Immunoblotting (immunoblot) é um método de referência altamente específico e altamente sensível que confirma o diagnóstico para pacientes com resultados de testes positivos ou indeterminados obtidos, incl. usando RIGA ou ELISA. Immunoblotting é um tipo de imunoensaio heterogêneo.

Este método de detecção de anticorpos contra antígenos individuais de um patógeno baseia-se na realização de ELISA em membranas de nitrocelulose, nas quais proteínas específicas são aplicadas na forma de bandas separadas, separadas por eletroforese em gel. Se existirem anticorpos contra determinados antigénios, aparece uma linha escura no local correspondente da tira. A singularidade do imunoblot reside no alto conteúdo informativo e na confiabilidade dos resultados obtidos.

O material para o estudo é soro ou plasma humano. Para pesquisa em uma tira, são necessários 1,5-2 ml de sangue ou 15-25 µl de soro.

Laboratory Diagnostics LLC usa kits de imunotransferência para detectar anticorpos contra patógenos de várias doenças da EUROIMMUN (Alemanha), MIKROGEN (Alemanha):

HSV 1 e HSV 2 IgM/IgG(infecção pelo vírus do herpes)

CMVIgM/IgG(infecção por citomegalovírus)

Rubéola IgG

Perfil IgM TORCH(Toxoplasmose, Rubéola, Citomegalovírus, HSV 1 e HSV 2)

EBV IgMTIgG(Infecção pelo vírus Epstein-Barr)

IgG contra VHC(hepatite viral C)

Dois tipos de conjuntos são usados ​​- Western blot e line blot.

Mancha ocidental: Os kits contêm tiras de membrana de teste com antígenos nativos separados por eletroforese dos agentes infecciosos correspondentes, ou seja, os antígenos são organizados em ordem de peso molecular. 1-2 linhas adicionais com antígenos clinicamente significativos (Western line blot) também podem ser aplicadas às membranas. Este é um método confirmatório confiável, eliminando respostas falsas positivas e reações cruzadas.

Borrão de linha: Neste caso, apenas antígenos clinicamente significativos (nativos, sintéticos ou recombinantes) são aplicados nas membranas das tiras de teste em uma determinada ordem. Esta abordagem é utilizada no diagnóstico diferencial de várias infecções em uma tira.

Sua essência está na transferência de moléculas da substância em estudo de um carreador sólido utilizado no fracionamento de biopolímeros para outro, onde são especificamente identificadas por meio de uma reação imunoquímica. O método moderno e altamente sensível consiste na identificação de proteínas, incluindo antígenos virais. O método é baseado em uma combinação de eletroforese em gel e reação antígeno-anticorpo. Um alto grau de resolução é alcançado através da separação eletroforética de proteínas, glico e lipoproteínas e a especificidade máxima de detecção de soros imunes ou anticorpos monoclonais. Sob condições ideais, o imunotransferência pode detectar o antígeno em quantidades inferiores a 1 ng no volume de teste. Tecnicamente, o immunoblotting é realizado em três etapas:

1) as proteínas a serem analisadas são separadas em gel de poliacrilamida na presença de substâncias desnaturantes: dodecilsulfato de sódio ou ureia, processo muitas vezes denominado SDS-PAGE; proteínas separadas podem ser visualizadas após coloração e comparadas com amostras de referência;

2) as proteínas separadas são transferidas do gel por sobreposição (blotting) para
filtro de nitrocelulose e nele fixado; em muitos casos, mas
As proporções quantitativas de proteínas nem sempre são preservadas durante a transferência;

3) detectores poli ou monoclonais são aplicados aos filtros
anticorpos contendo um radioisótopo ou marcador enzimático; Para
para detectar anticorpos ligados, o ensaio anti-espécie também é usado
soro rotulado, ou seja, na fase final de blotting
semelhante aos imunoensaios em fase sólida.

Deve-se ter em mente que nesta configuração de imunotransferência, as proteínas estão em estado desnaturado e, portanto, podem não ser reconhecidas por anticorpos específicos para a proteína nativa, mas na presença de soros para todos os peptídeos constituintes, todo o espectro antigênico do a proteína de teste é detectada simultaneamente. O imunoblotting é amplamente utilizado em estudos da estrutura dos vírus da hepatite, em particular, para estabelecer a relação antigênica entre cepas individuais. A alta resolução do imunoblotting permite obter bons resultados na prática diagnóstica, quando é necessário identificar o vírus nos tecidos ou excretas de um paciente.

Dependendo da substância em estudo, DNA, RNA e proteína são diferenciados - blotting.

A detecção imunoquímica de antígenos pode ser realizada utilizando anticorpos conjugados a um marcador. Recentemente, isótopos radioativos ou enzimas (peroxidase, fosfatase alcalina, lactamase, etc.) têm sido amplamente utilizados como marcadores.

O tempo de transferência por difusão é de 36 a 48 horas, mas a maneira mais rápida e eficaz de transferir proteínas de géis é a eletrotransferência, que geralmente leva de 1 a 3 horas, para algumas proteínas de alto peso molecular leva mais de 12 horas.

A escolha específica dos sorventes para diversas modificações de blots (nitrocelulose ou papel processado adequadamente), a escolha das condições de bloqueio e detecção imunoquímica de antígenos depende completamente do antígeno, sua quantidade, do método de imunoensaio e dos objetivos do estudo.

A capacidade de detectar anticorpos para antígenos específicos de um patógeno permite avaliar o significado desses anticorpos (especificidade para um determinado agente etiológico) e excluir uma reação a antígenos cruzados. Isso distingue o imunotransferência do ELISA, onde várias combinações de determinantes antigênicos podem ser usadas como antígeno - específicos ou não, causando reações cruzadas com outros patógenos. Noutro caso, se for obtido um resultado positivo no ELISA, só se pode assumir que é consequência de uma reacção cruzada, mas no caso do imunoblotting isto é conclusivo

Por uma série de razões, o método de segurança da informação tornou-se mais difundido como um método adequado para uso como teste de confirmação.

A vantagem indiscutível do método é a possibilidade de testar anticorpos para antígenos fracamente ou completamente insolúveis e eliminar a etapa de introdução de um marcador radioativo nos antígenos.

A sensibilidade no caso do IB é avaliada pela quantidade máxima de antígeno aplicada ao gel, que, durante o fracionamento da proteína, pode ser detectada imunoquimicamente após a transferência do gel para a fase sólida (nitrocelulose). A sensibilidade global do ensaio depende de vários factores: condições de fraccionamento e imobilização do antigénio num transportador sólido, nível de base, especificidade e afinidade dos anticorpos. O tipo de etiqueta utilizada e o método de identificação são importantes.

Assim, o método de imunotransferência permite identificar zonas antigênicas na fase sólida sem ligar toda a proteína a anticorpos séricos específicos. O Immunoblotting e suas modificações são utilizados principalmente para tipagem de antígenos e anticorpos bacterianos e virais, principalmente no caso de resolução insuficiente dos sistemas convencionais, bem como na análise de imunoglobulinas, ácidos nucléicos ou como teste de confirmação em combinação com outros métodos.

Existem grandes dificuldades na interpretação de resultados transversais em reações e em casos de estágios iniciais de soroconversão. Na primeira situação, durante um estudo repetido após um determinado período de tempo, nenhum anticorpo é detectado, mas no segundo imunoblot aparecem novas bandas, indicando o aparecimento de anticorpos para proteínas ou glicoproteínas do HIV, caracterizando a dinâmica de resposta da reação imune a antígenos virais.

