Imunoblotingas -(iš anglų kalbos „blot“ - spot) - antigenų (arba antikūnų) nustatymo metodas naudojant žinomus serumus (arba antigenus). Tai gelio elektroforezės ir ELISA derinys. Iš pradžių bakterijų ląstelės ar virionai sunaikinami ultragarsu, o vėliau visi viruso ar bakterijų ląstelių antigenai yra atskiriami elektroforezės būdu ir ant specialios nitroceliuliozės plėvelės gaunamas komercinis reagentas. Atliekant imunoblotavimą, tiriamas paciento serumas uždedamas ant plėvelės su žinomais antigenais. Po inkubacijos ir neprisijungusių antikūnų plovimo pereikite prie ELISA – ant plėvelės užtepamas antiserumas prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintus fermentu, ir chromogeniniu substratu, kuris keičia spalvą sąveikaudamas su fermentu. Esant antigenui-antikūnui-antiserumui prieš imunoglobulino-fermento kompleksus, ant nešiklio atsiranda spalvotų dėmių. Imunoblotavimo metodas leidžia atskirai aptikti antikūnus prieš įvairius patogenų antigenus (pavyzdžiui, sergant ŽIV infekcija, imunoblotavimas aptinka antikūnus prieš gp120, gp24 ir kitus viruso antigenus).

Radioimuninis tyrimas (RIA)

Metodas pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija naudojant radionuklidu pažymėtą antigeną arba antikūną. 125I, 14C, 3H, 51Cr ir kiti radionuklidai naudojami kaip etiketės. Susidarę imuniniai kompleksai yra išskiriami iš sistemos, o jų radioaktyvumas nustatomas skaitikliais (β spinduliuotė). Spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.

Kietosios fazės RIA versija, naudojant žymėtus antikūnus arba antigenus, sorbuotus polistireno plokščių šuliniuose, yra plačiai paplitusi.

RIA naudojama aptikti mikrobų, virusų, įvairių hormonų, fermentų, vaistų, imunoglobulinų antigenus, taip pat kitas medžiagas, esančias tiriamojoje medžiagoje nedidelėmis 10-12-10-15 g/l koncentracijomis.

Kontroliniai klausimai

Imuninės bakteriolizės reakcija: kokia tai reakcija; kas yra antigenas, kas yra antikūnas, reakcijos mechanizmas, gamybos metodai, praktinis pritaikymas. Imuninės hemolizės reakcija: būtini ingredientai, procedūra; valdikliai, praktinis pritaikymas. Vietinė hemolizės reakcija gelyje (Jerne reakcija): reakcijos principas, formulavimo būdas, praktinis pritaikymas. Komplemento fiksavimo reakcija: reakcijos principas; kas susidaro, kai imuninis serumas sąveikauja su konkrečiu antigenu; kas atsitiks su papildymu, jei jis yra šios sąveikos metu? Koks yra komplemento likimas, jei nėra specifinio afiniteto tarp antigeno ir antikūnų? Kokia reakcija gali būti naudojama norint nustatyti, kas nutiko komplementui; kodėl naudojama ši konkreti reakcija; Koks yra matomas teigiamas RSC rezultatas? Kodėl? Kokia komplemento savybė naudojama pirmoje RSC fazėje? Antrame etape? Jei galutinis RSC rezultatas yra hemolizė, ar tai reiškia teigiamą ar neigiamą rezultatą? Paaiškinkite rezultatus: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Pavadinkite pirmosios RSK sistemos sudedamąsias dalis ir antrosios RSK sistemos sudedamąsias dalis. Kodėl tiriamąjį serumą reikia inaktyvuoti? Kaip titruojamas komplementas? Hemolizinis serumas: kas jame yra, kaip jis gaunamas, koks titras ir kaip jis nustatomas? Kokie gyvūnai naudojami RSC komponentams gauti? RSC nustatymo šaltyje metodika. Kurioms iš šių reakcijų inscenizuojant reikalingas komplemento dalyvavimas: nusodinimas, flokuliacija, agliutinacija, nepilnų antikūnų nustatymas, imuninė bakteriolizė, imuninė hemolizė, Jerne, RSC? Imunofluorescencinė reakcija (RIF) – nurodykite tiesioginės Koons reakcijos įvykių seką; reikalingų ingredientų. Kas yra antigenas, kas yra antikūnas, kuo žymimi antikūnai, kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą, kaip atrodo teigiamas rezultatas? Praktinis pritaikymas – ką galima nustatyti naudojant šią reakciją? Netiesioginė imunofluorescencinė reakcija – nurodykite įvykių seką šios reakcijos metu, reikalingus ingredientus, koks yra antigenas, kokie imuniniai serumai naudojami; praktinis naudojimas; netiesioginio RIF pranašumas, palyginti su tiesiogine reakcija. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – reakcijos principas; būtini ingredientai; nurodyti įvykių seką, kai atliekama antigeno nustatymo reakcija tiriamoje medžiagoje; būtini ingredientai; Kas nutinka, kai rezultatas yra teigiamas, kaip jis atrodo? Nurodykite veiksmų seką atliekant ELISA antikūnams aptikti tiriamajame serume; būtini ingredientai; kas atsitiks, jei rezultatas bus teigiamas? Imunoblotingas – reakcijos principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; kaip atsižvelgiama į rezultatą; reakcijos nauda. Radioimuninis tyrimas (RIA) – kokie yra pagrindiniai reakcijos etapai; Kuo paženklinti antikūnai ar antigenai, kaip atsižvelgiama į rezultatą? Imunoelektroninė mikroskopija – metodo principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; kuo paženklinti antikūnai? kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą. Imobilizacijos reakcijos – metodo principas, nustatymo technika, komponentai, rezultatų fiksavimas.

Užduotys, kurias reikia atlikti savarankiško mokymosi metu.

Užpildykite lentelę „Imuninės reakcijos“ pagal šioje temoje aptartas reakcijas.

Imuninės reakcijos

Studentų darbas praktinės pamokos metu

Nedelsdami pradėkite darbą nustatydami 1 RSK etapą, bet vėliau užsirašykite jį į užrašų knygelę (žr. toliau).

