A reação de hemaglutinação indireta ou passiva (RNHA ou RPHA) é mais sensível e específica que a reação de aglutinação. Esta reação também é usada em duas direções.

1) Para detectar anticorpos no soro sanguíneo do paciente, são utilizados diagnósticos de eritrócitos, nos quais o antígeno é adsorvido na superfície dos eritrócitos tratados com tanino. Em relação a esta reação, o termo RPHA é mais utilizado.

O soro de teste é diluído nos poços de placas de plástico e adicionado diagnóstico de eritrócitos. Com uma reação positiva, surge uma película fina nas paredes do poço em forma de "guarda-chuva de renda", com uma reação negativa, surge um denso sedimento de eritrócitos em forma de "botão".

2) Para detectar toxinas e antígenos bacterianos no material de teste, são utilizados diagnósticos de eritrócitos de anticorpos, obtidos por adsorção de anticorpos em eritrócitos. Em relação a esta reação, o termo RNGA é mais utilizado. Por exemplo, com a ajuda de diagnósticos de anticorpos, são detectados o antígeno do bacilo da peste, exotoxina diftérica, exotoxina botulínica.

Reação de Coombs (teste de aptiglobulina)

A reação é usada para detectar anticorpos incompletos, por exemplo, anticorpos para o fator Rh. O soro teste é adicionado aos eritrócitos Rh +, nos quais se espera a presença de anticorpos incompletos para o fator Rh. Aderidos aos eritrócitos, os anticorpos incompletos não causam aglutinação, pois possuem apenas um centro ativo. Em seguida, adicione soro antiglobulina contendo anticorpos para globulinas humanas. Quando combinado com anticorpos incompletos, o soro antiglobulina causa aglutinação eritrocitária.

reação de precipitação

A essência da reação é a precipitação (precipitação) do antígeno sob a ação de anticorpos específicos. A presença de um eletrólito é necessária para obter uma reação visível. O antígeno na reação de precipitação são substâncias molecularmente dispersas.

Reação de precipitação do anel colocados em tubos de precipitação estreitos. O soro imunológico é colocado no tubo de ensaio e o material de teste é cuidadosamente colocado em camadas sobre ele. Na presença de um antígeno nele, um anel opaco de precipitado é formado no limite de dois líquidos.

A reação é utilizada na medicina forense para determinar as espécies de proteínas em manchas de sangue, sêmen, etc.; determinar o antígeno no diagnóstico de antraz (reação de Ascoli), meningite e outras infecções; em estudos sanitários e higiênicos - para estabelecer a falsificação de produtos alimentícios. Os soros de precipitação imune são obtidos pela imunização de animais com o antígeno apropriado. Por exemplo, a proteína humana que precipita no soro é obtida pela imunização de um coelho com proteína humana. O título do soro precipitante é a maior diluição do antígeno com o qual ele reage. O soro geralmente é usado não diluído ou diluído 1:5.

Reação de precipitação em gel de ágar realizada de várias maneiras. Esta é uma reação de imunodifusão dupla, uma reação de imunodifusão radial, uma reação de imunoeletroforese.

Reação de imunodifusão dupla(de acordo com Ouchterlony). O gel de ágar derretido é despejado em uma placa de Petri e, após a solidificação, são cortados poços. O antígeno é colocado em alguns poços, os soros imunes são colocados em outros, que se difundem no ágar, formando um precipitado em forma de listras brancas no ponto de encontro.

Reação de imunodifusão radial(segundo Mancini). O soro imunológico é adicionado ao gel de ágar derretido, despejado em um prato. Após a solidificação do ágar, são cortados poços e neles colocados antígenos que, difundindo-se no ágar, formam zonas de precipitação anular ao redor dos poços. Quanto maior a concentração de antígeno, maior o diâmetro do anel. A reação é usada, por exemplo, para determinar várias classes de imunoglobulinas no sangue. As imunoglobulinas das classes IgG, IgM, IgA atuam como antígenos nessa reação, e os anticorpos contra elas estão contidos em soros monorreceptores específicos.