Na verdade, é o método de verificação final na cadeia de estudos sorológicos, permitindo tirar uma conclusão final sobre a positividade do paciente para o HIV ou rejeitá-la. Para realizar a IB são utilizadas tiras de nitrocelulose, para as quais as proteínas do HIV são previamente transferidas por imunoforese horizontal e depois vertical em ordem crescente de peso molecular. Os anticorpos nos soros testados interagem com proteínas em certas áreas da tira. O curso posterior da reação não difere daquele do ELISA, ou seja, envolve tratar a tira com um conjugado e substrato cromogênico, lavar os componentes não ligados e interromper a reação com água destilada. A separação eletroforética preliminar de proteínas e sua fixação em nitrocelulose permite identificar anticorpos para proteínas específicas de acordo com a presença (ou ausência) de coloração (azul acinzentado) das zonas correspondentes da tira. O imunoblotting não pode ser utilizado para estudos de triagem em massa devido ao seu alto custo e é um método de arbitragem individual na fase final de um estudo sorológico.

Existe uma correlação bastante clara entre os resultados dos testes séricos em IB e ELISA. Os soros que são duas vezes positivos no ELISA (em diferentes sistemas de teste) são então interpretados no IB como VIH positivos em 97-98% dos casos. Os soros que são positivos no ELISA em apenas um dos dois sistemas de teste utilizados revelam-se seropositivos no IB não mais do que 4% dos casos. Ao realizar estudos confirmatórios, cerca de 5% do IB podem dar resultados ditos “indeterminados”, que, via de regra, correspondem a ELISA positivo, mas não a RIP. Em aproximadamente 20% dos casos, as IBs “indeterminadas” são causadas por anticorpos contra proteínas gag do HIV-1 (p55, p25, p18). Se forem obtidos resultados duvidosos de imunoblotting, o estudo deve ser repetido após 3 meses e se o resultado permanecer incerto, após 6 meses.

Radioimunoensaio (RIM) (Radioimunoensaio, RIA) O radioimunoensaio é um método para a determinação quantitativa de substâncias biologicamente ativas (hormônios, enzimas, medicamentos, etc.) em fluidos biológicos, com base na ligação competitiva das substâncias marcadas com radionuclídeos estáveis ​​​​e semelhantes desejadas com sistemas de ligação específicos. Estes últimos são geralmente anticorpos específicos. Pelo fato do antígeno marcado ser adicionado em certa quantidade, é possível determinar a parte da substância que está ligada aos anticorpos e a parte que permanece não ligada em decorrência da competição com o antígeno não marcado detectado. O estudo é realizado in vitro. Para R. a. produzir conjuntos padrão de reagentes, cada um deles projetado para determinar a concentração de uma única substância. O estudo é realizado em várias etapas: o material biológico é misturado aos reagentes, a mistura é incubada por várias horas, as substâncias radioativas livres e ligadas são separadas, a radiometria da amostra é realizada e os resultados são calculados. O método é altamente sensível, pode ser utilizado no diagnóstico de doenças dos sistemas cardiovascular, endócrino e outros, para determinar as causas da infertilidade, distúrbios do desenvolvimento fetal, em oncologia para determinar marcadores tumorais e monitorar a eficácia do tratamento, para determinar a concentração de imunoglobulinas, enzimas e substâncias medicinais. Em alguns casos, os estudos são realizados no contexto de testes funcionais de estresse (por exemplo, determinação dos níveis de insulina no soro sanguíneo no contexto de um teste de tolerância à glicose) ou em dinâmica (por exemplo, determinação de hormônios sexuais no sangue durante o ciclo menstrual).

Utilizando kit comercial da ABBOTT - Áustria II-I 125, é possível detectar HBsAg em concentrações de até 0,1 ng/ml. As vantagens do método incluem a possibilidade de padronizar e automatizar o método com obtenção de respostas em termos digitais. A desvantagem do método são as limitações determinadas pelo modo de operação com material radioativo e a vida útil relativamente curta do kit de diagnóstico, que está associada à deterioração do rótulo radioativo.

Os kits de diagnóstico para identificar vários antígenos dos vírus da hepatite A, B e D e anticorpos contra eles são produzidos pela Izotop (Tashkent) e por algumas empresas estrangeiras (por exemplo, ABBOTT). Bolas de poliestireno (“EBBOTT”) ou tubos de ensaio (“Isótopo”) são usados ​​como fase sólida. Para marcar anticorpos ou antígenos, o mais utilizado é o isótopo I 125, que tem meia-vida de 60 dias e alta radioatividade específica. A medição de um traçador radioativo, ou seja, radiação, é realizada em contadores especiais - radioespectrômetros. A contagem de pulsos radioativos nas amostras de controle e de teste é realizada em um único horário fixo, geralmente dentro de 1 minuto. Ao analisar os resultados da reação, é necessário levar em consideração a presença de radioatividade de fundo, que pode afetar o resultado final da reação. As razões para o aumento do fundo podem ser: contaminação do recipiente ou ninho da amostra; configurações incorretas do dispositivo; presença de uma fonte de forte radiação próxima ao dispositivo.

Para confirmar um resultado positivo obtido durante a triagem inicial das amostras, recomenda-se repetir o teste com RIA ou um teste alternativo. Se for detectado HBsAg, um teste de confirmação deverá ser realizado.

Tabela 1. Classificação das vacinas

Bibliografia:

Obrigatório:

1. Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorovich I.G. Imunologia: Livro didático.-M.: Medicina, 2000.- 432 p.: Il.(Livro didático para estudantes de universidades médicas).

2. Kovalchuk L. V. e outros Imunologia: workshop: livro didático. manual – M.: GEOTAR-Media, 2012. – 176 p.

3. Pozdeev OK. Microbiologia médica / ed. acadêmico. RAMS V.I. Pokrovsky - M.: GEOTAR-Media, 2001. – 768 p.

4. Borisov L.B. Guia de aulas práticas de microbiologia. M. 1997

Adicional:

1. Genkel P.A., Microbiologia com noções básicas de virologia. M., 1974

2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Microbiologia médica, imunologia e virologia: um livro didático para o mel. universidades.- 3ª edição, revisada. e adicional – São Petersburgo, SpetsLit. 2002. – 591 pág.

3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Microbiologia Médica, Virologia, Imunologia, M., Medicina. 1994

4. Timakov V.D., Levashov V.S., Borisov L.B. Microbiologia. M. 1983

al hipotensão, taquicardia, falta de ar, cianose. Em casos graves da doença, são possíveis sangramentos e vômitos misturados com sangue. O fígado e o baço estão aumentados. Oligúria é observada. A temperatura permanece constantemente alta por 3 a 10 dias. No sangue periférico - leucocitose neutrofílica com desvio para a esquerda. Além das manifestações gerais de peste descritas, desenvolvem-se lesões características de formas clínicas individuais da doença.

A forma cutânea é rara (3–5%). No local da porta de entrada da infecção surge uma mancha, depois uma pápula, uma vesícula (flictena), preenchida por conteúdo seroso hemorrágico, circundada por uma zona infiltrada com hiperemia e edema. Phlyctena é caracterizada por dor intensa. Ao ser aberto, forma-se uma úlcera com uma crosta escura na parte inferior. A úlcera da peste tem um curso longo e cicatriza lentamente, formando uma cicatriz. Se esta forma for complicada por septicemia, ocorrem pústulas e úlceras secundárias. É possível o desenvolvimento de um bubão regional (forma bubônica cutânea).