1. Imuninės hemolizės reakcija. Peržiūrėkite demonstracinę imuninės hemolizės reakciją, nubraižykite ją diagramos pavidalu, paaiškinkite rezultatą eksperimentiniuose ir kontroliniuose mėgintuvėliuose.

2. Komplemento fiksavimo reakcija

a) išanalizuoti RSK pagal lentelę;

b) užrašų knygelėje nubraižykite RSC sąrankos schemą lentelės pavidalu;

c) įdėti antrąjį RSK etapą (pirmasis etapas dedamas pamokos pradžioje);

d) analizuoti RSC būtinus diagnostinius preparatus;

d) atsižvelgti į rezultatą. Suformuluokite išvadą apie specifinių antikūnų buvimą tiriamajame serume.

3. Imunofluorescencinė reakcija. Išstudijuokite lentelę, savo sąsiuvinyje pasidarykite reakcijos schemą; pažiūrėkite į diagnostinius serumus; nustatyti, kas serume yra, kaip jis paruoštas, kokiai reakcijai (tiesioginei ar netiesioginei RIF) naudojamas. Pažiūrėkite į RIF demonstravimo rezultatą fluorescenciniame mikroskope.

4. Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA). Užrašų knygelėje sudarykite dviejų versijų reakcijos nustatymo schemą: antigenui aptikti tiriamoje medžiagoje ir antikūnams serume aptikti. Peržiūrėkite ŽIV ir hepatito B sudedamųjų dalių rinkinį. Nurodykite, ką sudaro kiekvienas ingredientas ir kam jis naudojamas.

5. Imunoblotingas. Savo užrašų knygelėje pasidarykite reakcijos schemą; žiūrėti demonstraciją – reakcijos rezultatas.

6. Radioimuninis tyrimas (RIA). Savo užrašų knygelėje padarykite reakcijos diagramą.

7. Imuninė elektroninė mikroskopija (IEM). Stebėkite demonstraciją – reakcijos rezultatą, užrašų knygelėje nubraižykite reakcijos schemą, rodyklėmis nurodykite antigeną (virusą) ir paženklintus antikūnus.

Imunoblotavimas yra labai jautrus baltymų nustatymo metodas, pagrįstas elektroforezės ir ELISA arba RIA deriniu. Imunoblotavimas naudojamas kaip ŽIV infekcijos diagnostikos metodas ir kt.

Bendrąja prasme imunoblotingas reiškia baltymų mišinio, perkelto į kietą membranos atramą, prie kurios jie yra surišti kovalentiniais ryšiais, analizę, po kurios atliekama imunodetekcija.

Galite analizuoti baltymų mišinį, tiesiogiai uždėtą ant substrato – taškinio blotavimo analizę – arba po preliminaraus jo frakcionavimo elektrofokusavimo, disko elektroforezės arba dvimatės elektroforezės būdu – Western blot analizę.

Patogeno antigenai atskiriami naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę, po to iš gelio perkeliami į aktyvuotą popierių arba nitroceliuliozės membraną ir sukuriami naudojant ELISA.

Įmonės gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“. Ant šių juostelių tepamas paciento serumas. . Tada po inkubacijos pacientas nuplaunamas nuo neprisijungusių antikūnų ir užtepamas serumu prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintus fermentu. . Ant juostelės susidaręs kompleksas (antigenas + paciento antikūnas + antikūnas prieš žmogaus Ig) aptinkamas pridedant chromogeninį substratą, kuris keičia spalvą veikiant fermentui.

Ši metodika taip pat naudojama atrenkant bakterijų, fagų ar virusų, ekspresuojančių tikslinius klonuotų genų produktus, klonus.

Baltymų perkėlimas į membraną atliekamas pasyviai arba naudojant elektros perdavimo įrangą. Baltymų pernešimo į membraną efektyvumą įtakoja daugelis veiksnių, tokių kaip baltymų molekulinė masė, gelio poringumas, perdavimo laikas ir naudojamo buferinio tirpalo (trans-buferio) sudėtis.

Atsižvelgiant į eksperimento tikslus ir sąlygas, parenkamos perkėlimo sąlygos, kurios užtikrina geriausius rezultatus. Nitroceliuliozė, polivinilideno difluoridas (PVDF) arba teigiamai įkrautos nailono membranos dažniausiai naudojamos kaip substratai. Nitroceliuliozė gali surišti iki 80 - 100 μg baltymų 1 cm2.

Dėl plovimo galima prarasti mažos molekulinės masės baltymus (kurių molekulinė masė mažesnė nei 20 kDa), tai leidžia preliminariai ištirti tam tikrų genetinių lokusų polimorfizmą pagal atitinkamų DNR restrikcijos fragmentų ilgius.

Be to, naudodamiesi Southern hibridizacija galite nesunkiai sužinoti, ar tikslinio geno vidinėje dalyje yra hidrolizės vieta, kurią vykdo tam tikras restrikcijos fermentas, o tai leidžia pasirinkti optimalią tiriamos genomo srities klonavimo strategiją.

Naudojant panašią schemą, RNR molekulės gali būti perkeltos iš agarozės gelio į nitroceliuliozės filtrą. Šis metodas buvo vadinamas Northern blotting, priešingai nei Southern blotting, nes pavadinimas Southern angliškai reiškia „pietinis“.

Baltymų perkėlimas ant filtrų iš gelio buvo atitinkamai vadinamas Western blotting. Dideli baltymai (>100 kDa), denatūruoti natrio dodecilsulfato (SDS) tirpale, gali būti prastai pernešami į membraną, jei transbuferyje yra etanolio. Alkoholis ženkliai pagerina baltymų pernešimą iš SDS-poliakrilamido gelio, tačiau susiaurina poras gelyje, todėl išlaikomi dideli baltymai.

PVDF membrana yra optimizuota imunodekcijai ir gali išlaikyti iki 160 μg/cm2 specifiškai surištų baltymų su labai mažu nespecifinio surišimo lygiu.

Imunoblotingas

Svarbi šios membranos savybė yra galimybė ją pakartotinai naudoti. Zeta-Probe nailono membranos veiksmingai suriša SDS baltymus, kai nėra alkoholio, ir šis surišimas yra atsparus tolesniam gydymui. Taip pat efektyviai išlaikomi mažos molekulinės masės baltymai. Zeta-Probe membranos, kurių surišimo geba yra maždaug 480 μg baltymų viename cm2, leidžia aptikti nedidelius baltymų kiekius bandomuosiuose mišiniuose.

