22.09.2019

Флуоресцентна микроскопия

Възбудени атоми и молекули на пробата. Широко използван в материалознанието и биомедицинските области.

Енциклопедичен YouTube

1 / 3

✪ Флуоресцентна микроскопия: от клетка към молекула

✪ Флуоресцентна микроскопия (мозъчен тумор)

✪ Патрушев за флуоресцентната микроскопия със супер резолюция

субтитри

Описание

Биологичният материал, като правило, флуоресцира изключително слабо сам по себе си, но благодарение на използването на ярки и разнообразни флуоресцентни молекули (флуорофори), които могат специфично да оцветяват различни структури на тъкани и клетки, методът на флуоресцентната микроскопия се оказа много ценен за биомедицинските науки.

Традиционните техники за флуоресцентна микроскопия имат значително по-ниска разделителна способност в сравнение с електронната или атомно-силовата микроскопия. Въпреки това, за разлика от последния, оптичната микроскопия позволява да се наблюдава вътрешната микроструктура на клетките и дори на малките организми, не само фиксирани, но и живи. Благодарение на това флуоресцентната микроскопия се е доказала като най-добрият метод за изследване на механизмите на функциониране на организмите на клетъчно, субклетъчно и молекулярно ниво.

При флуоресцентен микроскоп пробата се облъчва със светлина с по-висока честота и изображението се получава в оптичния спектър. Излъчването на пробата съответно преминава през филтър, който прекъсва светлината при честотата на възбуждане. Изображението на флуоресцентното лекарство може да бъде снимано със специализирана цифрова камера, която позволява заснемането на изображения с дълга експозиция. За някои изображения това време може да бъде до 60 минути.

Интензивното развитие на флуоресцентната микроскопия в началото на 20-ти и 21-ви век доведе до разработването на нови методи - двуфотонна и конфокална микроскопия, както и редица подходи, които направиха възможно преодоляването на дифракционната бариера на оптичната разделителна способност и постигане на безпрецедентна нано разделителна способност.

Един вид флуоресцентна микроскопия е конфокалната микроскопия, техника, която позволява да се вземат изображения от известна дълбочина в средата на пробата. Най-простият метод, чрез който може да се изследва повърхност, се нарича епифлуоресцентна микроскопия.

Флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение

Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRFM) се основава на феномена на отражение на електромагнитни вълни от интерфейса на две прозрачни среди, което възниква, когато вълната пада от среда с по-висок индекс на пречупване под ъгъл, по-голям от критичния ( 1/n). Интензитетът на радиацията, проникваща във втората среда, намалява експоненциално, което прави възможно откриването на флуоресцентни обекти, възбудени от това излъчване, в граничен слой с дебелина ~ 100 nm с разделителна способност до 10 nm. По този начин TIRFM може с право да се счита за един от методите на флуоресцентната наноскопия. В биологията методът се използва за визуализиране на плазмената мембрана и околомембранните структури на клетките.

Флуоресцентна наноскопия

През последните години бяха разработени няколко нови подхода за флуоресцентна микроскопия, които преодоляха дифракционната бариера на оптичната разделителна способност и постигнаха безпрецедентна разделителна способност от ~10 nm. Тези методи започнаха да се обединяват под общия термин флуоресцентна наноскопия.

Системите за флуоресцентна наноскопия се основават на три фундаментално различни подхода:

подобрено фокусиране чрез създаване на нови оптични дизайни и използване на лещи с висока ъглова апертура (4Pi, I5M и I5S микроскопия);
използване на явлението пълно вътрешно отражение (флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение, TIRFM);
контролирано “включване” и “изключване” на флуоресцентни молекули и тяхното последователно откриване (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Могат да се предвидят няколко приложения на флуоресцентни наноскопични техники в биологията и медицината. Наноскопията позволява директно изследване на взаимодействията между

ЛУМИНЕСЦЕНТНА МИКРОСКОПИЯ(Латински lumen, luminis _ светлина; гръцки, mikros малък + skopeo за разглеждане, изследване; син. флуоресцентна микроскопия) - метод на микроскопия, който ви позволява да наблюдавате първичната или вторичната луминесценция на микроорганизми, клетки, тъкани или отделни структури, които ги съставят. Луминесценцията (виж) се възбужда от късовълновата (синьо-виолетова) част от видимата светлина или ултравиолетовите лъчи с дължина на вълната, близка до видимата светлина. Цветът на луминесценцията, т.е. дължината на вълната на излъчваната светлина, зависи от химичната структура и от физикохимичното състояние на микроскопичния обект, което позволява използването на луминесценцията за целите на микробиологичната и цитологичната диагностика и разграничаването на отделните компоненти на клетката. Първичната луминесценция е присъща на редица биологично активни вещества, като ароматни аминокиселини, порфирини, хлорофил, витамини А, В2, В1, някои антибиотици (тетрациклин) и химиотерапевтични вещества (акрихин, риванол). Вторичната или индуцирана луминесценция възниква в резултат на третиране на микроскопични обекти с флуоресцентни багрила - флуорохроми. Някои от тези багрила са дифузно разпределени в клетките (например флуоресцеин), други селективно се свързват с определени клетъчни структури или дори с определени химикали. вещества. Тази селективна способност за оцветяване на флуорохромите позволява флуоресцентна цитология. и флуоресцентна цитохимия. изследвания.

В историята на развитието на L. m. има няколко етапа, свързани с подобряването на техниката:

1) доказателство на А. Кьолер за фундаменталната възможност за създаване на луминесцентен микроскоп; 2) създаването през 1911 г. на луминесцентен микроскоп, който е използван от руския ботаник М. С. Цвет за изследване на луминесценцията на хлорофила в растителните клетки; 3) използването на силно разредени разтвори на флуорохроми, които селективно се свързват с определени клетъчни структури [Haitinger (M. Haitinger, 1933-1935)], и преди всичко акридин оранжево [Haitinger, S. Strugger, 1940]; 4) разработване на метод за възбуждане на луминесценция чрез падаща светлина през микроскопска леща с помощта на интерферентна плоча за разделяне на лъча (E.M. Brumberg и G.N. Krylova, 1953) и производството на луминесцентни микроскопи и устройства, базирани на този принцип, от местната индустрия (ML -1, ML -2, OI-17); 5) създаване на метода на имунофлуоресценция (виж), който намери широко приложение в микробиологията, имунологията и други области на медицинската биол. изследвания [Кунс (A. N. Goons), 1942, 1950].

В СССР значителен принос за развитието и разпространението на медико-биологичната медицина. изследване, направено от M. N. Meisel.

За извършване на LM се използват специални луминесцентни микроскопи или приставки към конвенционални биомикроскопи, което им позволява да се използват за наблюдение на луминесценцията на микрообекти (виж Микроскоп). Дизайнът на флуоресцентните микроскопи се основава на някои физически закони на луминесценцията. Един от тях е законът на Стокс, според който максимумът на спектъра на луминесценция се измества в областта на дългите вълни по отношение на спектъра на възбуждащата светлина. Това прави възможно използването на принципа на кръстосаните светлинни филтри за лазерна микроскопия, който се състои в това, че късовълновата светлинна радиация (ултравиолетова, синьо-виолетова), която възбужда луминесценция, се излъчва от вълнуващ светлинен филтър, поставен пред осветителя на микроскопа. След преминаване през лекарството, луминесценцията се възбужда, тази светлина се абсорбира напълно от блокиращ филтър, който предава луминисцентна светлина с по-дълга дължина на вълната.

Луминесцентният микроскоп е оборудван с мощен източник на светлина с висока повърхностна яркост, чиято максимална емисия е в късовълновата област на видимия спектър, система от светлинни филтри, както и интерферентна пластина за разделяне на лъчи (или набор от такива пластини), използвани за възбуждане на луминесценция чрез падаща светлина. Тази система за възбуждане на луминесценция от падаща светлина през непрозрачен осветител, използвана в домашни луминесцентни микроскопи (и напоследък в луминесцентни микроскопи, произведени от чуждестранни компании), има редица значителни предимства: 1) интерферентна плоча за разделяне на лъчи с нанесени слоеве от диелектрици върху него селективно отразява лекарството съдържа повече от 90% от светлината, която възбужда луминесценцията, и почти напълно предава луминисцентна светлина с по-дълга дължина на вълната, което прави възможно увеличаването на яркостта на луминесценцията; 2) обективът на микроскопа едновременно служи като кондензатор за осветителната система; следователно, когато се използват потапящи се обективи с висока апертура с голямо увеличение, осветяването на препарата и съответно яркостта на луминесценцията се увеличават пропорционално на четвъртата степен на апертурата на обектива; 3) флуоресцентната микроскопия може да се комбинира с фазово-контрастна и интерферентна микроскопия, когато се осветява отдолу през кондензатора на микроскопа. Източниците на осветление за LM често са живачно-кварцови лампи с ултрависоко налягане, както и ксенонови лампи и кварцово-халогенни лампи с нажежаема жичка. Като светлинен филтър се използва оцветено в масата оптично стъкло или се използват интерферентни филтри с по-добри спектрални характеристики.