A forma bubônica é a mais comum (cerca de 80%) e tem curso relativamente benigno. Desde os primeiros dias da doença, surgem dores agudas na região dos gânglios linfáticos regionais, o que dificulta os movimentos e obriga o paciente a assumir uma posição forçada. O bubão primário, via de regra, é único; bubões múltiplos são observados com menos frequência. Na maioria dos casos, os linfonodos inguinais e femorais são afetados e, com menos frequência, os linfonodos axilares e cervicais. O tamanho do bubão varia de uma noz a uma maçã de tamanho médio. As características vívidas são dor aguda, consistência densa, adesão aos tecidos subjacentes, contornos suaves devido ao desenvolvimento de periadenite. O bubão começa a se formar no segundo dia de doença. À medida que se desenvolve, a pele fica vermelha, brilhante e geralmente apresenta uma tonalidade cianótica. No início é denso, depois suaviza, aparecem flutuações e os contornos ficam confusos. No 10º ao 12º dia de doença ele se abre - forma-se uma fístula e ulceração. Com curso benigno da doença e antibioticoterapia moderna, observa-se sua reabsorção ou esclerose. Como resultado da introdução hematogênica do patógeno, podem formar-se bubões secundários, que aparecem posteriormente e são de tamanho pequeno, menos dolorosos e, via de regra, não supuram. Uma complicação grave desta forma pode ser o desenvolvimento de uma forma pulmonar secundária ou séptica secundária, que piora acentuadamente o estado do paciente, levando até à morte.

Pulmonar primário a forma é rara, durante períodos de epidemias em 5–10% dos casos e representa a forma clínica mais grave e epidemiologicamente perigosa da doença. Começa abruptamente, violentamente. No contexto de uma síndrome de intoxicação pronunciada, aparecem tosse seca, falta de ar intensa e dor cortante no peito desde os primeiros dias. A tosse torna-se então produtiva, com produção de expectoração, cuja quantidade pode variar de algumas cuspidas a grandes quantidades, raramente ausente. O escarro, a princípio espumoso, vítreo, transparente, depois adquire aspecto sanguinolento, depois torna-se puramente sanguinolento e contém uma grande quantidade de bactérias da peste. Geralmente tem consistência líquida - um dos sinais diagnósticos. Os dados físicos são escassos: ligeiro encurtamento do som de percussão sobre o lobo afetado; na ausculta não há muitos sibilos finos, o que claramente não corresponde ao estado geral grave do paciente. O período terminal é caracterizado por aumento da falta de ar, cianose, desenvolvimento de estupor, edema pulmonar e ITS. A pressão arterial cai, o pulso acelera e torna-se semelhante a um fio, os sons cardíacos são abafados, a hipertermia é substituída por hipotermia. Sem tratamento, a doença termina em morte dentro de 2 a 6 dias. Com o uso precoce de antibióticos, o curso da doença é benigno e pouco difere

Descrição

Método de determinação Imunoblot.

Material em estudo Soro sanguíneo

Visita domiciliar disponível

Os anticorpos antinucleares são uma família de autoanticorpos que se ligam aos ácidos ribonucleicos e às suas proteínas associadas. Ocorrem em mais de 90% dos pacientes com doenças difusas do tecido conjuntivo e também são frequentemente observados em doenças hepáticas autoimunes e em uma série de outras condições. Até o momento, cerca de 200 variedades dessa família de autoanticorpos foram caracterizadas, mas nem todas podem ser utilizadas na prática clínica.

O imunoblot de anticorpos antinucleares permite estudar simultaneamente 15 tipos principais de anticorpos antinucleares em um teste, o que garante o diagnóstico diferencial das principais doenças reumáticas sistêmicas. Cada tipo de autoanticorpo detectado por imunoblot é geralmente observado em pacientes com quadro clínico característico, portanto o espectro de autoanticorpos permite não só diagnosticar a doença, mas também determinar o risco de desenvolver determinadas manifestações clínicas.

É aconselhável utilizar imunoblot de anticorpos antinucleares na segunda etapa do exame sorológico se o resultado dos demais exames for positivo, indicando a presença de anticorpos antinucleares no soro do paciente. Esses testes incluem a determinação de anticorpos antinucleares (triagem ELISA), detecção de fator antinuclear (ANF) em células Hep2 (), anticorpos antinucleares e anticorpos para antígeno nuclear extraível (ENA).

O método de imunotransferência de anticorpos antinucleares no diagnóstico de doenças reumáticas sistêmicas é caracterizado por alta especificidade clínica. Mas a especificidade dos anticorpos antinucleares, mesmo com altos títulos de ANF (), nem sempre pode ser estabelecida, uma vez que vários antígenos de anticorpos antinucleares ainda permanecem não caracterizados. Um resultado de imunoblot negativo neste caso não exclui o diagnóstico de doenças reumáticas sistêmicas. Vários anticorpos antinucleares podem ser detectados usando imunotransferência - um painel de autoanticorpos específicos para miosite () e imunotransferência - um painel de autoanticorpos para esclerodermia ().

Literatura

1. Lapin S.V. Totolian A.A. Diagnóstico laboratorial imunológico de doenças autoimunes / Editora "Man", São Petersburgo - 2010. 272 ​​​​p.
2. Nasonov E.L., Alexandrova E.N. Padrões modernos de diagnóstico laboratorial de doenças reumáticas. Recomendações clínicas/BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler MJ. Autoanticorpos em doenças autoimunes específicas de órgãos: uma referência diagnóstica/ PABST, Dresden – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler MJ. Autoanticorpos em Doenças Autoimunes Sistêmicas: Uma Referência Diagnóstica/ PABST, Dresden – 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoanticorpos 2ª ed./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Critérios de diagnóstico em doenças autoimunes / Humana Press – 2008. 598 p.
7. Instruções para o kit de reagentes.

Preparação

É preferível esperar 4 horas após a última refeição; não há requisitos obrigatórios.

Indicações de uso

O exame é indicado para diagnóstico e diagnóstico diferencial das seguintes condições:

• lúpus eritematoso sistêmico;
• lúpus cutâneo subagudo e outros tipos de lúpus cutâneo;
• doença mista do tecido conjuntivo;
• Síndrome de Sjögren e doenças associadas;
• esclerodermia difusa e localizada, síndrome CREST;
• miopatias inflamatórias (polimiosite e dermatomiosite);
• artrite crônica juvenil;
• hepatite autoimune;
• cirrose biliar primária e colangite esclerosante;
• a utilização deste teste está indicada quando são detectados títulos elevados de fator antinuclear, anticorpos antinucleares, anticorpos para antígeno nuclear extraível, anticorpos para DNA, anticorpos para nucleossomos e anticorpos antifosfolípides.

interpretação de resultados

A interpretação dos resultados da pesquisa contém informações para o médico assistente e não é um diagnóstico. As informações nesta seção não devem ser usadas para autodiagnóstico ou autotratamento. O médico faz um diagnóstico preciso usando tanto os resultados deste exame quanto as informações necessárias de outras fontes: histórico médico, resultados de outros exames, etc.

Unidades de medida: teste qualitativo, o resultado é apresentado na forma de “detectado” ou “não detectado”.

Quando é detectada uma banda que caracteriza a presença de qualquer tipo de anticorpo, a intensidade da cor da banda é adicionalmente descrita pelo número de sinais de adição (“cruzamentos”) para cada um dos tipos de anticorpos identificados. Um aumento no grau de positividade reflete indiretamente o conteúdo e a afinidade dos autoanticorpos.

Valores de referência: anticorpos para Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, Histona, Nucleossomo , Rib P, AMA-M2, Jo-1 não foram detectados.

O resultado da determinação de autoanticorpos é apresentado em “cruzamentos” para cada antígeno correspondente. Um aumento no grau de soropositividade reflete indiretamente o conteúdo e a afinidade dos autoanticorpos. As opções para o resultado da avaliação de soropositividade são fornecidas abaixo:

1. Nenhum anticorpo foi detectado.
2. +/- - resultado limítrofe;
3. + – baixo teor de autoanticorpos para um antígeno específico;
4. ++ – conteúdo médio de autoanticorpos para um antígeno específico;
5. +++ – alto teor de autoanticorpos para um antígeno específico.