Kai antigenas yra imobilizuotas ant membranos, likusios surišimo vietos blokuojamos želatinos, galvijų serumo albumino arba nugriebto pieno tirpalais.

Tada membrana inkubuojama polikloninių arba monokloninių antikūnų prieš tiriamą antigeną tirpale. Nuplovus neprisijungusius antikūnus, membrana inkubuojama antrinių antikūnų, kurie yra fermentų šarminės fosfatazės (AP) arba krienų peroksidazės (HRP) konjugatas su antikūnais prieš rūšinius (ožkų antikūnai prieš triušių, pelių ar žmogaus imunoglobulinus) tirpale. ) arba baltymai A (Staphylococcus aureus baltymas) arba G (Streptococcus sp. baltymas), turintys didelį afinitetą imunoglobulinų Fc sričiai.

Susidariusių imuninių kompleksų aptikimas atliekamas cheminiu arba chemiliuminescenciniu būdu. Cheminės reakcijos substratai, kai naudojami šarminės fosfatazės konjugatai, yra 5-brom-4-chlor-3-indolilfosfatas (BCIP) arba mėlynasis tetrazolis (NBT), o naudojant krienų peroksidazės konjugatus - 4-chlor-1-naftolis ir vandenilio peroksidas. .

Dėl fermentinių reakcijų antigeno-antikūno komplekso lokalizacijos vietoje ant membranos susidaro spalvota juosta arba dėmė.

Šio metodo jautrumas yra 100 pg baltymų naudojant AP konjugatus ir 100-500 pg naudojant HRP konjugatus. Chemiliuminescencinis imuninių kompleksų nustatymas leidžia aptikti mažiau nei 5 pg antigeno. Šio metodo principas – HRP reaguojant su vandenilio peroksidu ir cikliniu diacilhidrazino luminoliu, išspinduliuojama 428 nm bangos ilgio šviesa, kurią galima užfiksuoti šviesai jautrioje plėvelėje.

Imunoblotavimo (IB) reakcija buvo sukurta remiantis ELISA. Tai specifiškiausias ir jautriausias imunocheminės analizės metodas. Imunoblotavimas (iš anglų kalbos blot - blot, stain) sujungia ELISA su elektroforeze. Jis naudojamas aptikti ne sudėtingus antikūnus prieš ŽIV, o antikūnus prieš atskirus jo struktūrinius baltymus (baltymus p24, glikoproteinus gp120, gp 41 ir kt.). Nurodo ekspertų (patvirtinančias) reakcijas diagnozuojant ŽIV infekciją.

Reakcija vyksta keliais etapais:

Virusas sunaikinamas į komponentus - antigenus (p24, gp120, gp 41 ir tt), kuriems atliekama elektroforezė poliakrilamido gelyje, tai yra, antigenų atskyrimas į frakcijas pagal molekulinę masę.

2. Gelis padengiamas nitroceliuliozės membrana ir elektroforezės būdu į ją perkeliamos antigeno frakcijos. Nitroceliuliozė elgiasi kaip blotingasis popierius. Membrana supjaustoma juostelėmis. Įmonės gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“.

Imunoblotingas – papildomas netiesioginis metodas

ŽIV antigenais padengtos juostelės panardinamos į tiriamojo serumą ir nuplaunamos, kad būtų pašalinta nesusijusi medžiaga.

4. Juostelės inkubuojamos su peroksidaze paženklintu antiglobulino serumu ir nuplaunamos.

Pridedamas substratas ir pažymimas spalvotų frakcijų (dėmių), atitinkančių AG-AT komplekso lokalizacijos zoną, skaičius.

Juostų buvimas tam tikrose juostelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus. Imunoblotavimo rezultatas laikomas teigiamu, jei ant membranos matomos juostos, atitinkančios bet kuriuos du iš trijų ŽIV antigenų – p24, gp41 ir gp 120 (37 pav.).

BRĖŽINIAI

NAUDOTŲ NUORODOS SĄRAŠAS

Pagrindinė literatūra

Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija: vadovėlis medicinos studentams. universitetai, 2 leid., red. ir papildomas – 702 p. Red. A.A. Vorobjova. M.: VRM, 2012 m.

2. Mikrobiologija, virusologija ir imunologija: žinynas laboratoriniams užsiėmimams: vadovėlis/(V.B. Sboičakovas ir kt.); Redaguota V.B. Sboychakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 p.: iliustr.

3. Medicinos mikrobiologija, imunologija ir virusologija [Elektroninis išteklius]: medaus vadovėlis.

universitetai - 760 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburgas: Spetslitas, 2010 m.

4. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai / T. 1. - 448 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai T. 2. - 480 p. Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010 m.

papildomos literatūros

1. Imunodiagnostinės reakcijos: vadovėlis / komp.: G.K.Davletšina, Z.G.Gabidullinas, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunovas, A.K.Bulgakovas, T.A.Savčenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusijos sveikatos apsaugos ministerijos valstybinės biudžetinės aukštojo profesinio mokymo įstaigos BSMU leidykla, 2016 m. - 86 p.

2. Kai kurių savybių, lemiančių kartu auginamų bakterijų Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus variantų patogeninį potencialą, ypatybės: mokslinė publikacija / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Pagrindinis puslapis » Imunoblotas – kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas

Imunoblotas - kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas

Kas yra imunoblotas? Tai yra įprastas žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Tai vienas tiksliausių ir patikimiausių būdų nustatyti ŽIV buvimą.

Dėl patikimumo jis yra net didesnis nei su fermentu susijęs imunosorbentinis tyrimas (elisa). Imunoblotų rezultatai laikomi įtikinamais ir įtikinamais Bendra informacija

Imunoblotas - kas tai? Norėdami atpažinti asmenį užsikrėtusį ŽIV, turite atlikti laboratorinį tyrimą ir ištirti, ar jūsų kraujo serume nėra antikūnų.