Imunoeletroforese. A eletroforese de antígenos proteicos é realizada em gel de ágar. O soro precipitante é introduzido no sulco, que corre paralelo à direção do movimento das proteínas. Antígenos e anticorpos se difundem no ágar, e linhas de precipitação se formam em seu ponto de encontro.

Reações de lise imune

Um antígeno (eritrócitos ou bactérias), combinado com anticorpos específicos, forma um complexo imune, ao qual o complemento (C1) está ligado, e a ativação do complemento ocorre pela via clássica. O complemento ativado lisa os glóbulos vermelhos (hemólise) ou bactérias (bacteriólise). A reação de bacteriólise é usada para identificar o Vibrio cholerae.

reação de hemólise. O antígeno na reação são os eritrócitos, os anticorpos (hemolisinas) estão contidos no soro hemolítico. As hemolisinas ligam-se aos eritrócitos, ocorre a ativação do complemento, que lisa os eritrócitos. Uma suspensão turva de eritrócitos se transforma em um líquido transparente vermelho brilhante - “sangue de laca”. Como a reação de hemólise ocorre apenas na presença de complemento, ela é usada como um indicador para a detecção de complemento.

Reação de hemólise local em gel(reação de Jerne) - uma variante da reação de hemólise. Serve para determinar o número de células formadoras de anticorpos (AFC) no baço e nos gânglios linfáticos.

O gel de ágar derretido é misturado com uma suspensão de células do baço e eritrócitos e, após a solidificação do ágar, adiciona-se o complemento. Ao redor de cada célula que produz hemolisinas, forma-se uma zona de hemólise. O número de tais zonas determina o número de células produtoras de hemolisinas.

A reação de hemaglutinação indireta (RIHA)

O uso de preparações diagnósticas adsorvidas é baseado no princípio de reconhecimento imunológico de estruturas de superfície que é constantemente implementado na natureza. Desse ponto de vista, não há diferenças fundamentais entre o uso, por exemplo, de uma célula microbiana ou de um carreador artificial carregado de antígeno (anticorpos). Vários transportadores são usados ​​​​como base de preparações sorvidas - células microbianas, eritrócitos, látex, bentonin, colesterol, Sephadex, dermatol, carvão ativado, esporos de fungos, etc.

Após o trabalho de A.T. Kravchenko (1945), os eritrócitos privados de viabilidade e fixados com vários reagentes químicos tornaram-se mais amplamente utilizados como portadores de antígenos ou anticorpos. Com base no princípio do uso de eritrócitos (nativos e fixos) como portadores do antígeno, a reação de hemaglutinação indireta (passiva) tornou-se generalizada.

A sugestão de usar a reação de hemaglutinação indireta (AIH) para fins diagnósticos surgiu com base no conhecimento previamente desenvolvido sobre a alta atividade de sorção de eritrócitos. Em comparação com muitos outros portadores de antígenos e anticorpos, os eritrócitos apresentam certas vantagens na reação de hemaglutinação indireta. Primeiro, em soluções salinas isotônicas, eles formam uma coesão bastante estável e não se acomodam em pouco tempo. Em segundo lugar, os glóbulos vermelhos da mesma espécie animal são do mesmo tamanho. E, finalmente, erythrocytes relativamente facilmente diretamente ou em consequência do processamento especial anexam vários componentes serologichesky ativos.

A criação de diagnósticos de eritrócitos a partir de eritrócitos estabilizados permite superar as dificuldades que surgem ao usar eritrócitos nativos.

No estudo de eritrócitos tratados com vários fixadores, algumas de suas propriedades comuns foram estabelecidas:

Na morfologia, praticamente não diferem dos frescos;

Não hemolisado em soluções hipotônicas, em água e após congelamento-descongelamento;

Pode ser liofilizado;

Suas estruturas de superfície retêm a capacidade de serem modificadas quimicamente (por exemplo, tanino, compostos diazo) e reagir com antígenos e anticorpos.

O principal critério de qualidade dos eritrócitos fixados é a possibilidade de seu uso para obtenção de preparações sensibilizadas na ausência de aglutinação inespecífica em líquidos estabilizantes.

A preparação da superfície dos eritrócitos para aumentar a capacidade de sorção de antígenos é importante na concepção de preparações de diagnóstico. Especialmente difundido é o tratamento de eritrócitos com tanino.