As principais doenças associadas à detecção de anticorpos antinucleares:

Imunoblotting –(do inglês “blot” - spot) - um método para identificar antígenos (ou anticorpos) usando soros (ou antígenos) conhecidos. É uma combinação de eletroforese em gel e ELISA. Inicialmente, as células bacterianas ou vírions são destruídas por ultrassom e, em seguida, todos os antígenos do vírus ou das células bacterianas são separados por eletroforese e um reagente comercial é obtido sobre um filme especial de nitrocelulose. Ao realizar o imunoblotting, o soro do paciente em estudo é aplicado sobre um filme com antígenos conhecidos. Após incubação e lavagem dos anticorpos não ligados, procede-se ao ELISA - anti-soro para imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima e um substrato cromogênico que muda de cor ao interagir com a enzima são aplicados no filme. Na presença de complexos antígeno-anticorpo-anti-soro para complexos imunoglobulina-enzima, aparecem manchas coloridas no transportador. O método de imunotransferência permite detectar separadamente anticorpos para vários antígenos de patógenos (por exemplo, na infecção pelo HIV, o imunotransferência detecta anticorpos para gp120, gp24 e outros antígenos virais).

Radioimunoensaio (RIA)

O método é baseado em uma reação antígeno-anticorpo usando um antígeno ou anticorpo marcado com radionuclídeo. 125I, 14C, 3H, 51Cr e outros radionuclídeos são usados ​​como marcadores. Os complexos imunes resultantes são isolados do sistema e sua radioatividade é determinada em contadores (radiação β). A intensidade da radiação é diretamente proporcional ao número de moléculas de antígeno e anticorpo ligadas.

A versão em fase sólida do RIA usando anticorpos marcados ou antígenos sorvidos nos poços dos painéis de poliestireno é bastante difundida.

O RIA é usado para detectar antígenos de micróbios, vírus, vários hormônios, enzimas, medicamentos, imunoglobulinas, bem como outras substâncias contidas no material de teste em concentrações menores de 10-12–10-15 g/l.

Perguntas de controle

Reação de bacteriólise imunológica: que tipo de reação é; o que é antígeno, o que é anticorpo, mecanismo de reação, métodos de produção, aplicação prática. Reação de hemólise imunológica: ingredientes necessários, procedimento; controles, aplicação prática. Reação de hemólise local em gel (reação de Jerne): princípio da reação, método de formulação, aplicação prática. Reação de fixação do complemento: princípio da reação; o que é formado quando o soro imune interage com um antígeno específico; o que acontece com o complemento se ele estiver presente durante essa interação? Qual será o destino do complemento se não houver afinidade específica entre o antígeno e os anticorpos? Qual reação pode ser usada para determinar o que aconteceu com o complemento; por que esta reação específica é usada; Qual é o resultado positivo visível do RSC? Por que? Qual propriedade do complemento é usada na primeira fase do RSC? Na segunda fase? Se o resultado final do RSC for hemólise, isso significa um resultado positivo ou negativo? Explique os resultados: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Cite os ingredientes do primeiro sistema RSK e os ingredientes do segundo sistema RSK. Por que o soro de teste precisa ser inativado? Como o complemento é titulado? Soro hemolítico: o que contém, como é obtido, qual o título e como é determinado? Quais animais são usados ​​para obter componentes RSC? Metodologia para montagem de RSC no frio. No estadiamento, qual das seguintes reações requer a participação do complemento: precipitação, floculação, aglutinação, detecção de anticorpos incompletos, bacteriólise imunológica, hemólise imunológica, Jerne, RSC? Reação de imunofluorescência (RIF) – indica a sequência de eventos da reação direta de Koons; ingredientes necessários. O que é um antígeno, o que é um anticorpo, com que são marcados os anticorpos, como é levado em consideração o resultado da reação, como é um resultado positivo? Aplicação prática - o que pode ser determinado com esta reação? Reação de imunofluorescência indireta - indicar a sequência de eventos durante essa reação, os ingredientes necessários, qual é o antígeno, quais soros imunes são utilizados; uso pratico; vantagem do RIF indireto em comparação com a reação direta. Ensaio imunoenzimático (ELISA) – princípio de reação; ingredientes necessários; indicar a sequência de eventos ao realizar uma reação para detectar um antígeno no material que está sendo testado; ingredientes necessários; O que acontece quando o resultado é positivo, como fica? Indique a sequência de ações na realização do ELISA para detecção de anticorpos no soro teste; ingredientes necessários; o que acontece se o resultado for positivo? Immunoblotting – princípio de reação; principais etapas; ingredientes necessários; como o resultado é levado em consideração; benefícios da reação. Radioimunoensaio (RIA) – quais as principais etapas da reação; Com o que são marcados os anticorpos ou antígenos, como o resultado é levado em consideração? Microscopia imunoeletrônica - princípio do método; principais etapas; ingredientes necessários; com o que os anticorpos são marcados? como o resultado da reação é levado em consideração. Reações de imobilização – princípio do método, técnica de fixação, componentes, registro de resultados.

Tarefas a serem concluídas durante o processo de auto-estudo.

Preencha a tabela “Reações imunológicas” em relação às reações discutidas neste tópico.

Reações imunológicas

Trabalho do aluno durante uma aula prática

Comece imediatamente o trabalho com a configuração da fase 1 do RSK, mas anote em seu caderno mais tarde (veja abaixo).

1. Reação de hemólise imunológica. Veja uma reação de demonstração da hemólise imunológica, esboce-a na forma de um diagrama, explique o resultado nos tubos experimentais e de controle.

2. Reação de fixação do complemento

a) analisar o RSK conforme tabela;

b) desenhar em um caderno um diagrama da configuração do RSC em forma de tabela;

c) colocar a segunda fase do RSK (a primeira fase é colocada no início da aula);

d) analisar os preparativos diagnósticos necessários ao CRE;

d) levar em consideração o resultado. Formule uma conclusão sobre a presença de anticorpos específicos no soro testado.

3. Reação de imunofluorescência. Estude a tabela, faça um diagrama da reação em seu caderno; observe os soros diagnósticos; determinar o que o soro contém, como é preparado, para qual reação (RIF direta ou indireta) é utilizado. Veja o resultado de demonstração do RIF em um microscópio de fluorescência.

4. Ensaio imunoenzimático (ELISA). Em seu caderno, trace um esquema para configurar uma reação em duas versões: para detectar um antígeno no material em estudo e para detectar anticorpos no soro. Revise o Kit de Ingredientes para HIV e Hepatite B. Identifique o que cada ingrediente contém e para que é usado.

5. Imunoblotting. Faça um diagrama da reação em seu caderno; assista à demonstração - o resultado da reação.

6. Radioimunoensaio (RIA). Faça um diagrama da reação em seu caderno.

7. Microscopia eletrônica imunológica (MEI). Assista à demonstração - o resultado da reação, faça um diagrama da reação em seu caderno, indique com setas o antígeno (vírus) e os anticorpos marcados.

Immunoblotting é um método altamente sensível para detecção de proteínas, baseado em uma combinação de eletroforese e ELISA ou RIA. O imunoblotting é usado como método de diagnóstico para infecção por HIV, etc.

De um modo geral, imunotransferência refere-se à análise de uma mistura de proteínas transferidas para um suporte de membrana sólida, ao qual estão ligadas por ligações covalentes, seguida de imunodetecção.