За възбуждане на луминесценция по време на LM се използват и оптични квантови генератори - лазери, чието излъчване е силно интензивно и монохроматично. В този случай няма нужда да използвате вълнуващи светлинни филтри.

Тъй като дълговълновите ултравиолетови, синьо-виолетови и понякога зелени области на спектъра обикновено се използват за възбуждане на луминесценция в луминесцентни микроскопи, обикновената стъклена оптика и обикновените стъклени предметни стъкла и покривни стъкла, които предават радиация в тази част на спектъра и не имат собствена луминесценция, се използват в луминесцентен микроскоп. Средите за потапяне и задържане също трябва да отговарят на тези изисквания.

Буферен разтвор на глицерол, както и нелуминесцентни полимери (полистирен, поливинилалкохол и др.) Могат да се използват като обграждащи среди за лекарства.

Наред с визуалната оценка на луминесцентното микроскопско изображение се използва микрофотография (виж Микрофотография). Луминесцентната микрофотография има редица характеристики. От една страна, недостатъчната яркост на сиянието изисква продължителна експозиция, от друга страна, под въздействието на вълнуваща светлина, интензитетът на луминесценцията бързо намалява, препаратите избледняват, живите клетки се увреждат и умират и следователно е невъзможно да се запише динамиката на процесите, протичащи в клетките. За преодоляване на тези трудности е необходимо използването на фотографски материали с висока обща и селективна спектрална чувствителност, високоапертурни лещи, окуляри с минимално собствено увеличение, но достатъчно за предаване на детайлите на обекта, и приставки за микрофото с малък формат. Също така е възможно препаратите да се третират с вещества, които намаляват избледняването (хидрохинон и др.).

М. Я. Корн и М. М. Бутлов и др. (1968) разработи оборудване и техники за цветна луминесцентна микрофотография и заснемане с помощта на електронно-оптични усилватели на яркостта, които позволяват да се намали експозицията с няколко порядъка и да се регистрира динамиката на процесите, протичащи в живите клетки.

За количествено записване на интензитета на луминесценция на структурите на микрообектите - цитофлуориметрия - се използват предимно фотоелектрични методи с помощта на фотоумножителна тръба (PMT) като чувствително записващо устройство (вижте Фотоумножители). Те също така използват метод за регистриране на интензитета на луминесценция на клетките и техните структури в определени части от спектъра - цитоспектрофлуориметрия. Предимствата на цитофлуориметрията пред абсорбционната цитофотометрия са нейната по-висока чувствителност и липсата на влияние върху резултатите от измерването на естеството на разпределението на веществото в клетката или клетъчната структура.

Една от възможностите за количествена регистрация на луминесценция на микрообекти е методът на импулсна цитофлуориметрия (поточна цитофлуориметрия) и "сортиране" на клетките според луминесцентните характеристики. Тези методи позволяват да се анализира интензитета на луминесценция на десетки хиляди клетки в минута и да се разделят според естеството на луминесценцията. Сред методите за луминесцентно изследване на микрообекти най-широко използваните са директната флуорохромизация - флуорохромно оцветяване и имунофлуоресценция.

Домашната промишленост произвежда различно оборудване за микроскопска микроскопия.Най-широко използваният микроскоп е ML-2, произвеждан в няколко версии. Произвежда се и серия унифицирани флуоресцентни микроскопи „Лумам”, както и луминесцентни осветители с кварцови халогенни лампи (ОИ-28, ОИ-30).

Микроскопите от серията "Lumam" се състоят от унифицирани модули, различни комбинации от които позволяват да се получат три работни модела (P1 - RZ) и три изследователски модела (I1 - I3), различаващи се един от друг по конфигурация и възможности за използване ( фиг.).

Осветители OI-28 и OI-30 са инсталирани на конвенционални биологични микроскопи; те са проектирани да осветяват обекти отгоре през непрозрачен илюминатор със светлина, която възбужда видима луминесценция.

Осветителят OI-30 се отличава с това, че комплектът му включва контактни лещи.

L. m. се използват широко във вирусологията, микробиологията, хематологията, клиновата, цитодиагностиката (особено в онкологията за откриване на злокачествени клетки), в цитогенетиката за изследване на хромозомите. За тази цел от дълго време се използва акридин оранжев флуорохром; Флуорохромите етидиев бромид (етидиев бромид) и пропидиев йодид (припидиев йодид) също се използват, главно за ДНК цитофлуориметрия, както и луминесцентни версии на реакцията на Feilgen. Акридиновото оранжево стана широко разпространено в луминесцентната микроскопия на нуклеопротеините поради факта, че комплексите, образувани от този флуорохром с двойноверижна ДНК, имат зелена луминесценция, а комплексите с РНК и едноверижна ДНК имат червена луминесценция. Известни са и луминесцентни цитохимични методи. методи за идентифициране на протеини и липиди. За качествено и количествено изследване на локализацията на протеини в клетките се използват проционови багрила, флуорескамин и липиди - 3,4-бензпирен, фосфин ZR и др. Тетрациклинът и неговите производни се използват за луминесцентно микроскопско изследване на костната тъкан и някои промени в клетките по време на злокачествено заболяване.

L. m. в комбинация с директна флуорохромизация на фиксирани препарати се използва в бактериоскопската диагностика за откриване на киселинно-устойчиви микобактерии, гонококи, дифтерийни патогени, маларийни патогени в кръвни натривки и др. методи на оцветяване (например оцветяване по Ziehl-Neelsen). Флуорохромното покритие се използва и при санитарни бактерии. изследвания за откриване и изброяване на микроорганизми във вода и почва. Един от методите за флуоресцентна микроскопска диагностика е откриването на микроколонии върху мембранни филтри след краткотраен растеж и флуорохромизация.

Още през 1940 г. Strugger предложи използването на акридин оранжево за разграничаване на живи и мъртви бактерии, но последващи проучвания показаха липсата на надеждност на този метод. В тази връзка, за да се определи жизнеспособността на клетките (по-специално, когато са изложени на цитотоксични фактори), се използва флуоресцеин диацетат или неговата комбинация с етидиев бромид. Нелуминесцентният флуоресцеинов естер се разцепва от естерази на жизнеспособна клетка, освобождавайки ярко луминесцентно зелен флуоресцеин, а етидиевият бромид причинява червена луминесценция само в мъртвите клетки.

Да изучава физични и хим състоянието на клетъчните мембрани се използва т.нар. хидрофобни флуоресцентни проби. За целта клетките се третират с вещества, които не луминесцират в разтвор, а започват да луминесцират чрез свързване с хидрофобни зони на клетъчните мембрани, като интензитетът и цветът на луминесценцията зависят от химикала. структура и физикохим състоянието на структурите, с които са свързани тези флуорохроми. Едно от най-често срещаните вещества от този вид е 1-анилино-S-нафтален сулфонова киселина (1.8 ANS).

Използване на метода за изучаване на физико-хим състояния на макромолекули, към които са свързани флуорохроми в различни клетъчни структури, също е поляризирана флуоресцентна микроскопия.

Значително предимство на LM пред другите методи за микроскопско изследване е възможността за интравитална (цветна фиг. 1-3) и суправитална флуорохромизация с много ниски, нискотоксични концентрации на флуорохроми. В този случай различни флуорохроми могат да се свързват с различни клетъчни структури. Акридиново оранжево, например, се натрупва в лизозомите на жива клетка и те започват да флуоресцират с червена светлина. Същата луминесценция се придобива от фагоцитирани бактерии във фагозомите. Тетрациклинът се свързва с митохондриите на клетките или техните аналози в бактериите и луминесцира с жълто-зелена светлина, а интензивността на луминесценцията (количеството на свързания тетрациклин) зависи от чувствителността на бактериите към този антибиотик.

Възможно е също така да се флуорохромират клетки и тъкани in situ, за да се изследват с помощта на контакт L. m.

В лабораторията се използва флуоресцентна микроскопия на вируси. диагностика на вирусни заболявания за идентифициране на вирусен антиген в клетките, изследване на химията. съставът на вътреклетъчните вирусни включвания, определяне на относителната концентрация на вирусни антигени и нуклеинови киселини чрез интензитета на специфичната флуоресценция и др. В зависимост от целите на изследването, като обекти се използват петна, отпечатъци, тъканни изстъргвания или препарати от клетъчни култури.

В съвременната вирусология най-разпространени са два метода на LM: 1) идентифициране и диференциране на вируси с нуклеинова киселина в заразени клетки и пречистени вирусни суспензии с помощта на аминоакридинови флуорохроми; 2) откриване на вирусни антигени с помощта на имунофлуоресценция.

От аминоакридините най-често се използва акридиново оранжево, което придава на молекулите на двойноверижните нуклеинови киселини (обикновено ДНК) зелено, а на едноверижните нуклеинови киселини (обикновено РНК) рубиненочервена флуоресценция (цв. фиг. 4-8). Методът е приложим както върху нативни препарати, така и след фиксация в ацетон, течност на Карнуа и др. Резултатите от оцветяването до голяма степен зависят от концентрацията (обикновено 1:10 000 - 1:100 000) и pH на флуорохрома.