Western blot sekcijos taip pat vadinamos Western blot. Jis naudojamas žmogaus virusinėms infekcijoms nustatyti kaip papildomas ekspertinis metodas. Tai būtina norint patvirtinti ELISA – laboratorinį tyrimą, leidžiantį nustatyti antikūnų prieš ŽIV buvimą kraujyje. Imunoblotas dar kartą patikrinkite teigiamą ELISA.

Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiausiu.

Tikslas

Kas yra imunoblotas? Šis kraujo serumo laboratorinio tyrimo metodas, siekiant nustatyti antikūnų prieš virusą buvimą.

Specialių tyrimų metu visas viruso baltymas buvo rastas gelyje ir ant nitroceliuliozės membranų.

Imunoblotavimas (antikūnų aptikimas paciento serume prieš tam tikrus patogeno antigenus)

Western blot sekcijos procedūra skirta ŽIV infekcijai nustatyti įvairiais etapais. Pirmajame etape išvalytas virusas iš jo sudedamųjų dalių yra veikiamas elektroforezės ir jame esantys antigenai dalijami pagal molekulinę masę.

Žmogaus imunodeficito virusas dauginasi gyvose ląstelėse, įterptose į jo genetinę informaciją. Šiame etape žmogus tampa ŽIV viruso nešiotojas, jei esate užsikrėtęs.

Šios ligos specifika yra ta, kad ji ilgą laiką nepasireiškia. Virusas naikina limfocitus, todėl sumažėja žmogaus imunitetas, organizmas nebegali kovoti su infekcijomis.

Jei ŽIV bus gydomas teisingai ir greitai, pacientas gyvens iki senatvės. Gydymo trūkumas neišvengiamai sukelia mirtį. Nuo užsikrėtimo momento, bet be gydymo, maksimalus laikotarpis yra ne daugiau kaip dešimt metų.

Ypatumai

Imunoblotinė analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti, ar yra antikūnų prieš pirmojo ir antrojo tipo ŽIV antigenus.

Jei žmogus yra užsikrėtęs, po dviejų savaičių antikūnai gali būti aptikti daug vėliau. Ypatinga ŽIV savybė yra tai, kad antikūnų kiekis greitai didėja ir lieka paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga gali nepasireikšti dvejus ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nurodo ligos buvimą, todėl reikia patvirtinti PGR ir Western blot sekcijų rezultatus, jei fermento imunologinis tyrimas parodė teigiamą rezultatą.

Indikacijos dėl

Koks „imunoblotas“ jau buvo nustatytas, bet kuris pristatomas tyrime?

Žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) tyrimo priežastis bus teigiamas ELISA rezultatas. Pacientams, kuriems ruošiamasi operuoti, būtina atlikti su fermentu susietą imunosorbento tyrimą. Be to, turėtumėte atlikti nėštumą planuojančių moterų, taip pat palaidūnų analizę. Western blot sekcijos skiriamos ŽIV užsikrėtusiems pacientams, jei Elisa rezultatai yra neaiškūs.

Kreipimosi į gydytoją priežastis gali būti šie nerimą keliantys simptomai: greitas svorio kritimas; silpnumas, funkcijos praradimas; žarnyno sutrikimai (viduriavimas), trunkantis tris savaites; dehidratacija; karščiavimas; padidėję limfmazgiai organizme; kandidozės, tuberkuliozės išsivystymas. , pneumonija, toksoplazmozė, pūslelinės paūmėjimas.

Prieš duodamas veninį kraują pacientui ruoštis nereikia.

Nevalgykite 8-10 valandų prieš tyrimą. Dieną prieš kraujo davimą nerekomenduojama gerti alkoholio ar kavos gėrimų, užsiimti sunkiu fiziniu krūviu, jausti nerimą.

Kur atlikti analizę?

Kur galiu išsitirti dėl ŽIV?

ELISA, imunoblotinė analizė, atliekama miesto privačiose klinikose, duoda rezultatus per dieną. Galima ir skubi diagnozė. Valstybinėse įstaigose medicininiai tyrimai Elisa ir Western blot skyriuose pagal Rusijos Federacijos įstatymus yra nemokami.

Privalomas nėščiųjų ir pacientų, kuriems reikalinga hospitalizacija ar operacija, infekcinių ligų patikra Kaip atliekamas šis tyrimas?

Kaip atlikti ELISA? Imunoblotas teigiamas / neigiamas patvirtina arba paneigia elisa rezultatus. Procedūra gana paprasta. Specialistas paima veninį kraują, kuris trunka mažiau nei penkias minutes.

Paėmus mėginį, injekcijos vietą reikia dezinfekuoti ir uždengti tvarsčiu. Mėginiai imami nevalgius, todėl po procedūros nepakenks suvalgyti plytelę juodojo šokolado ar saldaus karšto gėrimo.

Norėdami gauti siuntimą nemokamai atlikti tyrimą valstybinėje gydymo įstaigoje, turite apsilankyti pas terapeutą.

Apskritai imunoblotas nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų. Tyrimo metodika paprasta. Jei žmogaus kraujyje yra viruso, organizmas pradeda gaminti antikūnus, kad jį sunaikintų. Kiekvienam virusui yra daug baltymų antigenų. Šių antikūnų aptikimas yra Western blot sekcijos metodo pagrindas. Kaina

Kiek laiko trunka analizė? ŽIV imunoblotas yra vienas pigiausių tyrimų.

Vidutiniškai imunologinio tyrimo atrankos metodai svyruoja nuo 500 iki 900 rublių. Western blot skyriai yra testų, kurių kaina svyruoja nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių, tyrimas. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pavyzdžiui, už polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę turėsite sumokėti apie 12 000 rublių.

Rezultatų interpretacija

Dažniausi ŽIV infekcijos diagnozavimo metodai yra su fermentais susijęs imunosorbentas ir imunoblotas.

Jie naudojami antikūnams prieš žmogaus imunodeficito virusą nustatyti serume. Infekcija paprastai patvirtinama dviem tyrimais: patikra ir patvirtinamuoju. Rezultatus turi interpretuoti gydytojas, kuris diagnozuoja ir paskirs gydymą. Jei imunoblotas teigiamas, tai reiškia, kad žmogaus organizme yra virusas.

Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiško gydymo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti savo ligos vaizdą.