É possível analisar uma mistura de proteínas aplicadas diretamente ao substrato - análise dot blot - ou após seu fracionamento preliminar por eletrofocagem, eletroforese em disco ou eletroforese bidimensional - análise Western blot.

Os antígenos patogênicos são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, depois transferidos do gel para papel ativado ou membrana de nitrocelulose e revelados por ELISA.

As empresas produzem essas tiras com “manchas” de antígenos. O soro do paciente é aplicado nessas tiras. . Então, após a incubação, o paciente é lavado de anticorpos não ligados e é aplicado soro contra imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima . O complexo formado na tira (antígeno + anticorpo do paciente + anticorpo contra Ig humana) é detectado pela adição de um substrato cromogênico que muda de cor sob a ação de uma enzima.

Esta metodologia também é usada para selecionar clones de bactérias, fagos ou vírus que expressam os produtos genéticos clonados alvo.

A transferência de proteínas para a membrana é realizada passivamente ou por meio de equipamento de eletrotransferência. A eficiência da transferência de proteínas para a membrana é influenciada por muitos fatores, como o peso molecular das proteínas, a porosidade do gel, o tempo de transferência e a composição da solução tampão (trans-tampão) utilizada.

Dependendo dos objetivos e condições do experimento, são selecionadas as condições de transferência que proporcionam os melhores resultados. Nitrocelulose, difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou membranas de náilon carregadas positivamente são comumente usadas como substratos. A nitrocelulose pode ligar até 80-100 μg de proteína por 1 cm2.

Proteínas de baixo peso molecular (com peso molecular inferior a 20 kDa) podem ser perdidas nas lavagens, o que permite estudar preliminarmente o polimorfismo de certos loci genéticos com base nos comprimentos dos fragmentos de restrição de DNA correspondentes.

Além disso, por meio da hibridização Southern, é possível descobrir facilmente se o gene alvo possui um sítio de hidrólise por uma determinada enzima de restrição em sua parte interna, o que permite escolher a estratégia ideal para clonar a região do genoma estudada.

Usando um esquema semelhante, as moléculas de RNA podem ser transferidas de um gel de agarose para um filtro de nitrocelulose. Este método foi chamado de Northern blotting, em oposição a Southern blotting, porque o nome Southern significa "sul" em inglês.

A transferência de proteínas do gel para filtros foi chamada de Western blotting. Proteínas grandes (>100 kDa) desnaturadas em solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) podem ser mal transferidas para a membrana se o etanol estiver presente no tampão trans. O álcool melhora significativamente a transferência de proteínas do gel de SDS-poliacrilamida, mas estreita os poros do gel, o que leva à retenção de proteínas grandes.

A membrana PVDF é otimizada para imunodetecção e é capaz de reter até 160 μg/cm2 de proteínas especificamente ligadas com níveis muito baixos de ligação inespecífica.

Imunoblotting

Uma propriedade importante desta membrana é a possibilidade de seu uso repetido. As membranas de náilon Zeta-Probe ligam-se efetivamente às proteínas SDS na ausência de álcool, e essa ligação é resistente a tratamentos subsequentes. Proteínas de baixo peso molecular também são retidas de forma eficaz. Com uma alta capacidade de ligação de aproximadamente 480 μg de proteína por cm2, as membranas Zeta-Probe permitem a detecção de vestígios de proteína em misturas de teste.

Uma vez imobilizado o antígeno na membrana, os sítios de ligação restantes são bloqueados com soluções de gelatina, albumina sérica bovina ou leite desnatado.

Em seguida, a membrana é incubada em uma solução de anticorpos policlonais ou monoclonais para o antígeno em estudo. Após a lavagem dos anticorpos não ligados, a membrana é incubada em uma solução de anticorpos secundários, que são um conjugado das enzimas fosfatase alcalina (AP) ou peroxidase de rábano (HRP) com anticorpos antiespécies (anticorpos de cabra para imunoglobulinas de coelho, camundongo ou humanas). ) ou proteínas A (proteína de Staphylococcus aureus) ou G (proteína de Streptococcus sp.), possuindo alta afinidade pela região Fc das imunoglobulinas.

A detecção de complexos imunes formados é realizada quimicamente ou quimioluminescentemente. Os substratos para a reação química ao usar conjugados de fosfatase alcalina são 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) ou tetrazólio azul (NBT), e ao usar conjugados de peroxidase de rábano - 4-cloro-1-naftol e peróxido de hidrogênio .

Como resultado de reações enzimáticas, uma faixa ou mancha colorida é formada na membrana no local de localização do complexo antígeno-anticorpo.

A sensibilidade deste método é de 100 pg de proteína quando se utilizam conjugados AP e 100-500 pg quando se utilizam conjugados HRP. A detecção quimioluminescente de complexos imunes permite a detecção de menos de 5 pg de antígeno. O princípio deste método é que quando o HRP reage com o peróxido de hidrogênio e a diacilidrazina luminol cíclica, a luz é emitida no comprimento de onda de 428 nm, que pode ser registrada em um filme fotossensível.

A reação de imunotransferência (IB) foi desenvolvida com base em ELISA. É o método mais específico e sensível de análise imunoquímica. Immunoblotting (do inglês blot - blot, mancha) combina ELISA com eletroforese. É usado para detectar não anticorpos complexos contra o HIV, mas anticorpos para suas proteínas estruturais individuais (proteínas p24, glicoproteínas gp120, gp 41, etc.). Refere-se às reações de especialistas (de confirmação) para o diagnóstico da infecção pelo HIV.

A reação é realizada em várias etapas:

O vírus é destruído em componentes - antígenos (p24, gp120, gp 41, etc.), que são submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida, ou seja, à separação dos antígenos em frações por peso molecular.

2. O gel é coberto por uma membrana de nitrocelulose e as frações de antígeno são transferidas para ele por eletroforese. A nitrocelulose se comporta como papel absorvente. A membrana é cortada em tiras. As empresas produzem essas tiras com “manchas” de antígenos.

Immunoblotting - um método indireto adicional

As tiras revestidas com antígenos do HIV são imersas no soro do sujeito e depois lavadas para remover o material não ligado.

4. As tiras são incubadas com soro antiglobulina marcado com peroxidase e lavadas.

O substrato é adicionado e anota-se o número de frações coloridas (manchas) que correspondem à zona de localização do complexo AG-AT.

A presença de bandas em certas áreas da tira confirma a presença no soro testado de anticorpos para antígenos de HIV estritamente definidos. O resultado do imunoblotting é considerado positivo se bandas correspondentes a quaisquer dois dos três antígenos do HIV - p24, gp41 e gp 120 forem visíveis na membrana (Fig. 37).

DESENHOS

LISTA DE REFERÊNCIAS USADAS

Literatura principal

Microbiologia médica, virologia e imunologia: um livro didático para estudantes de medicina. universidades 2ª ed., rev. e adicional - 702 pág. Ed. A.A. Vorobyova. M.: MIA, 2012.

2. Microbiologia, virologia e imunologia: manual para aulas laboratoriais: livro didático/(V.B. Sboychakov e outros); editado por VB Sboychakova, MM Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 pp.: il.

3. Microbiologia médica, imunologia e virologia [recurso eletrônico]: livro didático sobre mel.

universidades - 760 rublos. — Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. São Petersburgo: Spetslit, 2010.

4. Microbiologia médica, virologia e imunologia [recurso eletrônico]: livro didático: em 2 volumes / Vol. 1. - 448 p. — Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Microbiologia médica, virologia e imunologia [recurso eletrônico]: livro didático: em 2 volumes.T. 2. - 480 p. Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

literatura adicional

1. Reações imunodiagnósticas: livro didático / comp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Editora da Instituição Educacional Orçamentária do Estado de Educação Profissional Superior BSMU do Ministério da Saúde da Rússia, 2016. - 86 p.