Методът на имунофлуоресценция се използва за идентифициране на вируси в клетките, изследване на динамиката на натрупване на вирусен антиген в клетка, определяне на вътреклетъчната локализация на вирусни натрупвания, определяне на естеството на вирусните включвания, изследване на антигенната структура на вирусите, диференциране на тясно свързани вируси, титруване на вируси в клетъчни култури, идентифициране на антигени на туморни вируси в тъкани и клетки, изследване на патогенезата на вирусни заболявания, наблюдение на вирусно замърсяване на клетъчни култури, изследване на хрон, вирусни инфекции и др. Методът е приложим както в директни, така и в индиректни модификации. За правилното тълкуване на резултатите от изследването е важно да се вземе предвид концентрацията и чистотата на използваните антитела и техните конюгати с флуорохроми, времето и температурата на фиксиране на лекарствата (обикновено с ацетон) и тяхното третиране с антитела. Най-често за маркиране на антитела се използват флуоресцеин изотиоцианат (FITC), който дава характерен зелен блясък (цвят Фиг. 9) и лизамин-родамин сулфохлорид В 200, който свети в оранжево-червено.

Имунофлуоресцентният метод също така позволява откриване на антитела срещу вирусни антигени в клетките и тъканите.

L. m. на вирусите се използва за диагностициране на инфекции като едра шарка, херпес, паротит и др. L. m. е от особено значение при експресната диагностика на респираторни вирусни инфекции, когато се правят отпечатъци от носната лигавица на пациенти (риноцитограми). обработени с помощта на следните методи по-горе с цел идентифициране на антигени или определяне на типа нуклеинова киселина. Че. извършва диференциална диагноза между инфекции, причинени от вируси на грип A2 или B, параинфлуенца, аденовируси, респираторен синцитиален вирус или комбинации от тези вируси. Възможна е и диагностика чрез LM на клетъчни култури, заразени с материал от пациенти. Окончателната диагноза във всички случаи се прави чрез комбиниране на данни от L. m. с резултатите от вирусни и серолни изследвания на пациенти.

Луминесцентната микроскопия на органи и тъкани е един от съвременните методи за изследване, използвани в нормалната и патологична хистология. Основните предимства на L. m. са висока чувствителност (по-чувствителни от конвенционалните цито- и хистохимични методи поне 1000 пъти), лекота на количествено измерване на съдържанието на различни химикали. тъканни компоненти и клетки, наличие на оборудване. За луминесценция на органи и тъкани се използват първична и вторична луминесценция. Първичната луминесценция (луминесцентно сияние, което възниква без предварителна обработка на лекарства) се притежава с достатъчна интензивност от някои вещества, които изграждат клетките и тъканите: витамини (витамин B2 дава жълто-зелена луминесценция, витамин B1 в алкален разтвор се превръща в трихром и дава синя луминесценция , каротин луминесценция с жълто-зелена светлина, витамин А, когато се облъчва в UV спектъра, има синьо-бяла луминесценция), хормони (естрогени, адреналин дават жълто-зелена луминесценция, серотонин, норепинефрин, когато лекарствата се третират с изпарения на концентрирана сярна киселина, те имат жълта луминесценция) , липопигменти (липофусцин дава червена луминесценция, цероид - синкав) и др. Принципът на първичната луминесценция е в основата на цитохимията, количествено изследване на съдържанието на различни клетъчни компоненти (предимно протеини), използвайки метод на луминесценция в UV лъчи.

Вторичната луминесценция на органи и тъкани се постига чрез третиране на препарати с флуорохроми (виж). Акридиновият портокал се използва за диагностициране на рак в препарати цитол и гистол. Същата боя се използва за определяне на ранните стадии на инфаркт на миокарда (зоните на исхемия имат зелено-жълта луминесценция). Корифосфин и акридин оранжево се използват за идентифициране на кисели мукополизахариди. Флуорохроми като кофеин 5 и родамин могат да се използват за определяне на гликоген. За определяне на липидите се използва фосфин 3P; за същата цел се използва разтвор на 3,4-бензпирен в наситен разтвор на кофеин (липидите имат синкаво-бяла луминесценция). Thioflavin T.S. оцветява амилоид (зелена луминесценция), така че се използва широко за диагностициране на амилоидоза на вътрешните органи. С разтвор на морин в алкохол се определя калций в тъканите (зелена луминесценция). При обработка на препарати с разтвор на солохромно черно е възможно да се открие алуминий (жълто-оранжева луминесценция). С помощта на родамин 6G се определя повърхностно активното вещество в белите дробове (оранжева луминесценция).

Използвайки метода на имунофлуоресценция, е възможно да се идентифицират хормони, антигени и антитела (цв. Фиг. 9), различни метаболитни продукти, да се идентифицират хистогенетично незрели тумори, различна информация. заболявания и др. Развитието на имунохимията допълнително разшири възможностите на този метод. Стана възможно да се определят непротеинови вещества в тъканите и клетките с помощта на изкуствени хаптени.

Библиография:Барски И. Я., Поляков Н. И. и Якубенас В. А. В. Контактна микроскопия, М., 1976, библиогр.; Ershov F.I. Луминесцентно микроскопско откриване на ранни промени в нуклеиновите киселини и липидите в заразените клетки, Vopr, virusol., .No 1, p. 3, 1964, библиогр.; 3еленин А.В. Взаимодействие на аминопроизводни на акридин с клетката, М., 1971, библиогр.; 3 при b-zhitsky Yu N. Метод на луминесцентна микроскопия, L., 1964, библиогр.; K a r-mysheva V.Ya. Приложение на метода на флуоресцентни антитела във вирусологията, М., 1979; M e y s e l M. N. Флуоресцентна микроскопия и цитохимия в общата микробиология, в книгата: Usp. микробиол., изд. А. А. Имшенецки, т. 7, стр. 3, М., 1971; Михайлов И. Ф. и Дяков С. И. Луминесцентна микроскопия, М., 1961, библиогр.; Струков А. И. и Кондратиев В. С. Луминесцентен микроскопски метод в патологичната практика, Арх. патол., т. 28, № 8, с. 77, 1966, библиогр.; Фридман И. А. и Кустаров Н. П. Луминесцентни цитологични изследвания в акушерската и гинекологичната практика, Л., 1974, библиогр.; Автоматизация в микробиологията и имунологията, изд. от C.-G. Hed£n a. T. Illeni, N. Y., 1975; Автоматизацията на цитологията на рака на матката, изд. от G. L. Wied a.o., Чикаго, 1976 г.; Със s-лице T. a.o. ДНК-свързващи флуорохроми за изследване на организацията на метафазното ядро, Exp. Cell Res., v. 58, стр. 141, 1969; Флуоресцентни техники в клетъчната биология, изд. от A. A. Thaer a. M. Sernetz, N.Y., 1973; Vaillier J. a. Vaillier D. Характеризиране на клетъчни субпопулации на тимуса чрез хидрофобна флуоресцентна сонда, l-анилино-8-нафтален сулфонат, Clin. експ. Immunol v. 30, стр. 283, 1977 г.

М. Я. Корн; В. А. Варшавски (пат. ан.), Я. Е. Хесин (вир.).

Абсорбцията и последващото повторно излъчване на светлина от органични и неорганични проби обикновено е резултат от общо физическо явление, наречено флуоресценция или фосфоресценция. Излъчването на светлина чрез флуоресценция се случва почти едновременно с поглъщането на вълнуваща светлина, поради относително краткото време на забавяне между поглъщането и излъчването на фотон, което обикновено не надвишава интервал от микросекунди. Когато има по-дълъг интервал между поглъщането и излъчването на светлина, това явление се нарича фосфоресценция.

Ориз. 1. Епи-флуоресцентен микроскоп

Флуоресценцията е описана за първи път през 1852 г. от британския учен Джордж Стоукс, който въвежда термина, докато провежда експерименти с флуорит (флуорит), който излъчва червена светлина, когато е облъчен с ултравиолетова светлина. Стокс забеляза, че дължината на вълната на флуоресцентното излъчване винаги е по-голяма от дължината на вълната на възбуждащата светлина. Ранните изследвания през 19 век показват, че много проби (включително минерали, кристали, смоли, медицински суровини, масла, хлорофил, витамини и неорганични съединения) флуоресцират, когато са облъчени с ултравиолетова светлина. Използването на флуорохроми в биологичните изследвания за оцветяване на тъканни компоненти, бактерии и други патогени обаче не започва до 30-те години на миналия век. Някои от тези багрила са изключително специфични и стимулират развитието на флуоресцентната микроскопия.