Kokybinė analizė apima patikrinimą ir sertifikavimą. Jei virusas pacientui neaptinkamas, rezultatas yra „neigiamas“. Nustačius šį pažymėjimą, atliekami papildomi patikros tyrimai. Imunobloto analizė, kuri patvirtina arba paneigia atranką. Jei bandymo juostelės atsiranda tam tikrose tamsiose vietose (baltymų lokalizacija), nustatoma ŽIV diagnozė.

Jei rezultatai abejotini, tyrimai atliekami per tris mėnesius.

Apsisaugoti nuo užsikrėtimo žmogaus imunodeficito virusu galima laikantis tam tikrų taisyklių: vengti atsitiktinio lytinio kontakto, kontakto metu naudoti prezervatyvus, nevartoti narkotikų.

Nustačius ligą nėščiajai, svarbu laikytis gydančio gydytojo rekomendacijų ir nepamiršti išsitirti, ar nėra viruso.

Kas yra Western blotting?

Baltymų identifikavimas sudėtinguose įvairių audinių mišiniuose ar ekstraktuose yra viena iš dažnai sutinkamų problemų. Naudojant tokį įrankį kaip specifiniai antikūnai, galima nustatyti tiriamą baltymą su minimaliomis laiko ir finansinėmis sąnaudomis.

Taikant Western blot metodą, pirmajame etape baltymų mišinys atskiriamas elektroforezės būdu, dalyvaujant natrio dodecilsulfatui (SDS), po to perkeliamas į nitroceliuliozės membraną elektroblotavimo būdu.

Šio metodo esmė ta, kad po elektroforezės gelis dedamas ant nitroceliuliozės membranos tarp filtravimo popieriaus sluoksnių. Taip surinktas „sumuštinis“ dedamas į elektrinį lauką, kad baltymo-SDS kompleksai judėtų per gelio plokštelę ir būtų imobilizuoti (dėl nespecifinės sorbcijos) ant nitroceliuliozės membranos paviršiaus.

Baltymų-SDS komplekso prisijungimas prie nitroceliuliozės membranos daugiausia apima elektrinio pobūdžio jėgas, o ši sąveika yra daugiataškė ir lemia baltymų „skleidimą“ membranos paviršiuje. Taigi po elektrotransferos gauname nitroceliuliozės gelio kopiją su baltymais, esančiais taip pat, kaip ir poliakrilamido gelyje.

Po SDS elektroforezės, elektropernešimo ir baltymų sorbcijos iš gelio ant nitroceliuliozės membranos, tretinė baltymo konformacija labai pasikeičia, jei apskritai teisinga kalbėti apie tretinės baltymo struktūros egzistavimą po tokio atšiauraus apdorojimo. Todėl imunocheminiam tiriamo baltymo aptikimui dažniausiai naudojami tik mono- arba polikloniniai antikūnai, būdingi baltymo molekulės linijinėms sritims.

51. Fermentinis imunologinis tyrimas, imunoblotingas. Mechanizmas, komponentai, taikymas.

Antikūnai, specifiniai konformaciniams epitopams (arba sritims, kuriose yra tarpsubvienetų kontaktai), paprastai netinka naudoti Western blot tyrime.

Po baltymų pernešimo membrana paeiliui inkubuojama su tiriamam baltymui būdingais antikūnais, o po to su antriniais antikūnais, specifiniais pirminių antikūnų Fc fragmentams, konjuguotais su fermento (ar kokiu nors kitu) ženklu (1 pav.).

1 A). Tuo atveju, kai tiriamam antigenui būdingi pirminiai antikūnai yra tiesiogiai konjuguoti su etikete, antrinių antikūnų nereikia (1 B pav.). Imuniniai kompleksai, susidarę tiriamo baltymo lokalizacijos vietoje, „pasireiškia“ naudojant chromogeninį substratą (priklausomai nuo etiketės tipo).

Metodo jautrumas ir specifiškumas labai priklauso nuo to, kokie antikūnai naudojami tyrime.

Naudojami antikūnai turi būti specifiniai unikaliai aminorūgščių sekai, būdingai tik tiriamam baltymui. Priešingu atveju galima antikūnų sąveika (ypač žalių baltymų ekstraktų atveju) su keliomis baltymų molekulėmis, o tai savo ruožtu lems kelių spalvotų juostų atsiradimą ant membranos.

Šiuo atveju tiriamo baltymo nustatymas dažnai būna sunkus arba net neįmanomas.

Antras svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti renkantis antikūnus, yra afinitetas. Kuo didesnis naudojamų antikūnų afinitetas, tuo ryškesnės ir aiškesnės yra baltymų juostos, tuo didesnis metodo jautrumas. Naudojant didelio afiniteto antikūnus, galima pasiekti 1 ng ar net didesnį jautrumą.

Norint vizualizuoti su membrana susieto antigeno ir antikūnų sąveikos rezultatą, naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su agentais, galinčiais tam tikromis sąlygomis duoti tam tikrą signalą.

Paprastai kaip toks agentas naudojamas fermentas (peroksidazė arba fosfatazė), kurio reakcijos produktas yra spalvotas ir nusėda ant membranos netirpių nuosėdų pavidalu.

Šiuo metodu taip pat galima naudoti fluorescencines etiketes.

Ryžiai. 1. Tiriamo baltymo imunocheminio dažymo schema: A - naudojant antrinius antikūnus, konjuguotus su fermento žyme; B – pirminis antikūnas yra tiesiogiai konjuguotas su fermento žyme.

Protokolas:

I. Gelio ir membranos paruošimas ir baltymų elektrotransfera

Po elektroforezės poliakrilamido gelis dedamas į vonią su blotingo buferiu (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10 % etanolio).

Du filtravimo popieriaus lapai, supjaustyti pagal blotingo kasetės formą ir sudrėkinti blotingo buferiu, dedami ant tos kasetės dalies, kuri bus nukreipta į anodą. Tada ant filtravimo popieriaus dedama nitroceliuliozės membrana, iš anksto sudrėkinta tuo pačiu buferiu, užtikrinant, kad tarp membranos ir popieriaus nebūtų oro burbuliukų.