Sob sua influência, as propriedades antigênicas dos eritrócitos (permeabilidade, taxa de sedimentação) mudam, sua resistência aos efeitos hemolíticos de certos ácidos graxos aumenta. No entanto, o principal é alcançado - os eritrócitos tanizados têm uma capacidade de absorção de proteínas muito maior, que atualmente é amplamente utilizada na fabricação de diagnósticos antigênicos e de anticorpos de alta qualidade.

Juntamente com a tanização de eritrócitos, para a fabricação de diagnósticos de eritrócitos e preparação de um carreador de antígeno, são utilizados reagentes químicos como bromelaína, triopsina e periodato de potássio, que também modificam as membranas dos eritrócitos.

Depois de preparar a superfície dos eritrócitos, ocorre o processo mais importante - o processo de hemossensibilização - a etapa final na fabricação de diagnósticos de eritrócitos.

Para fortalecer a conexão entre o transportador e o antígeno, são utilizadas várias substâncias conjugadas - bisdiazobenzidina, difluorodinitrobenzina, cloreto de cianeto, cloreto de cádmio e ácido acético, cloreto de bromo, formaldeído, glutaraldeído, brometo de cianogênio, rivanol, amidol, etc.

O uso de substâncias conjugantes ajuda a eliminar as deficiências que apresentam os eritrócitos tanizados usados ​​para sensibilização sem substâncias conjugadas.

As substâncias de conjugação mais amplamente utilizadas são cloreto de cromo, glutaraldeído, negro de diazol C e amidol. O processo de sensibilização com cloreto de cromo ocorre muito rapidamente - de 4 a 10 minutos, o que chama a atenção dos pesquisadores. Neste caso, são utilizadas concentrações de cloreto de cromo de 0,05 a 2%, o pH não é inferior a 5,0 a uma temperatura da mistura de reação de 20-250 C. No processo de sensibilização com cloreto de cromo, grupos carboxila de proteínas da membrana eritrocitária são ativados. Como resultado, uma ligação covalente é formada entre a membrana do eritrócito e a sensitina.

A reação de hemaglutinação indireta tem alta especificidade, pois a aglutinação de eritrócitos ocorre como resultado da interação do antígeno com anticorpos adsorvidos nos eritrócitos. Sua característica distintiva é a alta sensibilidade: 0,02-0,05 μg de proteína de anticorpo é detectada nele. Em termos de sensibilidade, supera significativamente as reações de imunodifusão, imunofluorescência, imunodifusão radial, fixação de complemento e neutralização. RNGA é menos sensível do que os métodos de radioimunoeletroforese, determinação da quantidade de proteína de anticorpos radioativos no imunossorvente, imunoensaio enzimático.

As vantagens do RNGA incluem reprodutibilidade suficientemente alta, facilidade de implementação e necessidade de quantidades mínimas de ingredientes, especialmente ao usar o micrométodo.

Nos últimos anos, o RNHA encontrou ampla aplicação no diagnóstico de rinotraqueíte infecciosa, diarreia, infecção por adenovírus, infecção por rota e coronavírus, parainfluenza-3 e infecção sincicial respiratória.

Damos um exemplo da fabricação e uso de um diagnóstico de eritrócitos para a detecção de anticorpos para infecções por rota e coronavírus.

O método de preparação de diagnósticos de anticorpos para a detecção de antígenos rota e coronavírus em RNGA é o seguinte: obtenção de uma suspensão de eritrócitos; fixação de suas acroleínas; tanização, que permite obter sorção estável da proteína necessária nos eritrócitos; sensibilização de eritrócitos tanizados com imunoglobulinas; determinação da especificidade do diagnóstico preparado. A preparação de uma suspensão de eritrócitos é realizada colocando o sangue de um carneiro clinicamente saudável em um frasco com esferas de vidro. Após a desfibrinação do sangue, os eritrócitos devem ser lavados 3-5 vezes com solução isotônica (0,9%) de cloreto de sódio por centrifugação por 15-20 minutos a 400g.