Поради няколко характеристики, които са трудни за постигане с традиционната оптична микроскопия с усилен контраст, флуоресцентната микроскопия се превърна във важен инструмент както в биологичните, така и в биомедицинските изследвания и науката за материалите. Използването на набори от флуорохроми направи възможно изолирането на силно специфични клетки и субмикроскопични клетъчни компоненти от нефлуоресцентни вещества. С флуоресцентен микроскоп всъщност могат да бъдат открити дори отделни молекули. Използвайки флуоресцентно многоцветно оцветяване, различни багрила могат да идентифицират множество целеви молекули едновременно. Въпреки че пространствената разделителна способност на флуоресцентния микроскоп е ограничена по-долу от границата на дифракция, която зависи от специфичните характеристики на пробата, откриването на флуоресцентни молекули под тази граница е напълно възможно.

Много проби показват автофлуоресценция при облъчване (без използването на флуорохроми) и това явление се използва широко в ботаниката, петрологията и производството на полупроводници. За разлика от това, изследването на тъкани на животни или патогени често се усложнява от изключително слаба или, обратно, силна неспецифична автофлуоресценция. Много по-важно в този случай е въвеждането в тъканите на флуорохроми (или флуорофори), възбудени на определена дължина на вълната и излъчващи светлина с необходимата интензивност. Флуорохромите са багрила, които независимо се прикрепят към видими или невидими структури, имат висока селективност към мишените и висок квантов добив (съотношението на броя на излъчените към броя на погълнатите фотони). Бързият растеж в използването на флуоресцентна микроскопия е тясно свързан с появата на нови синтетични и естествени флуорофори, които имат специфични профили на интензитет на възбуждане и излъчване и са „насочени“ към определени биологични цели.

Основи на процесите на възбуждане и излъчване

Принципът на действие на флуоресцентния микроскоп е облъчване на проба с дължини на вълните в необходимия и точно определен диапазон, последвано от отделяне на много по-слабо излъчвана флуоресценция от потока вълнуваща светлина. В добре настроен микроскоп само излъчената светлина трябва да достига до окото или приемащото устройство, така че наблюдаваните флуоресцентни структури да се наслагват върху висококонтрастен, много тъмен (или черен) фон. Тъмнината на фона обикновено определя границите на откриване, тъй като възбуждащата светлина обикновено е стотици хиляди или дори милиони пъти по-ярка от излъчваната флуоресценция.

Фигура 1 показва схематично напречно сечение на модерен епифлуоресцентен микроскоп, предназначен за наблюдения както в пропусната, така и в отразена светлина. Вертикалният осветител, разположен в центъра, има източник на светлина в единия край (обозначен на диаграмата като епископичен модул) и приставка за филтър в другия. Дизайнът се основава на микроскоп, който работи в отразена светлина, чиято дължина на вълната е по-голяма от дължината на вълната на възбуждане. За автор на вертикалния осветител за флуоресцентна микроскопия с отразена светлина се счита Johan S. Ploem. Многочестотната светлина от дъгова лампа или друг източник, преминавайки през селективен филтър за възбуждане, се преобразува във флуоресцентен вертикален осветител в светлина с определена дължина на вълната (или в даден вълнов интервал), обикновено от ултравиолетовата, синя или зелена част от спектъра. Потокът, преминал през филтъра за възбуждане, се отразява от повърхността на дихроматично (наричано също дихроично) огледало или разделител на лъчи и, преминавайки през обектива, осветява пробата с интензивна светлина. Ако пробата флуоресцира, излъчената светлина, събрана от обектива, отново преминава през дихроичното огледало и след това се филтрира от блокиращ (или емисионен) филтър, който блокира светлината при дължини на вълната на възбуждане. Важно е да се отбележи, че флуоресценцията е единственият режим в оптичната микроскопия, при който пробата излъчва собствена светлина след облъчване. Излъчената светлина се излъчва повторно сферично във всички посоки, независимо от местоположението на излъчващия източник на светлина.

Епифлуоресцентното осветяване е преобладаващият метод в съвременната микроскопия. Осветителят за вертикална отразена светлина е разположен между наблюдателните тръби и въртящата се глава на лещите. Осветителят е проектиран по такъв начин, че възбуждащата светлина по пътя към изображението и от пробата преминава през един и същ обектив на микроскопа, който в тази конфигурация първо действа като кондензатор, а по пътя на връщане събира излъчената флуоресцентна светлина. Запалките от този тип имат няколко предимства. Лещата на флуоресцентния микроскоп действа, първо, като добре настроен кондензатор и второ, като устройство за събиране на светлина, с което се формира изображение. Като един и същ компонент, лещата/кондензаторът винаги е идеално подравнен. По-голямата част от възбуждащата светлина, достигаща до пробата, преминава през нея без взаимодействие и не се връща в обектива, а осветената зона е ограничена до тази част от пробата, която се наблюдава през окулярите (в повечето случаи). Ако микроскопът е правилно конфигуриран за осветяване на Köller, тогава, за разлика от някои техники за подобряване на контраста, пълната цифрова апертура на лещата на обектива е достъпна за наблюдение. Освен това ви позволява да комбинирате режимите на наблюдение в пропусната и отразена светлина, режима за формиране на цифрово изображение или да изберете един от тях.

Ориз. 2. Флуоресцентни филтри

Както е показано на Фигура 1, в задния край на осветителя за вертикална отразена светлина има дъгова лампа (обикновено живачна или ксенонова). Разпространявайки се по протежение на осветителя перпендикулярно на оптичната ос на микроскопа, възбуждащата светлина преминава през събирателните лещи, диафрагмата с регулируема и центрирана апертура и след това през диафрагмата с регулируемо центрирано поле (вижте Фигура 1). След това светлината влиза във филтъра за възбуждане, където се избират дължини на вълните от необходимия интервал, а останалите дължини на вълните се блокират. След преминаване през филтъра за възбуждане, избраните дължини на вълната достигат дихроичното огледало за разделяне на лъча, което е специален филтър за смущения, който ефективно отразява светлината с къса дължина на вълната и ефективно предава светлината с дължина на вълната. Дихроичният разделител на лъчи е наклонен под ъгъл от 45 градуса по отношение на падащата възбуждаща светлина и я отразява под ъгъл от 90 градуса през лещата на оптичната система директно върху пробата. Флуоресценцията, излъчвана от осветената проба, се събира от лещата, която сега изпълнява обичайната си функция, а именно формиране на изображение. Тъй като излъчваните дължини на вълните са по-дълги от дължините на вълните на възбуждане, те преминават през дихроичното огледало нагоре към тръбите за наблюдение или електронния детектор.

По-голямата част от разпръснатата възбуждаща светлина, достигаща дихроичното огледало, се отразява обратно към източника на светлина, въпреки че малка част може да премине или да бъде абсорбирана от вътрешното покритие на огледалото. Но преди излъчената флуоресценция да достигне окуляра или детектора, тя трябва да премине през блокиращ или отхвърлящ филтър.Тези филтри блокират (блокират) всякаква остатъчна възбуждаща светлина, но позволяват по-дълги дължини на вълните на излъчената светлина да преминат. Повечето осветители за отразена светлина съчетават филтъра за възбуждане, дихроичното огледало и филтъра за спиране в оптична единица (често наричана куб), както е показано на Фигура 2. Съвременните флуоресцентни микроскопи могат да поберат четири до шест филтърни куба (обикновено във вид на въртележка или чекмедже приставка); вижте Фигура 1) и позволява на потребителя лесно да инсталира сменяеми възбуждащи филтри, блокиращи филтри и дихроични огледала.

Дизайнът на вертикалния осветител трябва да позволява на потребителя да настрои микроскопа за осветяване на Köller, което осигурява ярко и равномерно осветяване в цялото зрително поле. Коригираните събирателни лещи на оптичната система гарантират, че изображението на диафрагмата с центрирана апертура е подравнено със задната апертура на фокусиращата леща. В съвременните осветители изображението на предварително фокусирана диафрагма с центрирано поле е свързано с фокусираното изображение и равнината на фиксираната диафрагма на окуляра.

Лампата на осветителя обикновено съдържа стоп филтър, който блокира инфрачервената светлина. Самият модул на лампата не трябва да предава ултравиолетова радиация навън. Също така е желателно да има вграден прекъсвач, в случай че се отвори по време на работа. Лампата трябва да е достатъчно здрава, за да издържи възможната експлозия на дъговата лампа по време на работа. В модерните модули за лампи фасунгата на лампата е снабдена с копчета за регулиране, за да центрира изображението на дъговата лампа в задния отвор на лещата (при осветяване на Келер тези равнини са спрегнати). Препоръчително е да поставите затвор на пътя на светлината, обикновено близо до ламповия модул, но преди възбуждащия филтър, за да блокирате напълно възбуждащата светлина, освен ако пробата не се наблюдава. Освен това оборудването на осветителя трябва да включва филтри с неутрална плътност (на барабан, въртележка или прибиращ се тип приставка), за да може да се намали интензитета на вълнуващото осветление.