Tada gelį reikia atsargiai uždėti ant membranos, ypatingą dėmesį skiriant tam, kad tarp gelio ir membranos nebūtų oro burbuliukų. Sumuštinio formavimą užbaigia du sudrėkinto filtravimo popieriaus sluoksniai, kurie dedami ant gelio paviršiaus (2 pav.). Gautas sumuštinis įspaudžiamas į kasetę ir dedamas tarp elektrodų taip, kad membrana būtų nukreipta į anodą.

Ryžiai. 2. Baltymų elektros perdavimo į membraną schema.

II. Elektrinis perdavimas

Baltymai perkeliami į nitroceliuliozės membraną buferyje, kuriame yra 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10% etanolio, 30-50 min., esant pastoviai 100 V įtampai.

Elektros pernešimo laikas priklauso nuo perkeliamų baltymų dydžio; kuo didesnis baltymas, tuo ilgiau užtrunka elektros perdavimas. Elektrotransferos kokybė ir baltymų juostų išsidėstymas vertinamas nitroceliuliozės membraną nudažant 0,3 % Ponceau S tirpalu 1 % acto rūgštyje. Prieš imunocheminį dažymą, membraną reikia keletą kartų nuplauti silpnai šarminiu vandeniniu Tris tirpalu, kad būtų pašalintas su baltymais susijungęs dažiklis.

III. Ant nitroceliuliozės membranos imobilizuotų baltymų imunocheminis dažymas

Norint blokuoti nespecifinio antikūnų surišimo vietas, membrana inkubuojama nuolat maišant kambario temperatūroje 30 minučių PBST (geresniam blokavimui galima naudoti PBST tirpalą, kuriame yra 10 % nugriebto pieno miltelių).

Po blokavimo membrana inkubuojama valandą kambario temperatūroje, nuolat maišant PBST, kuriame yra 1-10 μg/ml specifinių antikūnų.

Optimali antikūnų koncentracija parenkama empiriškai ir priklauso nuo antikūnų sąveikos su antigenu afiniteto.

Inkubavimo pabaigoje membraną 5 kartus nuplaukite PBST ir perkelkite į antrinių antikūnų, konjuguotų su krienų peroksidaze, tirpalą. Konjugato praskiedimą paprastai nurodo gamintojas ant pakuotės arba empiriškai parenka tyrėjas. Inkubuokite membraną antrinio antikūno tirpale 1 valandą nuolat maišydami.

Po kruopštaus plovimo (pakeiskite buferį bent 5-6 kartus) PBST membrana perkeliama į chromogeninio substrato tirpalą, kuriame yra 3 mg diaminobenzidino (DAB) ir 10 μl 30% vandenilio peroksido 10 ml 0,1 M Tris-HCl. , pH 7,6.

Inkubuojama maišant 5-10 minučių. Pasibaigus inkubacijai su substratu, membraną reikia nuplauti PBST, išdžiovinti filtravimo popieriumi ir nedelsiant nuskaityti spalvotą elektroninę kopiją. Jei membrana visiškai išdžiūsta, nudažytos baltyminės juostelės išblunka, vaizdas pasirodo ne toks ryškus ir kontrastingas.

Pastaba: DAB yra toksiškas ir galimas kancerogenas. Dirbkite tik su guminėmis pirštinėmis!

Laiku diagnozuota ŽIV infekcija tampa itin svarbia priemone, nes ankstyvas gydymo pradėjimas gali iš esmės nulemti tolesnę ligos raidą ir pailginti paciento gyvenimą. Pastaraisiais metais identifikuojant šią baisią ligą padaryta didelė pažanga: senesnes tyrimų sistemas keičia pažangesnės, tyrimo metodai tampa prieinamesni, jų tikslumas gerokai didėja.

Šiame straipsnyje kalbėsime apie šiuolaikinius ŽIV infekcijos diagnostikos metodus, kurių žinios praverčia laiku gydant šią problemą ir palaikant normalią paciento gyvenimo kokybę.

ŽIV diagnostikos metodai

Rusijoje ŽIV infekcijai diagnozuoti atliekama standartinė procedūra, kurią sudaro du lygiai:

• ELISA testų sistema (atrankinė analizė);
• imunoblotingas (IB).

Diagnozei nustatyti gali būti naudojami ir kiti metodai:

• greitieji testai.

ELISA testų sistemos

Pirmajame diagnozės etape ŽIV infekcijai nustatyti naudojamas atrankos testas (ELISA), kuris yra pagrįstas ŽIV baltymais, sukurtais laboratorijose, kurios fiksuoja specifinius antikūnus, gaminamus organizme reaguojant į infekciją. Po jų sąveikos su tiriamosios sistemos reagentais (fermentais), pasikeičia indikatoriaus spalva. Toliau šie spalvų pokyčiai apdorojami specialia įranga, kuri lemia atliktos analizės rezultatą.

Tokie ELISA tyrimai gali parodyti rezultatus per kelias savaites nuo ŽIV infekcijos įvedimo. Šis tyrimas nenustato viruso buvimo, bet nustato antikūnų prieš jį gamybą. Kartais žmogaus organizme antikūnai prieš ŽIV prasideda praėjus 2 savaitėms po užsikrėtimo, tačiau daugumos žmonių jie gaminasi vėliau, po 3-6 savaičių.

Yra keturios ELISA testų kartos, kurių jautrumas skiriasi. Pastaraisiais metais vis dažniau naudojamos trečios ir ketvirtos kartos bandymų sistemos, kurios yra pagrįstos sintetiniais peptidais arba rekombinantiniais baltymais ir pasižymi didesniu specifiškumu bei tikslumu. Jais galima diagnozuoti ŽIV infekciją, stebėti ŽIV paplitimą ir užtikrinti saugumą tiriant paaukotą kraują. III ir IV kartos ELISA testų sistemų tikslumas siekia 93-99% (Vakarų Europoje gaminami testai jautresni – 99%).

ELISA tyrimui atlikti iš paciento venos paimama 5 ml kraujo. Nuo paskutinio valgio iki analizės turi praeiti mažiausiai 8 valandos (paprastai ji atliekama ryte tuščiu skrandžiu). Tokį tyrimą rekomenduojama atlikti ne anksčiau kaip po 3 savaičių nuo įtariamos infekcijos (pavyzdžiui, po nesaugių lytinių santykių su nauju lytiniu partneriu).