Para estabilizar os glóbulos vermelhos, eles são tratados com acroleína. Como você sabe, sua ação é um pouco mais suave que o formaldeído e fornece estabilidade e maior atividade dos eritrócitos. Para isso, volumes iguais de uma suspensão de eritrócitos a 10% são misturados a uma solução de acroleína a 0,2% preparada em solução tampão fosfato (PBS) com pH de 7,2. A suspensão resultante é mantida por 30 min a 37°C, misturando bem, seguido pela liberação de acroleína por centrifugação repetida por 5 min a 600-800g até que o odor específico desapareça completamente. A vantagem dos eritrócitos assim preparados é que são colhidos para o futuro, podem ser armazenados por muito tempo sem sofrer hemólise.

Posteriormente, eritrócitos estabilizados em concentração de 10% são mantidos a 2-4 °C em PBS com pH de 7,2 por dois meses.

Para aumentar a capacidade de sorção e sedimentação dos eritrócitos, é necessário tanizá-los misturando partes iguais de uma suspensão de 10% de eritrócitos lavados e uma solução de tanino em PBS e pH 7,2 na diluição de 1:30.000. A mistura é bem misturada e mantida a 370 C por 15 min, após o que os eritrócitos são completamente lavados do tanino duas vezes em PBS com pH 7,2 e três vezes com solução isotônica de cloreto de sódio com pH 7,2-7,4.

O momento ideal para garantir o recebimento de diagnósticos de eritrócitos de alta qualidade é sua sensibilização dentro de 24-48 horas após o tratamento com tanino.

No processo de confecção dos diagnósticos, utiliza-se como solvente e conservante solução isotônica de cloreto de sódio fenolizado a 0,3% com soro normal de coelho ou cavalo a 0,1%, previamente inativado a 56°C por 30 minutos e adsorvido por eritrócitos normais de carneiro. por 30 min.

A sensibilização de eritrócitos tanizados deve ser realizada com soro hiperimune, respectivamente, contra rota e coronavírus bovinos (produzidos no Ya.R. Kovalenko All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine). Ao mesmo tempo, a dose sensibilizante (concentração de proteínas) do soro imune anti-rotavírus é de 280 μg/ml, e a do soro imune ao coronavírus é de 260 μg/ml.

A sensibilização é realizada misturando volumes iguais de eritrócitos tanizados e soro imune pré-aquecido por 30 minutos a 560C em concentração ótima. Além disso, são adicionadas 3 partes de uma solução isotônica de cloreto de sódio com pH de 7,2 e 5 partes de uma solução de cloreto de cromo a 0,1%. A mistura, mexendo ocasionalmente, é mantida em temperatura ambiente por 5 minutos. Após o tempo especificado, a mistura é bem lavada com PBS com pH de 7,2 e, a seguir, os diagnósticos de eritrócitos preparados são ressuspensos em conservante a uma concentração de 1%. O diagnosticum preparado retém suas qualidades básicas por 8 meses, se armazenado a 4°C.

Em todas as etapas da fabricação de diagnosticums, a auto-aglutinação é monitorada. A especificidade dos diagnósticos preparados é determinada pelo estadiamento RNGA, onde diagnósticos padrão de vírus RTI, PG-3, adenovírus, diarreia viral, bem como antígenos de rota e coronavírus foram usados ​​como antígenos.

Ao configurar o RNHA, diluições duplas em série do material contendo vírus estudado são preparadas (20-50% de suspensão de amostras fecais) e, em seguida, um volume igual de diagnóstico de eritrócitos é adicionado a cada poço. As placas devem ser bem agitadas várias vezes, deixadas em temperatura ambiente até que os eritrócitos estejam completamente assentados no controle. Um indicador de uma reação positiva é a aglutinação do diagnóstico de eritrócitos com uma intensidade de aglutinação de 2+ em um título de 1:4 e acima.

A reação de hemaglutinação indireta ou passiva (IPHA)

Essa reação é mais sensível que a reação de aglutinação e é utilizada no diagnóstico de infecções causadas por bactérias, riquétsias, protozoários e outros microrganismos.

RPGA permite detectar uma pequena concentração de anticorpos.