2. Características de algumas propriedades que determinam o potencial patogênico de variações cocultivadas de bactérias Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: publicação científica / Yu.Z. Gabidullin, R.S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 seg.

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Imunoblot - o que é isso? Imunoblot no diagnóstico de doenças infecciosas

O que é um imunoblot? Este é um método comum para diagnóstico laboratorial de infecções virais humanas. É uma das formas mais precisas e confiáveis ​​de detectar a presença do HIV.

Em termos de confiabilidade, é ainda maior que o ensaio imunoenzimático (elisa). Os resultados do imunoblot são considerados conclusivos e conclusivos. Informações gerais

Imunoblot - o que é isso? Para reconhecer uma pessoa como portadora do HIV, você deve fazer um exame laboratorial para testar o soro sanguíneo quanto à presença de anticorpos.

As seções de Western blot também são chamadas de Western blots. É usado para detectar infecções virais humanas como um método especializado adicional. Isto é necessário para confirmar o ELISA - um teste laboratorial que permite determinar a presença de anticorpos contra o HIV no sangue. Immunoblot verifica novamente ELISA positivo.

É considerado o mais sensível, complexo e caro.

Alvo

O que é um imunoblot? Este método de teste laboratorial do soro sanguíneo para a presença de anticorpos contra o vírus.

Durante estudos especiais, as proteínas virais totais foram encontradas no gel e nas membranas de nitrocelulose.

Immunoblotting (detecção de anticorpos em soros de pacientes para certos antígenos de patógenos)

O procedimento de corte Western Blot destina-se a determinar a infecção pelo HIV em diferentes estágios. Na primeira etapa, o vírus purificado de suas partes constituintes é submetido à eletroforese e os antígenos nele incluídos são divididos por peso molecular.

O vírus da imunodeficiência humana se reproduz em células vivas incorporadas em sua informação genética. Nesta fase, uma pessoa torna-se portadora do vírus HIV se tiver sido infectada.

A especificidade desta doença é que ela não se manifesta por muito tempo. O vírus destrói os linfócitos, diminuindo assim a imunidade de uma pessoa e o corpo torna-se incapaz de combater infecções.

Se o HIV for tratado correta e prontamente, o paciente viverá até uma idade avançada. A falta de tratamento leva inevitavelmente à morte. A partir do momento da infecção, mas sem tratamento, o período máximo não passa de dez anos.

Peculiaridades

A análise de imunoblot é um método confiável que permite determinar a presença de anticorpos para antígenos do HIV do primeiro e segundo tipos.

Se uma pessoa estiver infectada, após duas semanas os anticorpos poderão ser detectados muito mais tarde. Uma característica especial do VIH é que a quantidade de anticorpos aumenta rapidamente e permanece no sangue do paciente. Mesmo que estejam presentes, a doença pode demorar dois ou mais anos para se manifestar. O método ELISA nem sempre indica com precisão a presença da doença, sendo necessária a confirmação dos resultados dos cortes de PCR e Western blot caso o imunoensaio enzimático apresente resultado positivo.

Indicações para

Que tipo de “immunoblot” já foi descoberto, mas qual está sendo introduzido no estudo?

O motivo do teste para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) será um resultado ELISA positivo. É necessária a realização de ensaio imunoenzimático em pacientes que serão submetidos a cirurgia. Além disso, você deve fazer uma análise das mulheres que planejam engravidar, bem como daquelas que são promíscuas. Seções de Western blot são prescritas para pacientes com infecção por HIV se os resultados do Elisa forem ambíguos.

Os seguintes sintomas alarmantes podem ser o motivo para consultar um médico: rápida perda de peso; fraqueza, perda de função; distúrbios intestinais (diarréia), que dura três semanas; desidratação; febre; aumento dos gânglios linfáticos no corpo; desenvolvimento de candidíase, tuberculose , pneumonia, toxoplasmose, exacerbação de herpes.

O paciente não precisa se preparar antes de doar sangue venoso.

Não coma 8 a 10 horas antes do teste. Na véspera da doação de sangue, não é recomendado ingerir bebidas alcoólicas ou café, praticar exercícios físicos intensos ou sentir ansiedade.

Onde fazer a análise?

Onde posso fazer o teste de HIV?

ELISA, análise de imunoblot, realizada em clínicas privadas da cidade, dá resultados em um dia. O diagnóstico urgente também é possível. Nas instituições públicas, os exames médicos Elisa e Western blot são gratuitos, de acordo com a legislação da Federação Russa.

Triagem obrigatória de doenças infecciosas em gestantes e pacientes que necessitam de internação ou cirurgia. Como é feito esse exame?

Como realizar o ELISA? Immunoblot positivo/negativo confirma ou refuta os resultados do elisa. O procedimento é bem simples. O especialista coleta sangue venoso, o que leva menos de cinco minutos.

Após a amostragem, o local da injeção deve ser desinfetado e coberto com um curativo. A amostragem é feita com o estômago vazio, portanto após o procedimento não fará mal nenhum comer uma barra de chocolate amargo ou uma bebida doce quente.

Para receber encaminhamento para um teste gratuito em uma instituição médica pública, você deve consultar um terapeuta.

Em geral, o imunoblot não difere dos demais exames de sangue pela coleta. A metodologia de pesquisa é simples. Se um vírus estiver presente no sangue de uma pessoa, o corpo começa a produzir anticorpos para destruí-lo. Para cada vírus existem muitos antígenos proteicos. A detecção destes anticorpos é a base do método de secção Western blot. Preço

Quanto tempo dura a análise? O imunoblot do HIV é um dos testes mais baratos.

Em média, os métodos de triagem por imunoensaio variam de 500 a 900 rublos. As seções de Western Blot são o estudo de testes, cujo custo varia de três a cinco mil rublos. Métodos mais complexos são muito mais caros. Por exemplo, para análise da reação em cadeia da polimerase (PCR), você precisará pagar cerca de 12.000 rublos.

interpretação de resultados

Os métodos mais comuns para diagnosticar a infecção pelo HIV são o ensaio imunoenzimático e o imunotransferência.

Eles são usados ​​para determinar anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana no soro. A infecção geralmente é confirmada por dois testes: de triagem e confirmatório. Os resultados devem ser interpretados por um médico, que diagnostica e prescreve o tratamento. Se o imunoblot for positivo, significa que existe um vírus no corpo humano.

Um resultado positivo não deve ser motivo para tratamento independente, pois cada paciente pode ter seu quadro da doença.

A análise qualitativa inclui triagem e certificação. Se o vírus não for detectado no paciente, o resultado é “negativo”. Quando este certificado é detectado, são realizados estudos de triagem adicionais. Análise de imunoblot, que confirma ou refuta a triagem. Se as tiras de teste aparecerem em certas áreas escuras (localização de proteínas), é feito um diagnóstico de HIV.

Se os resultados forem duvidosos, os testes são realizados no prazo de três meses.

É possível prevenir a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana se seguir algumas regras: evitar contato sexual casual, usar preservativo durante o contato, não usar drogas.

Caso a doença seja detectada em gestante, é importante seguir as recomendações do médico assistente e não se esquecer de fazer o teste para a presença do vírus.

O que é Western blotting?

A identificação de proteínas em misturas complexas ou extratos de vários tecidos é um dos problemas frequentemente encontrados. Utilizando uma ferramenta como anticorpos específicos, é possível determinar a proteína em estudo com um mínimo de tempo e custos financeiros.