Стоксова смяна

Когато електроните преминават от възбудено към основно състояние, вибрационната енергия се губи. В резултат на тази загуба на енергия емисионният спектър на възбудения флуорофор обикновено се измества към по-дълги дължини на вълната в сравнение със спектъра на абсорбция или възбуждане (не забравяйте, че дължината на вълната е обратно пропорционална на неговата енергия). Това добре известно явление се нарича правило на Стокс или изместване на Стокс. Тъй като отместването на Стокс се увеличава, става по-лесно да се разделят възбуждащата и емисионната светлина с помощта на комбинации от флуоресцентни филтри.

Пиковият интензитет на излъчване на флуорофор обикновено е по-нисък от пиковия интензитет на неговата абсорбция и се появява при по-голяма дължина на вълната. Емисионната крива (спектрална крива) често е огледален образ (или близък до нея) на кривата на възбуждане, но изместена към по-дълги дължини на вълната, както е показано на фигура 3, която показва полезните спектрални характеристики на багрилото Alexa Fluor 555, което абсорбира в жълто-зелената и излъчва в жълто-оранжевата област. За да се постигне максимален интензитет на флуоресценция, флуорофорът (често наричан багрило) се възбужда при дължини на вълните, близки до или близо до пика на кривата на възбуждане, и излъчената светлина се открива в най-широкия възможен диапазон, който включва пика на емисиите. Изборът на вълнуващи и излъчвани дължини на вълните се извършва с помощта на интерферентни филтри (Фигура 2). Освен това трябва да се отбележи, че спектралните характеристики на оптичната система на микроскопа зависят и от пропускливостта на стъклото (която се влияе от антирефлексните покрития), броя на лещите и огледалата и чувствителността на детекторите.

Ориз. 3. Криви на абсорбция и излъчване на флуорофор

Ефективността на разделянето и записването на дължини на вълните на възбуждане и излъчване се постига във флуоресцентната микроскопия чрез правилния избор на светлинни филтри, които блокират или, обратно, пропускат светлина с определени дължини на вълната в ултравиолетовите, видимите и близките инфрачервени области на спектъра. Възбуждащата светлина се контролира във вертикални флуоресцентни осветители поради факта, че техният дизайн предвижда използването на лесно сменяеми филтри (неутрални и интерферентни възбуждащи филтри), вмъкнати по протежение на пътя на светлината към пробата и по пътя на връщане между пробата и епруветките за наблюдение или система за приемане на сигнал. Поради ниския интензитет на флуоресцентно излъчване (както беше обсъдено по-горе), е необходимо източникът на възбуждаща светлина да има достатъчна яркост, за да увеличи максимално слабата излъчвана светлина и флуорохромите да имат подходящи характеристики на абсорбция и квантова ефективност. Това е може би ключовият критерий за флуоресцентна микроскопия.

Ефективността, с която отделен флуорофор абсорбира фотон от възбуждаща светлина, е функция на ефективното молекулярно напречно сечение и вероятността за възникване на такова събитие се нарича коефициент на поглъщане. По-големите стойности на коефициента на поглъщане показват, че поглъщането на фотон (или квант) в даден интервал от дължина на вълната е по-вероятно. Квантовият добив е отношението на броя на излъчените към броя на погълнатите кванти (обикновено е в диапазона от 0,1 до 1,0). Фактът, че квантовият добив приема стойности, по-малки от 1, е следствие от загуба на енергия по нерадиационен начин, например чрез топлина или фотохимична реакция, когато не настъпва повторно излъчване, което води до флуоресценция. Коефициентът на поглъщане, квантовият добив, средният интензитет на светлината и времето на експозиция са важни фактори, влияещи върху интензитета на флуоресценция и определящи осъществимостта на използването на този метод.

Избледняване, избледняване и фотоизбелване

Редица условия могат да повлияят на вероятността от повторно излъчване на флуоресценция, което често води до спад в интензитета на флуоресценцията. Общият термин за намаляване на интензитета на флуоресцентната емисия е затихване, обхващащ всички явления, които за по-подробно описание могат да бъдат разделени на явления загасване и фотоизбелване. Фотоизбелването е необратимо разпадане на флуоресцентни молекули във възбудено състояние, причинено от взаимодействието им с молекулярен кислород преди емисия. Това явление се използва в метода за възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелване (FRAP), който е много ефективен при изследване на свойствата на дифузия и движението на биологични макромолекули. Методът се основава на фотоизбелване с лазерен лъч на ясно дефинирана зона в пробата, последвано от наблюдение на скоростта и характера на възстановяване на флуоресценцията във фотоизбелената зона. Свързана техника, затихване на флуоресценцията в избелени изображения (FLIP), се използва за изследване на намаляването на флуоресценцията в региони, съседни на фотоизбелената област. Подобно на FRAP, този метод е ефективен инструмент за изследване на молекулярната мобилност и динамика в живите клетки.

Ориз. 4. Скорост на фотоизбелване на многоцветни проби

Фигура 4 показва типичен пример за фотоизбелване, наблюдавано в поредица от дигитални изображения на многоцветна култура от фибробласти на кожата на индийски muntjac, взети в различни времеви точки. Ядрата бяха оцветени с бис-бензимидазолово производно (Hoechst 33258, синя флуоресценция), а митохондриите и актиновият цитоскелет бяха оцветени съответно с MitoTracker Red CMXRos (червена флуоресценция) и производно на фалоидин, свързано с Alexa Fluor 488 (зелена флуоресценция). Изображенията се правят на всеки две минути и комбинацията от флуоресцентни филтри се регулира така, че и трите флуорофора да се възбуждат едновременно, като същевременно записват комбинираните излъчени сигнали. Фигура 4(a) показва, че интензитетът и на трите флуорофора е сравнително висок, но интензитетът на Hoechst (синьо) започва да пада бързо само след две минути и почти напълно изчезва след 6–8 минути. Митохондриалните и актиновите багрила изглеждат по-устойчиви на фотоизбелване, но тяхната интензивност също намалява значително по време на периода на наблюдение (10 минути).

Отпускането от възбудено състояние чрез гасене, което води до спад в интензитета на флуоресценцията, се случва по различни нерадиационни начини и често се дължи на окислители или наличието на соли, тежки метали и халогенни съединения. В някои случаи охлаждането възниква в резултат на прехвърляне на енергия към друга молекула (наречена акцептор), която е близо до възбудения флуорофор (донор). Това явление се нарича флуоресцентен резонансен трансфер на енергия (FRET). Именно този механизъм се превърна в основата на ефективен метод за изследване на молекулярните взаимодействия и асоциации на разстояния, значително по-малки от разделителната способност на оптичните микроскопи.

Флуоресцентни източници на светлина

Нещастна последица от ниския интензитет на излъчване в повечето приложения на флуоресцентна микроскопия е малкият брой фотони, достигащи до окуляра или приемника. В повечето случаи ефективността на събиране на фотони в оптичните микроскопи е по-малка от 30 процента, а концентрациите на много флуорофори по оптичния път варират от микромоларни до наномоларни концентрации. За да се гарантира, че интензитетът на възбуждащата светлина е достатъчен за откриване на флуоресценция, са необходими мощни компактни източници на светлина, като малки високоенергийни дъгови лампи. Най-често срещаните са живачни лампи с мощност от 50 до 200 вата и ксенонови лампи с мощност от 75 до 150 вата (виж фигура 5). Тези лампи обикновено се захранват от външен източник на постоянен ток, достатъчен да запали дъгата чрез йонизация на парите под високо налягане и да поддържа горенето й с минимално трептене.

Външното захранване на дъговата лампа на микроскопа обикновено е оборудвано с таймер за проследяване на броя на отработените часове. Дъговите лампи губят светлинна мощност и често се развалят, когато се използват след изтичане на техния срок на експлоатация (200–300 часа). Живачните лампи не осигуряват еднакъв интензитет в целия спектрален диапазон от UV до IR. Максималната им интензивност се проявява в близката ултравиолетова. Явни пикове на интензитет се появяват при 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578 нанометра. При други дължини на вълните във видимия спектър интензитетът е стабилен, макар и не толкова висок (но все пак достатъчен за повечето приложения). Но мощността на лампата сама по себе си не е определящ параметър за ефективността на осветлението. Обратно, основен параметър, който първо трябва да се вземе предвид, е средната осветеност, като се вземат предвид яркостта на източника, геометрията на дъгата и ъгловото разпределение на радиацията.

Ориз. 5. Дъгови луминесцентни лампи

През последните няколко години оптичната микроскопия претърпя подем в използването на лазерни светлинни източници, особено аргон-йонни и аргон-криптон (йонни) лазери. Предимствата на тези лазери са техният малък размер, ниска дивергенция на лъча, висока степен на монохроматичност и висока средна светимост. Те се използват широко в сканиращата конфокална микроскопия, която се превърна в мощен инструмент за създаване на висококонтрастни флуоресцентни изображения чрез елиминиране на нефокусирана светлина, идваща от фокалната равнина на пробата. В конфокалните микроскопи това се постига чрез сканиране на пробата с фокусна точка или линия, като едновременно с това се формира изображение през конюгирана бленда. Оптичните срезове на пробите могат да бъдат съхранени в паметта на компютъра на микроскопа и реконструирани в крайно изображение, показано на монитор.