Essa reação envolve eritrócitos ovinos tanizados ou eritrócitos humanos com sangue do grupo I, sensibilizados com antígenos ou anticorpos.

Se forem detectados anticorpos no soro de teste, então são usados ​​eritrócitos sensibilizados com antígenos (erythrocyte diagnosticum).

Em alguns casos, se for necessário determinar vários antígenos no material de teste, são utilizados eritrócitos sensibilizados com imunoglobulinas.

Os resultados do RPHA são levados em consideração pela natureza do sedimento eritrocitário.

O resultado da reação é considerado positivo, no qual os eritrócitos cobrem uniformemente todo o fundo do tubo de ensaio (um guarda-chuva invertido).

Com uma reação negativa, os eritrócitos na forma de um pequeno disco (botão) estão localizados no centro do fundo do tubo de ensaio.

Reação de aglutinação (RA)

Devido à sua especificidade, facilidade de configuração e demonstração, a reação de aglutinação tornou-se difundida na prática microbiológica para o diagnóstico de muitas doenças infecciosas: febre tifóide e febre paratifóide (reação de Vidal), tifo (reação de Weigl), etc.

A reação de aglutinação é baseada na especificidade da interação de anticorpos (aglutininas) com células microbianas inteiras ou outras (aglutinógenos). Como resultado dessa interação, formam-se partículas - aglomerados que precipitam (aglutinam).

Bactérias vivas e mortas, espiroquetas, fungos, protozoários, rickettsias, bem como eritrócitos e outras células podem participar da reação de aglutinação.

A reação ocorre em duas fases: a primeira (invisível) é específica, a conexão do antígeno e anticorpos, a segunda (visível) é inespecífica, a ligação dos antígenos, ou seja, formação de aglutinantes.

O aglutinado é formado quando um centro ativo de um anticorpo bivalente é combinado com o grupo determinante do antígeno.

A reação de aglutinação, como qualquer reação sorológica, ocorre na presença de eletrólitos.

Externamente, a manifestação de uma reação de aglutinação positiva é dupla. Em micróbios não flagelados, que possuem apenas antígeno O somático, as próprias células microbianas se unem diretamente. Essa aglutinação é chamada de granulação fina. Ocorre dentro de 18 - 22 horas.

Os micróbios flagelares têm dois antígenos - o antígeno O somático e o antígeno H flagelar. Se as células se unirem com flagelos, grandes flocos soltos são formados e essa reação de aglutinação é chamada de granulação grossa. Vem dentro de 2 - 4 horas.

A reação de aglutinação pode ser definida tanto para fins de determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos específicos no soro sanguíneo do paciente quanto para fins de determinação da espécie do patógeno isolado. hemaglutinação microbiológica infecciosa

A reação de aglutinação pode ser configurada tanto em uma versão detalhada, que permite trabalhar com soro diluído a um título diagnóstico, quanto na variante de configuração de uma reação de orientação, que permite, em princípio, detectar anticorpos específicos ou determinar as espécies do patógeno.

A reação é realizada para detectar os antígenos de patógenos no material de teste, adicionando soro imune a ele. Na presença de um antígeno homólogo, ocorre a ligação do anticorpo, portanto, após a adição de eritrócitos sensibilizados pelo antígeno, não ocorre sua aglutinação, o que é avaliado como resultado positivo. Para maior sensibilidade da reação, adiciona-se soro imune específico ao material teste em quantidade mínima (2 unidades hemaglutinantes). O título de soro imune é determinado previamente usando RNGA. Para uma unidade hemaglutinante, tome a diluição limitante do soro, que causa aglutinação de eritrócitos.

Metodologia. 0,025 ml de uma solução a 1% de soro normal de coelho é adicionado aos poços de placas de poliestireno ou tubos de aglutinação e diluições seriadas de 2 vezes do material de teste são feitas. Em seguida, 0,025 ml de soro imune é adicionado a todos os poços, a placa é agitada e deixada por 30 minutos a uma temperatura de 37ºС ou por 1 hora em temperatura ambiente. Além disso, 0,025 ml de diagnóstico antigênico é adicionado a todos os poços, agitados e deixados por 2 horas, após o que os resultados são levados em consideração.