No método Western blotting, na primeira etapa, uma mistura de proteínas é separada por eletroforese na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) e depois transferida para uma membrana de nitrocelulose por eletrotransferência.

A essência deste método é que após a eletroforese o gel é colocado sobre uma membrana de nitrocelulose entre camadas de papel de filtro. O “sanduíche” assim montado é colocado em um campo elétrico para que os complexos proteína-SDS se movam através da placa de gel e sejam imobilizados (como resultado da sorção inespecífica) na superfície da membrana de nitrocelulose.

A ligação do complexo proteína-SDS à membrana de nitrocelulose envolve principalmente forças de natureza elétrica, e essa interação é multiponto e leva ao “espalhamento” de proteínas na superfície da membrana. Assim, após a eletrotransferência, obtemos uma réplica de um gel sobre nitrocelulose com proteínas localizadas da mesma forma que em um gel de poliacrilamida.

Após eletroforese SDS, eletrotransferência e sorção de proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose, a conformação terciária da proteína é bastante alterada, se for geralmente correto falar sobre a existência de uma estrutura terciária para a proteína após um tratamento tão severo. Portanto, para detecção imunoquímica da proteína em estudo, normalmente são utilizados apenas anticorpos mono ou policlonais específicos para regiões lineares da molécula proteica.

51. Imunoensaio enzimático, imunotransferência. Mecanismo, componentes, aplicação.

Os anticorpos específicos para epítopos conformacionais (ou regiões que envolvem contactos intersubunidades) geralmente não são adequados para utilização em Western blotting.

Após a transferência da proteína, a membrana é incubada sequencialmente com anticorpos específicos para a proteína em estudo e, em seguida, com anticorpos secundários específicos para os fragmentos Fc dos anticorpos primários, conjugados com um marcador enzimático (ou algum outro) (Fig.

1A). No caso em que os anticorpos primários específicos do antígeno em estudo são conjugados diretamente ao marcador, não são necessários anticorpos secundários (Fig. 1 B). Os complexos imunológicos formados no local de localização da proteína em estudo são “manifestados” por meio de um substrato cromogênico (dependendo do tipo de marcador).

A sensibilidade e especificidade do método dependem muito de quais anticorpos são utilizados na pesquisa.

Os anticorpos utilizados devem ser específicos para uma sequência de aminoácidos única, característica apenas da proteína em estudo. Caso contrário, é possível a interação (especialmente no caso de extratos de proteína bruta) de anticorpos com diversas moléculas de proteína, o que por sua vez levará ao aparecimento de várias faixas coloridas na membrana.

A identificação da proteína em estudo neste caso é muitas vezes difícil ou mesmo impossível.

O segundo fator importante a ter em mente ao escolher os anticorpos é a afinidade. Quanto maior a afinidade dos anticorpos utilizados, mais brilhantes e claras são as bandas de proteína coradas e maior a sensibilidade do método. Ao usar anticorpos de alta afinidade, pode ser alcançada uma sensibilidade de 1 ng ou até mais.

Para visualizar o resultado da interação entre um antígeno ligado à membrana e anticorpos, são utilizados anticorpos secundários, conjugados com agentes capazes de produzir determinado sinal sob determinadas condições.

Normalmente, uma enzima (peroxidase ou fosfatase) é usada como tal agente, cujo produto de reação é colorido e precipita na membrana na forma de um precipitado insolúvel.

Também é possível usar rótulos fluorescentes neste método.

Arroz. 1. Esquema de coloração imunoquímica da proteína em estudo: A - utilizando anticorpos secundários conjugados a um marcador enzimático; B - o anticorpo primário é conjugado diretamente a um marcador enzimático.

Protocolo:

I. Preparação de gel e membrana e eletrotransferência de proteínas

Após electroforese, o gel de poliacrilamida é colocado num banho com tampão de transferência (Tris 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, etanol a 10%).

Duas folhas de papel filtro, cortadas no formato do cassete absorvente e umedecidas com tampão absorvente, são colocadas na parte do cassete que ficará voltada para o ânodo. Em seguida, uma membrana de nitrocelulose pré-umedecida com o mesmo tampão é colocada sobre o papel filtro, certificando-se de que não haja bolhas de ar entre a membrana e o papel.

O gel deve então ser cuidadosamente colocado sobre a membrana, prestando novamente especial atenção para garantir que não existem bolhas de ar entre o gel e a membrana. A formação do sanduíche é completada por duas camadas de papel filtro umedecido, que são colocadas na superfície do gel (Fig. 2). O sanduíche resultante é preso em um cassete e colocado entre os eletrodos de forma que a membrana fique voltada para o ânodo.

Arroz. 2. Esquema de eletrotransferência de proteínas para a membrana.

II. Transferência elétrica

A eletrotransferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose é realizada em um tampão contendo Tris 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, etanol a 10% por 30-50 min a uma voltagem constante de 100 V.

O tempo de eletrotransferência depende do tamanho das proteínas que estão sendo transferidas; quanto maior a proteína, mais tempo leva a eletrotransferência. A qualidade da eletrotransferência e a localização das bandas proteicas são avaliadas através da coloração da membrana de nitrocelulose com uma solução de Ponceau S a 0,3% em ácido acético a 1%. Antes da coloração imunoquímica, a membrana deve ser lavada várias vezes com uma solução aquosa fracamente alcalina de Tris para remover o corante ligado às proteínas.

III. Coloração imunoquímica de proteínas imobilizadas em uma membrana de nitrocelulose

Para bloquear locais de ligação inespecífica de anticorpos, a membrana é incubada com agitação constante à temperatura ambiente por 30 minutos em PBST (para melhor bloqueio, pode-se usar uma solução de PBST contendo 10% de leite em pó desnatado).

Após o bloqueio, a membrana é incubada durante uma hora à temperatura ambiente com agitação constante em PBST contendo 1-10 μg/ml de anticorpos específicos.

A concentração ideal de anticorpos é selecionada empiricamente e depende da afinidade de interação dos anticorpos com o antígeno.

No final da incubação, lave a membrana 5 vezes com PBST e transfira-a para uma solução de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. A diluição do conjugado geralmente é indicada pelo fabricante na embalagem, ou é selecionada empiricamente pelo pesquisador. Incubar a membrana na solução de anticorpo secundário durante 1 hora com agitação constante.

Após lavagem completa (trocar o tampão pelo menos 5-6 vezes), a membrana PBST é transferida para uma solução de substrato cromogênico contendo 3 mg de diaminobenzidina (DAB) e 10 μl de peróxido de hidrogênio a 30% em 10 ml de Tris-HCl 0,1 M , pH 7,6.

A incubação é realizada com agitação durante 5 a 10 minutos. Após a conclusão da incubação com o substrato, a membrana deve ser lavada com PBST, seca com papel filtro e uma cópia eletrônica deve ser feita imediatamente por digitalização colorida. Se a membrana secar completamente, as listras de proteína pintadas desbotam e a imagem fica menos brilhante e contrastante.

Nota: DAB é tóxico e potencialmente cancerígeno. Trabalhe apenas com luvas de borracha!

O imunoblot do HIV detecta anticorpos contra proteínas virais colocadas em uma membrana especial de nitrocelulose. Este é um estudo de alta precisão que identifica a presença de frações nas quais as principais proteínas estão localizadas na forma de pequenas bandas.

O envelope do vírus HIV-1 contém glicoproteínas com peso molecular variando de 41 kDa a 160 kDa (quilodaltons). De grande importância para o imunotransferência é a glicoproteína do HIV-2 com peso molecular de 32 kd a 140 kd. As proteínas centrais do HIV-1 e as enzimas virais são representadas pelas proteínas p17, p24, p55.