Филтърни символи

Общата терминология, приета за обозначаване на комбинации от филтри във флуоресцентната микроскопия, стана доста объркваща поради различните съкращения и кодове, използвани от различните производители за етикетиране на техните филтри. По принцип има три основни категории филтри: филтри за възбуждане (често наричани просто възбудители), блокиращи (емисионни) филтри и дихроични разделители на лъчи (или дихроични огледала). Преди това флуоресцентните филтри се състоеха единствено от цветно стъкло или желатин, поставени между две стъклени плочи. Днес обаче има тенденция да се произвеждат високочувствителни филтри с интерферентна оптика за предаване или забавяне на светлина със строго определени дължини на вълната, която също има висока пропускливост. Дихроичните разделители на лъчи са специални филтри за смущения, предназначени да отразяват или предават светлина със специфични дължини на вълната, когато са поставени под ъгъл от 45 градуса по протежение на светлинния път (вижте фигури 1 и 2). Блокиращите филтри са направени или от цветно стъкло, или от интерферентни покрития (или комбинация от двете).

Производителите използват различни съкращения, за да обозначат характеристиките на филтрите за възбуждане. Ултравиолетовото стъкло например се обозначава с UG, а синьото е BG. На теснолентовите филтри често можете да намерите обозначението KP (K от немския "kurz", което се превежда като "късо") или просто SP. Филтрите за смущения вече се етикетират от някои производители със съкращението IF. Теснолентовите филтри за възбуждане на смущения са особено ефективни при ниски Стоксови смени.

Съкращенията и абревиатурите за блокиращи филтри са както следва: LP или L за широколентови филтри, Y или GG за жълто (от немското "gelb" - жълто) стъкло, R или RG за червено стъкло, OG или O за оранжево стъкло, K за слот филтри (от немското “kante” - ръб), и BA за блокиращи филтри. Ако филтърът е етикетиран с число, като BA515, това показва дължината на вълната (в нанометри), при която той има половината от максималната си пропускливост.

Дихроичните разделители на лъчи също са обозначени с различни съкращения: CBS означава хроматичен разделител на лъчи, DM означава дихроично огледало, TK означава разделител на слот (от немското „teiler kante“), FT означава разделител на цветовете (от немското „farb teiler“ "), а RKP означава теснолентов рефлектор. Всички тези обозначения са взаимозаменяеми; в допълнение, оптичното стъкло на всички съвременни дихроични разделители на лъчи винаги е покрито с интерферентни покрития (вместо органични или метални багрила). Тези тънки интерферентни филми имат висок коефициент на отражение на къси вълни и висок коефициент на пропускане на дълги вълни.Дихроичните разделители на лъчи са наклонени под ъгъл от 45 градуса спрямо възбуждащата светлина, падаща върху оптичния модул през отразената светлина флуоресцентен осветител.Тяхната основна функция е да пренасочват определени (по-къси) възбуждащи вълни към обектива и към пробата зад него.Тези специални филтри имат допълнителната функция за предаване на по-дълги флуоресцентни вълни към блокиращия филтър и при отразяване на разсеяната възбуждаща светлина обратно към ламповия модул.

Ориз. 6. Nikon B-2E средночестотен син възбуждащ филтър

Фигура 6 показва криви на пропускане за комбинация от типични флуоресцентни филтри, използвани в съвременните микроскопи. Спектърът на възбуждащия филтър (червена крива) показва висока пропускливост (приблизително 75 процента) в диапазона от 450 до 490 нанометра с централна дължина на вълната (CWL) от 470 нанометра. Дихроичното огледало (жълта крива) отразява вълни в спектралния диапазон на филтъра за възбуждане, но пропуска с относително висок коефициент по-къси и по-дълги вълни. Трябва да се отбележи, че нулевото предаване на дихроично огледало съответства на 100 процента отражение. Ясният спад в кривата на пропускливост между 450 и 500 нанометра, който съответства на пика на отражението, служи за пренасочване на вълните от 90-градусовата лента на пропускане на филтъра за възбуждане към пробата. Последната връзка в тази последователност е емисионният или блокиращ филтър (бяла крива), който пропуска вълни в зелената част на видимия спектър в диапазона от 520 до 560 нанометра. За да се осигури почти пълно разделяне на отразените и предаваните вълни, границите на лентите на отражение и предаване на различните насложени спектри трябва да бъдат възможно най-стръмни. Синусоидалната част от спектърната крива на дихроичното огледало, наречена звънене, е резултат от процеса на отлагане на тънък слой. Високата ефективност на тази филтърна комбинация е пример за значителен напредък в технологията на филтъра за смущения с тънко покритие.

Конвенциите за именуване на Nikon се основават на смесени термини, появили се в началото на 90-те години. По това време всички допълнителни комбинации от филтри на Nikon бяха произведени чрез метода на твърдо покритие, но днес много филтри се произвеждат чрез усъвършенствани методи за меко покритие. Въпреки че меките покрития са по-чувствителни към влажност и топлина и изискват по-внимателно боравене (в сравнение с твърдите покрития), те показват по-висока оптична плътност и осигуряват по-голяма лекота при фина настройка на специфични честотни ленти. Разбирането на конвенциите на комбинациите от филтри на Nikon ви позволява бързо да изберете необходимите филтри за конкретни флуорофори.

Първата буква в буквено-цифровата нотационна система на Nikon показва областта на спектъра на възбуждане (например UV, V, B и G са съкращения на английските думи "ultraviolet" - ултравиолетово, "violet" - виолетово, "синьо" и “ зелено” - съответно зелено). Числото след кодирането на спектъра на възбуждане показва честотната лента на филтъра за възбуждане: 1 съответства на теснолентово възбуждане, 2 на среднолентово възбуждане и 3 на широколентово възбуждане. И накрая, една или повече букви след числото, съответстващо на честотната лента на възбуждане, показват характеристиките на блокиращия филтър. Буквата A показва стандартния широколентов прекъсващ филтър с най-ниска дължина на вълната на прекъсване, B показва широколентов филтър с по-висока дължина на вълната на прекъсване. Обозначението E (от английски "enhanced" - подобрено) в лентовите емисионни филтри показва подобрена производителност в смисъл на намаляване на взаимодействието на смущенията на разделените сигнали. Обозначението E/C показва комбинация от меки интерферентни покрития, проектирани специално за работа със специфични багрила като DAPI, FITC, TRITC и Texas Red.

Баланс на луминисцентна светлина

Оценяването на светлинните потоци на типичен флуоресцентен микроскоп дава обща представа за ограниченията, които неизбежно ще възникнат при генериране на цифрови изображения или визуално наблюдение на проби. Източникът на облъчване за нашата оценка ще бъде стандартна 75-ватова ксенонова дъгова лампа, която има средна плътност на светлинния поток от приблизително 400 кандела на квадратен милиметър (други източници са представени в таблица 1). Когато излъчената светлина е насочена към 490-нанометров филтър за смущения (с 10-нанометрова честотна лента и 75 процента пропускливост), около 2 миливата мощност на лампата ще преминат през него. След отражение от дихроично огледало с коефициент 0,9, светлинен поток от 1,8 миливата се насочва към задната апертура на обектива на микроскопа като възбуждащ лъч.

За 100x обектив с числова апертура 1,4, осветената площ на пробата ще бъде 12 × 10 E(-6) квадратни сантиметра, ако се приеме, че диаметърът на зрителното поле е приблизително 40 микрометра. Тогава светлинният поток, падащ върху пробата, ще бъде около 150 вата на квадратен сантиметър, което съответства на плътност на потока от 3,6 × 10 E (20) фотони на квадратен сантиметър. По този начин интензитетът на осветяване на пробата е приблизително 1000 пъти по-голям от интензитета на осветяване на земната повърхност в нормален слънчев ден.

Флуоресцентната емисия при такъв светлинен поток зависи от абсорбционните и емисионните свойства на флуорофора, неговата концентрация в пробата и дължината на оптичния път на пробата. Математически произведената флуоресценция (F) се описва с уравнението:

F = σ Q I

Където σ е напречното сечение на молекулярно поглъщане, Q е квантовият добив, а I е падащият светлинен поток, изчислен по-горе. Ако приемем, че флуоресцеинът е флуорофор с напречно сечение на абсорбция (σ) от 3 × 10 E(-16) квадратни сантиметра, получаваме Q от 0,99, което води до флуоресценция F от 100 000 фотона в секунда на молекула. При концентрация на багрило от 1 микромол на литър, равномерно разпределено в диск с диаметър 40 микрометра и дебелина 10 микрометра (обем, равен на 12 пиколитра), това води до приблизително 1,2 x 10 E(-17) мола багрило, или 7,2 милиона молекули в оптичния път. Ако всички молекули се възбудят едновременно, скоростта на флуоресценция ще бъде 7,2 x 10 E(11) фотони в секунда (което е произведение на F и броя на молекулите на багрилото). Възниква въпросът: колко излъчени фотони ще бъдат записани и колко дълго може да продължи тази скорост на излъчване?