ELISA tyrimo rezultatai gaunami per 2-10 dienų:

• neigiamas rezultatas: rodo, kad nėra ŽIV infekcijos ir nereikia kreiptis į specialistą;
• klaidingai neigiamas rezultatas: gali būti stebimas ankstyvosiose infekcijos stadijose (iki 3 savaičių), vėlesnėse AIDS stadijose, kai yra stiprus imuninės sistemos slopinimas ir netinkamai paruošus kraują;
• klaidingai teigiamas rezultatas: gali būti stebimas sergant kai kuriomis ligomis ir netinkamai paruošus kraują;
• teigiamas rezultatas: rodo ŽIV infekciją, reikia atlikti IB ir pacientui kreiptis į AIDS centro specialistą.

Kodėl ELISA testas gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus?

Klaidingai teigiami ŽIV ELISA tyrimo rezultatai gali atsirasti dėl netinkamo kraujo apdorojimo arba pacientams, kuriems yra šios būklės ir ligos:

• daugybinė mieloma;
• infekcinės ligos, kurias sukelia Epstein-Barr virusas;
• būsena po ;
• autoimuninės ligos;
• nėštumo fone;
• būklė po vakcinacijos.

Dėl aukščiau aprašytų priežasčių kraujyje gali būti nespecifinių kryžmiškai reaguojančių antikūnų, kurių susidarymo neišprovokavo ŽIV infekcija.

Pastaraisiais metais klaidingai teigiamų rezultatų dažnis ženkliai sumažėjo, nes naudojamos III ir IV kartos tyrimų sistemos, kuriose yra jautresnių peptidinių ir rekombinantinių baltymų (jie sintetinami naudojant genų inžineriją in vitro). Pradėjus taikyti tokius ELISA tyrimus, klaidingai teigiamų rezultatų dažnis gerokai sumažėjo ir yra apie 0,02-0,5%.

Klaidingai teigiamas rezultatas nereiškia, kad asmuo yra užsikrėtęs ŽIV. Tokiais atvejais PSO rekomenduoja atlikti kitą ELISA testą (būtinai IV kartos).

Paciento kraujas siunčiamas į referencinę ar arbitražo laboratoriją su žyma "pakartojimas" ir tiriamas naudojant IV kartos ELISA testų sistemą. Jei naujos analizės rezultatas yra neigiamas, pirmasis rezultatas laikomas klaidingu (klaidingai teigiamas) ir IS neatliekamas. Jei antrojo tyrimo metu rezultatas yra teigiamas arba abejotinas, po 4-6 savaičių pacientui turi būti atlikta IB, kad būtų patvirtinta arba paneigta ŽIV infekcija.

Imuninis blotingas

Galutinė ŽIV infekcijos diagnozė gali būti nustatyta tik gavus teigiamą imunoblotingo (IB) rezultatą. Tam naudojama nitroceliuliozės juostelė, ant kurios dedami virusiniai baltymai.

IB kraujo mėginiai imami iš venos. Tada jis specialiai apdorojamas, o jo serume esantys baltymai atskiriami specialiame gelyje pagal jų krūvį ir molekulinę masę (manipuliacija atliekama naudojant specialią įrangą, veikiant elektriniam laukui). Ant kraujo serumo gelio uždedama nitroceliuliozės juostelė ir specialioje kameroje atliekamas blotavimas („blotingas“). Juostelė yra apdorojama ir, jei naudojamose medžiagose yra antikūnų prieš ŽIV, jie prisijungia prie IB antigeninių juostų ir pasirodo kaip linijos.

IB laikomas teigiamu, jei:

• pagal amerikietiškus CDC kriterijus – ant juostelės yra dvi arba trys eilutės gp41, p24, gp120/gp160;
• pagal Amerikos FDA kriterijus, juostelė turi dvi eilutes p24, p31 ir liniją gp41 arba gp120/gp160.

99,9% atvejų teigiamas IB rezultatas rodo ŽIV infekciją.

Jei nėra linijų, IB yra neigiamas.

Identifikuojant eilutes su gr160, gr120 ir gr41, IB abejotina. Šis rezultatas gali atsirasti, kai:

• onkologinės ligos;
• nėštumas;
• dažni kraujo perpylimai.

Tokiais atvejais tyrimą rekomenduojama pakartoti naudojant kitos įmonės rinkinį. Jei po papildomo IB rezultatas išlieka abejotinas, tada stebėjimas būtinas šešis mėnesius (IB atliekamas kas 3 mėnesius).

Polimerazės grandininė reakcija

PGR testas gali aptikti viruso RNR. Jo jautrumas yra gana didelis ir leidžia nustatyti ŽIV infekciją per 10 dienų po užsikrėtimo. Kai kuriais atvejais PGR gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus, nes jo didelis jautrumas taip pat gali reaguoti į antikūnus prieš kitas infekcijas.

Šis diagnostikos metodas yra brangus ir reikalauja specialios įrangos bei aukštos kvalifikacijos specialistų. Dėl šių priežasčių neįmanoma atlikti masinio gyventojų testavimo.

PGR naudojama šiais atvejais:

• nustatyti ŽIV naujagimiams, gimusiems iš ŽIV infekuotų motinų;
• nustatyti ŽIV „lango periodu“ arba esant abejotinam IB;
• kontroliuoti ŽIV koncentraciją kraujyje;
• donorų kraujo tyrimui.

Vien PGR testas nenustato ŽIV diagnozės, bet yra atliekamas kaip papildomas diagnostikos metodas prieštaringoms situacijoms išspręsti.

Ekspreso metodai

Viena iš ŽIV diagnostikos naujovių – greitieji testai, kurių rezultatus galima įvertinti per 10-15 minučių. Veiksmingiausi ir tiksliausi rezultatai gaunami naudojant imunochromatografinius tyrimus, pagrįstus kapiliarinio srauto principu. Tai specialios juostelės, ant kurių užtepamas kraujas ar kiti tiriamieji skysčiai (seilės, šlapimas). Jei yra antikūnų prieš ŽIV, po 10-15 minučių ant testo atsiranda spalvota ir kontrolinė juostelė – teigiamas rezultatas. Jei rezultatas neigiamas, rodoma tik kontrolinė juostelė.