O agente causador do HIV-2 consiste em proteínas designadas p16, p25, p56. Eles formam sua concha interna. O genoma inclui 6 genes regulatórios e 3 estruturais. Muitas vezes, durante a divisão celular, surgem imprecisões genéticas e aparecem vários subtipos do patógeno.

Testes positivos

Para eliminar erros no diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV, é prescrito ao paciente um exame adicional. Seus resultados são considerados positivos se forem detectados anticorpos para 2 ou 3 proteínas do HIV-1 ou HIV-2.

Immunoblot confirma todos os bons resultados de ELISA. Nesse caso, são detectados anticorpos para gp120/160, gp41 ou p24, que são unidades estruturais dos três principais genes da AIDS - gag, pol e env. Em alguns pacientes com resultados negativos de ELISA e PCR, o imunoblot mostra várias listras positivas. O médico prescreve um teste p24 adicional para fazer um diagnóstico correto e excluir a fase inicial da infecção pelo HIV.

Se os resultados obtidos forem duvidosos, o paciente é solicitado a repetir o teste nos próximos 3 meses. Quase todos os casos de HIV são confirmados por meio de um sistema de imunoblotting - um dispositivo Sanofi. Na maioria dos casos, são detectados antígenos do HIV, proteínas p25, gp110/120 e gp160, indicando infecção pelo vírus. Um teste falso positivo é registrado em pacientes que sofrem de doenças do tecido conjuntivo com níveis elevados de bilirrubina ao interagir com vários antígenos virais.

Resultado negativo

Se faltarem linhas positivas correspondentes às proteínas do vírus da AIDS, o imunoblot é interpretado como resultado negativo. A análise confirma claramente a ausência de infecção pelo vírus da imunodeficiência ou indica um “período de janela”. Se o imunoblot der resultado negativo, a pessoa não é portadora do vírus da AIDS.

Amostras de soro sanguíneo de pacientes infectados pelo HIV são coletadas para o estudo. Eles são armazenados congelados a -20°C. A análise é realizada usando sistemas de teste:

• Antígeno;
• HIV-recombinante;
• Peptoscreen.

O registro de um resultado negativo indica a ausência de anticorpos para as glicoproteínas do envelope do HIV gp120, gp160, Sp41 no soro.

Freqüentemente, um paciente está interessado em saber se um paciente que tem um parceiro sexual infectado pode ter um resultado de imunotransferência negativo para HIV. Após o estudo, muitas vezes é obtido um resultado questionável ou são detectados anticorpos para as proteínas gp120 e gp160, o que indica uma completa ausência de dados negativos. Às vezes, uma resposta questionável é registrada em pacientes com infecção assintomática.

Resultados não interpretáveis

Os testes realizados utilizando vários testes de anticorpos do VIH são por vezes negativos e não cumprem os critérios de seropositividade. É difícil para um médico determinar a causa de um resultado questionável.

Alguns pacientes não correm risco de infecção pelo HIV. O médico pode cometer erros na interpretação dos resultados do teste se a infecção for causada por um sorotipo diferente.

O soro sanguíneo do paciente deve ser examinado ao longo do tempo. Se nenhuma manifestação clínica de AIDS for observada dentro de 6 meses e não houver fatores de risco, o paciente será registrado como não tendo infecção.

Resultados de testes questionáveis ​​são obtidos em pacientes com baixo risco de infecção. Em alguns casos, o aparecimento de dados pouco claros é causado por complexos imunes e autoanticorpos contidos no soro sanguíneo.

Em alguns pacientes, a ocorrência de resultados duvidosos é causada pelo desenvolvimento de processos patológicos:

• doenças infecciosas;
• tumor cancerígeno;
• reação alérgica.

O paciente apresenta alterações no exame clínico de sangue, aumento da proteína C reativa ou aumento da VHS. Em pessoas que sofrem de doenças infecciosas, é frequentemente detectada uma reação questionável de imunotransferência ao HIV.

Pacientes com resultados indeterminados não podem doar sangue e materiais biológicos.

Método linear

O princípio do imunotransferência inclui:

1. Utilização de substância viral nativa em formato HIV ou antígenos em formato Western Blot.
2. A combinação de proteínas do HIV com anticorpos individuais detectados no soro sanguíneo.
3. O processo de incubação que ocorre com a adição de anticorpos marcados à Ig humana.
4. Interpretação de listras coloridas.

A análise permite ao médico interpretar oportunamente os resultados do estudo. Uma mancha positiva é decifrada como 2ENV+/- GAG+/POL, indeterminada - 1 ENV+/- GAG+/POL. Um resultado negativo significa que não há estrias.

Para realizar a análise, são utilizados imunotransferências recombinantes e lisadas. O estudo é específico e tem 99,5%.

Os pacientes se perguntam se o resultado do teste pode ser interpretado como falso. Os dados obtidos podem ser gerados a partir da estimulação das defesas do organismo (gravidez, hemodiálise). Se houver suspeita de síndrome retroviral aguda e for recomendado contato com paciente infectado pelo HIV, recomenda-se que o paciente doe soro para reação de PCR. A repetição dos testes sorológicos é confirmada pela medição da carga viral na amostra de material biológico submetida.

Diagnóstico de HIV em recém-nascidos

Um teste de AIDS em uma criança pequena é realizado se for estabelecido contato com uma mãe infectada pelo HIV. As reações sorológicas podem ser positivas por 1,5 anos. Os anticorpos no soro sanguíneo de um recém-nascido são detectados por meio de ELISA, RIF e reações de imunotransferência.

Durante os 9 meses de vida de uma criança, surge um resultado positivo devido à presença de anticorpos maternos no soro sanguíneo. O antígeno p24 tem especificidade de cerca de 65%. Em alguns casos, não é possível detectar anticorpos em uma criança doente se ela for diagnosticada com baixos níveis congênitos de globulinas no sangue. Um resultado de imunotransferência negativo estabelecido não garante a ausência de infecção.

O teste é realizado em várias etapas:

• 1-2 dias após o nascimento;
• aos 1-2 meses;
• aos seis meses de idade.

Estudos adicionais de anticorpos são realizados até que 2 resultados negativos de imunotransferência sejam obtidos. O diagnóstico de AIDS em uma criança nascida de uma mulher infectada pelo HIV é possível com base em 2 resultados positivos de PCR. A transmissão do patógeno HIV a um recém-nascido é excluída se a mulher não amamentar.

Teste de gravidez

A gestante recebe prescrição de imunidade e line blotting se um resultado positivo para HIV for obtido por ELISA. Se a mancha for confirmada, o paciente tem AIDS. Nesse caso, a partir da 14ª semana de gestação, é prescrita terapia para prevenir a infecção da criança.

Um especialista pode cometer um erro ao realizar um exame de soro sanguíneo durante a gravidez, as pacientes perguntam ao médico assistente. Ele é obrigado a entregar à gestante cópias dos testes PCR e ELISA para eliminar dúvidas sobre sua confiabilidade.

Às vezes surgem problemas ao realizar o imunoblotting, mas se o ELISA, o blot e o PCR forem positivos, o diagnóstico de infecção pelo HIV é finalmente confirmado. A probabilidade de receber um teste falso positivo durante a gravidez é alta. Se o ELISA for (+) e o imunoblot for (-), a mulher é solicitada a refazer o soro sanguíneo.

O cartão de troca da gestante indica o resultado do estudo. Se o valor for positivo, a mulher está proibida de alimentar o filho após o parto, para não infectá-lo com o vírus da AIDS. As conclusões finais são tiradas com base em estudos laboratoriais, clínicos e epidemiológicos. Somente após decifrá-los o paciente é diagnosticado com infecção pelo HIV.

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