Таблица 1. Плътност на светлинната енергия на различни източници на светлина

Ефективността на откриването на фотони се определя от ефективността на тяхното събиране и квантовия добив на детектора. Обектив с цифрова апертура от 1,4 и 100 процента пропускливост (което е нереалистично условие) има максимална ефективност на събиране на фотони, ограничена до ъгъл на приемане от около 30 процента. Коефициентът на пропускане на дихроичното огледало е 85 процента, а на блокиращия филтър е 80 процента. Получената ефективност на събиране в този случай е 20 процента, или 140 милиарда фотона в секунда. Ако традиционно устройство със свързан заряд (CCD) се използва като детектор, неговият квантов добив при дължина на вълната на зеления флуоресцеин (525 нанометра) ще бъде 50 процента. Така ще бъдат открити 70 милиарда фотона в секунда или около 10 процента от тези, излъчвани от флуоресценцията. Дори един идеален детектор (със 100 процента квантова ефективност) може да улови само около 20 процента от флуоресцентните фотони.

Продължителността на флуоресцентното сияние зависи от скоростта на разрушаване на флуорофорите, което е следствие от фотоизбелването. Измерванията показват, че всяка молекула флуоресцеин в кислородсъдържащ физиологичен разтвор успява да излъчи около 36 000 фотона, преди да бъде унищожена. В безкислородна среда скоростта на фоторазрушаване намалява приблизително десет пъти. По този начин една флуоресцеинова молекула може да произведе 360 000 фотона. Взети заедно, всички багрила в нашия пример (7,2 милиона молекули) са способни да излъчват минимум 2,6 x 10 E(11) и максимум 2,6 x 10 E(12) фотони. При скорост на излъчване от една молекула от 100 000 фотона в секунда (според горните оценки), получаваме продължителността на флуоресцентното излъчване преди фотодеструкцията, равна на 0,3 до 3 секунди. Ако 10 процента от излъчените фотони бъдат открити, сигналът на детектора ще бъде 7,2 × 10 E(10) електрона в секунда.

По този начин, ако CCD има 1000x1000 пикселна камера, този сигнал ще бъде разпределен между един милион фоточувствителни елемента, тоест приблизително 72 000 електрона за всеки от тях. За изследователски CCD с 9 микрометрови фоточувствителни елементи капацитетът на заряда е около 80 000 електрона, а шумът при отчитане е по-малък от 10 електрона. В този случай съотношението сигнал/шум ще се определя главно от флуктуационен шум на фотон, равен на корен квадратен от сигнала, тоест около 268. В почти всички случаи такова високо ниво на сигнала може да продължи само за кратко време преди настъпване на фоторазрушаването. За да удължат времето за наблюдение, повечето микроскописти намаляват интензитета на облъчващия поток, така че само част от общия брой флуорофорни молекули се възбужда и следователно унищожава. По този начин съотношението сигнал/шум рядко достига теоретичния максимум и обикновено е в диапазона от 10 до 20 при флуоресцентна микроскопия.

Откриване на единична молекула

При идеални условия често е възможно да се открие флуоресцентното излъчване на една молекула, при условие, разбира се, че оптичният фон и шумът на детектора са достатъчно ниски. Както бе споменато по-горе, една молекула флуоресцеин може да излъчи до 300 000 фотона, преди да бъде унищожена чрез фотоизбелване. При 20% ефективност на събиране и откриване ще бъдат открити приблизително 60 000 фотона. Използвайки CCD, базирани на лавинни фотодиоди или умножение на електрони за експерименти от този вид, изследователите успяха да наблюдават поведението на отделните молекули за период от секунди и дори минути. Основният проблем в такива случаи е потискането на оптичния фонов шум. Тъй като много материали, използвани в конструкцията на микроскопични лещи и филтри, показват известна степен на автофлуоресценция, първоначалните усилия бяха насочени към производството на компоненти с ниска флуоресценция. Скоро обаче стана ясно, че чрез използване на пълно вътрешно отражение (TIR) във флуоресцентна микроскопия може да се постигне необходимата комбинация от нисък фон и възбуждаща светлина с висок интензитет.

Ориз. 7. Конфигурации на инвертирани и TIRF микроскопи

Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRFM или TIRFM в нейния английски акроним) използва феномена на неразпространяваща се или бързо затихваща вълна, която възниква по време на пълно вътрешно отражение на границата на две среди с различни индекси на пречупване.

Верига, използваща външен източник на светлина, е показана на фигура 7(a). При този метод светлинен лъч (обикновено разширен лазерен лъч) преминава през призма с висок индекс на пречупване (като стъкло или сапфир), съседна или на стъклото, или на воден разтвор с по-нисък индекс на пречупване. Ако светлината е насочена към призма под ъгъл, по-голям от критичния, лъчът ще бъде напълно отразен от интерфейса. Феноменът на отражението причинява неразпространяваща се вълна на интерфейса, а именно генерира се електромагнитно поле, което прониква в среда с по-нисък индекс на пречупване на разстояние не повече от 200 нанометра. Интензитетът на светлината в затихващата вълна е достатъчен, за да възбуди флуорофорите, но поради изключително малката дълбочина количеството на възбуждане е много малко. Резултатът от това е ниско ниво на фона, тъй като обемът на пробата, изложена на облъчване, е незначителен (само тази част от нея, която е в рамките на 200 nm от повърхността).

Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение може също да се реализира с помощта на модифицирана техника на епи-осветяване, използвана в микроскопията с широко поле (както е показано на Фигура 7(b)). Този метод изисква много високи NA обективи (поне 1,4, но за предпочитане 1,45 до 1,6) и частично осветено поле на микроскопа, което се постига чрез използване на малко петно или, за по-голяма равномерност на осветяването, тънък пръстен, който блокира част от светлината поток. За да се постигне критичният ъгъл, отвъд който възниква пълно вътрешно отражение, е необходимо средата за потапяне в лещите и покривното стъкло на микроскопа да имат висок коефициент на пречупване. Както е показано на Фигура 7(b), светлинните лъчи, напускащи предната леща под ъгъл, по-малък от критичния (на фигурата е обозначен с A(1)), не се връщат към микроскопа. Когато критичният ъгъл бъде достигнат или превишен (ъгъл A(2) на фигура 7(b)), настъпва пълно вътрешно отражение.

За да се предостави допълнителна информация в изследванията, пълното вътрешно отражение често се комбинира с други популярни усъвършенствани флуоресцентни техники като флуоресцентен резонансен пренос на енергия (FRET), възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелване (FRAP) и спектроскопия. В комбинация тези методи са мощни инструменти за изследване на отделни флуорофори и флуоресцентно оцветени молекули. Ползите от изучаването на единични молекули едва сега започват да се осъзнават. По този начин днес обхватът на оптичните микроскопски изследвания е от отделни молекули до цели животни.

Заключение

Съвременните флуоресцентни микроскопи съчетават силата на висококачествени оптични компоненти с компютъризирано управление и цифрово изображение, за да постигнат ниво на усъвършенстване, което далеч надхвърля обикновеното визуално наблюдение. Днес микроскопията разчита в голяма степен на електронни техники за изобразяване за бързо получаване на информация при ниски нива на светлинни сигнали или при визуално неоткриваеми дължини на вълните. Тези технически подобрения не са просто елементи на външния дизайн, а съществени компоненти на оптичния микроскоп като сложна измервателна система.

Времето, когато оптичната микроскопия беше чисто описателна дисциплина или интелектуална играчка, отмина. Днес оптичните изображения са само първата стъпка в анализа на данни. Тази първа стъпка се извършва от микроскоп във връзка с електронни детектори, процесори за обработка на изображения, дисплеи, които могат да се считат за разширение на системата за изображения. Компютъризираният контрол на фокусирането, позицията на сцената, оптичните компоненти, затворите, филтрите и детекторите, които вече са широко използвани, позволява такива манипулации по време на експерименти, които са просто невъзможни за хората, когато работят върху механични микроскопи. Нарастващото използване на оптоелектроника във флуоресцентната микроскопия доведе до разработването на оптични пинсети за манипулиране на субклетъчни структури и частици, наблюдение на отделни молекули и широка гама от сложни спектроскопски приложения.

Флуоресцентни филтърни комбинации

Комбинации от епи-флуоресцентни интерферентни и абсорбционни филтри се поставят във филтърни кубове (или оптични модули) и включват филтър за възбуждане, разделител на дихроичен лъч (често наричан огледало) и блокиращ (или емисионен) филтър, както е показано на фигура 1 (а). Това ръководство може да бъде полезно при избора на комбинации от филтри, които отговарят на спектралните характеристики на абсорбцията и емисиите на хромофорите, използвани в широкополовата флуоресцентна микроскопия. Спектралните криви на типична комбинация от високоефективни лентови филтри в синия диапазон на възбуждане са показани на фигура 1(b). Комбинациите от флуоресцентни филтри на Nikon се предлагат с теснолентови, среднолентови и широколентови възбуждащи филтри и съответните им специфични или широколентови емисионни филтри.