Kaip ir atliekant ELISA testus, greitųjų testų rezultatai turi būti patvirtinti IB analize. Tik po to galima diagnozuoti ŽIV infekciją.

Yra greito testavimo namuose rinkiniai. „OraSure Technologies1“ testas (JAV) yra patvirtintas FDA, parduodamas be recepto ir gali būti naudojamas ŽIV aptikti. Po tyrimo, jei rezultatas yra teigiamas, pacientui rekomenduojama atlikti tyrimą specializuotame centre, kad būtų patvirtinta diagnozė.

Kitų bandymų, skirtų naudoti namuose, FDA dar nepatvirtino ir jų rezultatai gali būti labai abejotini.

Nepaisant to, kad greitieji testai yra prastesni nei IV kartos ELISA testai, jie plačiai naudojami papildomam populiacijos tyrimui.

ŽIV infekcijos nustatymo testus galite atlikti bet kurioje klinikoje, centrinėje rajono ligoninėje ar specializuotuose AIDS centruose. Rusijos teritorijoje jie vykdomi visiškai konfidencialiai arba anonimiškai. Kiekvienas pacientas gali tikėtis medicininės ar psichologinės konsultacijos prieš arba po tyrimo. Už ŽIV tyrimus teks mokėti tik komercinėse gydymo įstaigose, o valstybinėse klinikose ir ligoninėse jie atliekami nemokamai.

Skaitykite apie būdus, kuriais galite užsikrėsti ŽIV ir kokie mitai egzistuoja apie užsikrėtimo galimybes.

Jo vardas AIDS Viačeslavas Zalmanovičius Tarantulis

Imunoblotingas – papildomas netiesioginis metodas

Be ELISA, tam tikrais atvejais ŽIV infekcijai tirti naudojama procedūra, vadinama „imunoblotingu“ arba „imuniniu blotingu“ (kartais vadinama „Western blot“). Remiantis PSO rekomendacijomis, imunoblotingas ŽIV infekcijos diagnostikai naudojamas kaip papildomas ekspertinis metodas, kuris turėtų patvirtinti ELISA rezultatus. Paprastai šis metodas dar kartą patikrina teigiamą ELISA rezultatą, nes jis laikomas jautresniu ir specifiškesniu, nors ir sudėtingesniu ir brangesniu. Tačiau prieš pasirašydamas galutinį verdiktą pacientui, gydytojas turi būti visiškai tikras dėl diagnozės teisingumo. Todėl sudėtingumo ir didelių sąnaudų klausimas čia negali būti lemiamas.

Ir pagal paskirtį, ir dėl atlikimo metodo gerai žinomas posakis „įdėk jį į bloterį“ puikiai tinka imunoblotingui. Imunoblotingas apjungia su fermentu susietą imunosorbentinį tyrimą (ELISA) su preliminariu elektroforetiniu viruso baltymų atskyrimu gelyje ir jų perkėlimu į nitroceliuliozės membraną („bloterį“). Imunobloto procedūra susideda iš kelių etapų (27 pav.). Pirma, ŽIV, anksčiau išgrynintas ir suardytas į jo sudedamąsias dalis, yra elektroforezė, o visi viruse esantys antigenai yra atskiriami pagal molekulinę masę. Tada, naudojant blotingo metodą (panašų į rašalo pertekliaus išspaudimą ant blotingo pagalvėlės), antigenai iš gelio perkeliami į nitroceliuliozės arba nailono filtro juostelę, kurioje dabar yra ŽIV būdingų baltymų spektras, nematomas akiai. . Toliau ant juostelės uždedama tiriamoji medžiaga (serumas, paciento kraujo plazma ir kt.), o jei mėginyje yra specifinių antikūnų, jie jungiasi prie juos griežtai atitinkančių antigeninių baltymų juostelių. Dėl vėlesnių manipuliacijų (panašiai kaip ELISA) šios sąveikos rezultatas vizualizuojamas – tampa matomas. Galiausiai juostų buvimas tam tikrose juostelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus.

Imunoblotavimas dažniausiai naudojamas ŽIV infekcijos diagnozei patvirtinti. PSO laiko teigiamus serumus, kuriuose imunoblotavimo būdu aptinkami antikūnai prieš bet kuriuos du ŽIV apvalkalo baltymus. Remiantis šiomis rekomendacijomis, jei yra reakcija tik su vienu iš apvalkalo baltymų (gp160, gp120, gp41) kartu arba be reakcijos su kitais baltymais, rezultatas laikomas abejotinu ir rekomenduojama atlikti pakartotinį tyrimą naudojant rinkinį iš skirtingų serijų arba iš kitos įmonės. Kad būtumėte saugūs, jei

Ryžiai. 27. Imunoblotavimui atlikti pirmajame etape kraujo serume esantys baltymai pagal jų molekulinę masę ir krūvį atskiriami gelyje, naudojant elektrinį lauką (gelinės elektroforezės būdu). Tada ant gelio uždedama nitroceliuliozės arba nailono membrana ir „blotuojama“ (tai yra blotingas). Tai atliekama specialioje kameroje, kuri leidžia visiškai perkelti medžiagą iš gelio į membraną. Dėl to baltymų išdėstymo modelis, kuris buvo ant gelio, atkuriamas ant membranos (dėmės), kurią vėliau galima lengvai manipuliuoti. Iš pradžių membrana apdorojama antikūnais prieš norimą antigeną, o nuplovus nesurištą medžiagą, pridedamas radioaktyviai pažymėtas konjugatas, kuris specifiškai jungiasi su antikūnais (kaip ELISA). Gauto antigenu-antikūnu pažymėto konjugato komplekso vieta nustatoma naudojant autoradiografiją naudojant rentgeno plėvelę. Po jo pasireiškimo paaiškėja, ar kraujyje yra antigenų, ar ne, o po to rezultatas lieka abejotinas, rekomenduojamas stebėjimas šešis mėnesius (tyrimai tęsiami kas tris mėnesius).

Šiuo metu Rusijos Federacijoje diagnozuojant ŽIV infekciją rekomenduojama naudoti penkias testų sistemas, tarp kurių yra ir Rusijos, ir užsienio.