, произведен в чужбина, активното вещество е същото като във Viferon) или „Altevir“ (това е интерферон алфа 2b, произведен от нас, и , интересно, със същия завод произвежда интерферон алфа 2b вещество за производството на супозитории Viferon). Вижте раздела "Странични ефекти". След това вижте страничните ефекти на Viferon (според инструкциите за лекарството няма такива). Странно, нали?
          Мисля, че това несъответствие е достатъчно интересен въпрос, който да зададете на лекаря, предписал Viferon.

          • ustinka 20.09.2009 г. в 22:59:07

            1) Ректалният метод на приложение на лекарства не се класифицира като ентерален, тъй като лекарствата се абсорбират много бързо поради развитата система за кръвоснабдяване; навлизат в системния кръвен поток, заобикаляйки черния дроб (където повечето лекарства са инактивирани) и не се влияят от храносмилателните сокове.
            2).при чисто бактериалните инфекции наистина няма ефект, но при смесените и вирусните има много голям ефект, явно имаме различни източници на информация
            3).основните странични ефекти са свързани с употребата на ВИСОКИ дози от лекарството (над 3 милиона) и ИНЖЕКТИРАНЕ в супозитории, максималната доза е 3 милиона.

            • BusinkaD 22.09.2009 г. в 00:31:05

              Е, не мога да не се доверя на тези проучвания.

              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7741994
              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8414778
              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2080867
              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3215290
              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3524441
              //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6381610
              //aac.asm.org/cgi/pmidlookup?vi...g&pmid=2543280
              //aac.asm.org/cgi/pmidlookup?vi...g&pmid=2834996
              //aac.asm.org/cgi/pmidlookup?vi...g&pmid=6089652

              ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..
              Правенето на грешки е човешко,
              дяволът упорства в грешката.....

              • ustinka 22.09.2009 г. в 01:01:26

                по същата причина не съм склонен да се доверя на публикуваната в него информация.
                Приемам на вяра само печатни версии от реномирани издателства, за предпочитане свежи.

                • BusinkaD 22.09.2009 г. в 09:04:03

                  издателства
                  1. Значи, според вас, кръвта след интравенозна инжекция не преминава през черния дроб?
                  2. Горните проучвания показват неефективността на интерферона при остри респираторни и остри чревни инфекции (вирусни или бактериални) под всякаква форма.
                  3. Следвайки собствената си логика, ако прилагането на по-малки дози от лекарството има подобен ефект на прилагането на големи дози парентерално, то страничните ефекти трябва да са при по-ниски концентрации.

                  Употребата на ВСЯКО лекарство трябва да бъде оправдана Защо да използвате неефективни лекарства за остри респираторни инфекции или тяхната превенция?

                  ERRARE HUMANUM EST, SED DIABOLICUM PERSEVERARE…..
                  Правенето на грешки е човешко,
                  дяволът упорства в грешката.....

                  • ustinka 22.09.2009 г. в 12:36:41

                    Трудно е да се определи в интернет кой е „отговорен за пазара“ - IMHO
                    1. кръвта преминава през черния дроб във всеки случай, има значение кога преди лекарството да влезе в общия кръвен поток (с перорално приложение) или след (с ректално, сублингвално, парентерално приложение)
                    2. Още веднъж повтарям - има данни, доказващи ефективността му срещу ВИРУСНИ инфекции. и ако не сте ги намерили, това не означава, че не е вярно
                    3. Не съм твърдял, че ефектът от различните дози е подобен, различни дози се използват за различни заболявания и няма нужда да се използват високи дози за ARVI.
                    Ако сте запознати с фармакологията, тогава понятието „широчина на терапевтично действие“ обяснява връзката между дозата и страничните ефекти.
                    Основните нежелани реакции са свързани конкретно с начина на приложение на лекарството (често реакциите може да не са към самото активно вещество, а към консерванти, буфери и др.)