Ориз. 8. Спектрални криви на блок от флуоресцентни светлинни филтри

Ултравиолетово възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри за UV възбуждане на Nikon включва четири внимателно балансирани комбинации, които включват конвенционални лентови или широколентови емисионни (блокиращи) филтри, които могат селективно да предават флуоресцентни емисии в тесен или широк диапазон на синята, зелената и червената част на видимия спектър. Тези комбинации от филтри покриват обхвата на възбуждане от 330 до 380 нанометра с честотни ленти от 10, 40 и 50 нанометра. Три комбинации използват едно и също дихроично огледало, а четвъртата има по-ниска гранична дължина на вълната, за да съответства на тясната лента на възбуждане. Комбинациите от UV филтри включват емисионни филтри с фиксирана или широка честотна лента.

Виолетово възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри с виолетово възбуждане на Nikon включва три комбинации, които включват конвенционални лентови или широколентови емисионни (блокиращи) филтри, които могат селективно да предават флуоресцентни емисии в тесен или широк диапазон от сини, зелени и червени области на спектъра. Тези комбинации от филтри покриват обхвата на възбуждане от 379 до 420 нанометра с честотни ленти от 10, 22 и 40 нанометра. Две комбинации използват едно и също дихроично огледало, а третата има по-ниска гранична дължина на вълната, за да съответства на лентата на възбуждане при по-къси дължини на вълната.

Синьо-виолетово възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри за синьо-виолетово възбуждане на Nikon включва четири комбинации, които включват конвенционални лентови или широколентови емисионни (блокиращи) филтри, които могат селективно да предават флуоресцентни емисии в тесен или широк диапазон от сини, зелени и червени области на видимата светлина спектър . Тези допълнителни комплекти филтри покриват обхвата на възбуждане от 400 до 446 нанометра с честотни ленти от 10, 20 и 40 нанометра. Три комбинации използват едно и също дихроично огледало, докато четвъртата има по-висока гранична дължина на вълната (с 5 нанометра), за да съответства на другите компоненти.

Синьо възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри със синьо възбуждане на Nikon се състои от шест балансирани комбинации, които включват конвенционални лентови или широколентови емисионни (блокиращи) филтри, които могат селективно да предават флуоресцентни емисии в тесен или широк диапазон на зелената, жълтата, червената и инфрачервената област на спектъра. . Тези комбинации от филтри покриват обхвата на възбуждане от 420 до 495 нанометра с честотни ленти от 20, 30, 40 и 70 нанометра. Пет комбинации използват едно и също дихроично огледало, а шестата има по-ниска гранична дължина на вълната, за да увеличи получения сигнал. Всички лентови филтри за комплекти за филтриране на синьо възбуждане на Nikon имат спектрална ширина от 40 нанометра. Един от филтрите (B-3A) е предназначен за използване с осветление с волфрамова халогенна лампа.

Зелено възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри със зелено възбуждане на Nikon се състои от шест блока, които включват конвенционални лентови или широколентови емисионни (блокиращи) филтри, способни селективно да предават флуоресцентни емисии в тесен или широк диапазон от жълти, оранжеви, червени и близки до инфрачервените области на спектър. Тези комбинации от филтри покриват обхват на възбуждане от 510 до 560 нанометра с честотни ленти от 10, 25, 30 и 50 нанометра (включително тесни, средни и широки ленти на възбуждане). Три комбинации използват едно и също дихроично огледало (565 нанометра), а другите три имат по-голяма дължина на вълната на прекъсване (570 и 575 нанометра). Два от шестте комплекта зелени възбуждащи филтри на Nikon включват 60- и 75-нанометрови лентови филтри.

Жълто възбуждане – Комплектът флуоресцентни филтри с жълто възбуждане на Nikon се състои от две балансирани комбинации, които включват емисионни (блокиращи) филтри с една специфична лента на пропускане, способни да предават селективно флуоресцентни емисии в оранжевата и червената област на спектъра. Тези допълнителни комбинации от филтри покриват обхвата на възбуждане от 532 до 587 нанометра с честотни ленти от 40 и 55 нанометра. И двете комбинации включват едно и също дихроично огледало (с граница при 595 нанометра). Двата жълти комплекта за филтриране на възбуждане на Nikon включват 60- и 75-нанометрови лентови филтри.

Червено възбуждане – комбинацията от флуоресцентни филтри с червено възбуждане на Nikon е представена от единична единица, която включва лентов емисионен (блокиращ) филтър, способен селективно да предава флуоресцентни емисии в далечните червени и близките инфрачервени области на спектъра. Центърът на лентата на пропускане на блокиращия филтър е 700 нанометра, а ширината му е 75 нанометра (от 663 до 738 нанометра). Широката лента на възбуждане от 60 nm от 590 до 650 nm обхваща оранжеви и червени дължини на вълните. Комбинацията Cy5 HYQ включва дихроично огледало с граница при 660 нанометра, което е с 10 нанометра по-високо от границата на лентата на възбуждане.

Възбуждане на жълт флуоресцентен протеин (YFP) – За YFP Nikon разработи една висококачествена, балансирана комбинация, която подобрява възможностите за откриване на флуоресцентен протеин (осигурени от три филтърни комплекта за зелен флуоресцентен протеин (GFP)) чрез използване на филтри за GFP варианти с по-дълга дължина на вълната ( YFP и EYFP). Филтърната банка YFP HYQ включва филтри за възбуждане и излъчване (стоп) с относително тесни ленти на пропускане, проектирани специално да съответстват на спектралните характеристики на YFP-усиления жълт флуоресцентен протеин (YFP), позволявайки флуоресценцията от YFP производни да бъде оценена отделно от други флуоресцентни протеини.

Двулентово възбуждане - Комплектът двулентови флуоресцентни филтри на Nikon се състои от три внимателно балансирани комбинации от двулентови филтри (възбуждащи и емисионни (отрязващи) филтри), комбинирани в един модул, който селективно предава флуоресцентно излъчване от два флуорофора едновременно. Всяка от филтриращите единици е оптимално комбинирана със специфична флуорохромна двойка, въпреки че може да работи ефективно и с други двойки флуоресцентни багрила, които имат същите спектрални абсорбционни и емисионни профили. Благодарение на прецизното съвпадение на честотните ленти, със стръмни преходи от лента към лента между областите на отражение и предаване, различните сигнали за възбуждане и излъчване се разделят с минимално припокриване на смущения.

Трилентово възбуждане - Трилентовите флуоресцентни филтри на Nikon са представени от два балансирани блока, включително трилентови филтри (възбуждащи и емисионни (блокиращи) филтри), селективно предаващи флуоресцентна емисия от три флуорофора едновременно. Всяка от филтриращите единици е оптимално комбинирана със специфичен набор от три флуорохрома, въпреки че може да работи ефективно и с други комбинации от багрила, които имат същите спектрални абсорбционни и емисионни профили. Благодарение на прецизното съвпадение на лентите, със стръмни междулентови преходи между областите на отражение и предаване, различните възбуждащи и емисионни сигнали се разделят с минимална интерференция между тях. Тройни кубчета.

HYQ Cubes – комбинациите от HYQ флуоресцентни филтри на Nikon включват четири внимателно балансирани, висококачествени блока, всеки от които включва лентови емисионни (блокиращи) филтри за селективно предаване на флуоресценция в ограничен диапазон. Всяко обозначение на HYQ филтър отразява името на флуорохрома, за който е проектиран, но в рамките на своите диапазони на възбуждане всяка комбинация може да се използва за наблюдение на различни флуорохроми със съответните характеристики.

Основен списък на флуоресцентни филтърни модули на Nikon

Първата буква в буквено-цифровата нотационна система на Nikon показва областта на спектъра на възбуждане (например UV, V, B и G са съкращения на английските думи "ultraviolet" - ултравиолетов, "violet" - виолетов, "blue" - син , и „зелено“ - съответно зелено). Числото след кодирането на спектъра на възбуждане показва честотната лента на филтъра за възбуждане: 1 съответства на теснолентово възбуждане, 2 на среднолентово възбуждане и 3 на широколентово възбуждане. И накрая, една или повече букви след числото, съответстващо на честотната лента на възбуждане, показват характеристиките на блокиращия филтър. Буквата A показва стандартен широколентов блокиращ филтър с най-ниска дължина на вълната на прекъсване, B показва филтър за широколентови емисии с по-висока дължина на вълната на прекъсване. Обозначението E (от английски "enhanced" - подобрено) в лентовите емисионни филтри показва подобрена производителност в смисъл на намаляване на взаимодействието на смущенията на разделените сигнали. Обозначението E/C показва комбинация от меки интерферентни покрития, проектирани специално за работа със специфични багрила като DAPI, FITC, TRITC и Texas Red.

Ориз. 1. Епи-флуоресцентен микроскоп