Ao realizar esta reação, um controle de especificidade de soro imune é adicionado ao controle para RNGA, composto por um antígeno específico, soro imune (2, 1, 0,5 unidades hemaglutinantes) e uma suspensão de eritrócitos sensibilizados.

O RTNGA também é usado para detectar anticorpos específicos (completos e bloqueadores), para os quais uma quantidade dosada de antígeno é adicionada ao soro de teste. Se contém anticorpos, então eles estão ligados por um antígeno, portanto, após a adição de eritrócitos sensibilizados com anticorpos (2ª etapa do RTNHA), os eritrócitos não se unem.

Devido ao uso de uma quantidade mínima de antígeno (2 doses neutralizantes), a reação é altamente sensível. O número de doses neutralizantes na preparação antigênica é determinado usando RNGA, enquanto diluições seriadas de 2 vezes do antígeno são feitas em uma solução de 1% de soro normal de coelho e um diagnóstico de eritrócitos de anticorpo é adicionado aos poços. A dose neutralizante do antígeno é a sua diluição máxima, que confere adesão completa dos eritrócitos sensibilizados.

Antes da reação, os soros de teste são diluídos 1:5-1:10 e inativados a uma temperatura de 56°C por 30 minutos. Para adsorção de hemaglutininas, uma suspensão de 50% de eritrócitos de ovelha formalizados ou recém-lavados é adicionada ao soro na proporção de 0,1 ml da suspensão por 1 ml de soro diluído. A mistura é agitada e incubada durante 30 minutos a 37°C ou 1 hora à temperatura ambiente, após o que os eritrócitos são precipitados por centrifugação. Pode-se deixar o soro na geladeira até o dia seguinte para a precipitação dos eritrócitos.

Durante o experimento, o material teste é diluído em solução a 1% de soro normal de coelho no volume de 0,025 ml nas cavidades do painel de microtitulação. Em seguida, 2 doses neutralizantes de antígeno em um volume de 0,025 ml são adicionadas a cada poço. As placas são agitadas e deixadas por 30 minutos a 37°C ou 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, 0,025 ml de anticorpo eritrocitário diagnóstico é adicionado a todos os poços. As placas são agitadas e incubadas por 1,5-2 horas à temperatura ambiente, após o que os resultados da reação são levados em consideração. A contabilidade também pode ser feita no dia seguinte. O título do soro estudado é considerado a sua diluição máxima, na qual os eritrócitos não se unem.

A experiência é acompanhada pelos seguintes tipos de controle:

1) estabilidade de eritrócitos sensibilizados (eritrócitos + solução 1% de soro normal de coelho);

2) integridade da depleção de hemaglutininas em cada soro teste (soro teste na menor diluição + eritrócitos formalinizados);

3) a correção da determinação da dose neutralizante mínima do antígeno (2, 1 e 0,5 da dose neutralizante do antígeno + anticorpo diagnóstico eritrocitário).

A hemaglutinação indireta reversa (rong) é usada para indicar antígenos bacterianos e virais em materiais de teste, bem como para diagnóstico expresso de várias infecções.

Ao contrário do RNHA, nessa reação, os eritrócitos não são sensibilizados por um antígeno, mas por anticorpos, cuja aglutinação ocorre quando o antígeno é adicionado.

Os eritrócitos são fixados preliminarmente com formalina ou glutaraldeído e, a seguir, ligados à gamaglobulina, que é isolada de soros imunes e purificada de outras proteínas séricas. A ligação da gama globulina à superfície dos eritrócitos ocorre com a ajuda do cloreto de cromo. Para fazer isso, 1 volume de imunoglobulinas isoladas de soro imune, 1 volume de suspensão a 50% de eritrócitos formalizados e 1 volume de solução de cloreto de cromo 0,1-0,2% são adicionados a 8 volumes de água destilada. A mistura é deixada por 10-15 minutos em temperatura ambiente, então os eritrócitos são tratados como em uma reação de hemaglutinação passiva.

A especificidade do anticorpo diagnosticum é verificada na reação de inibição da hemaglutinação passiva com um antígeno homólogo. A reação deve ser inibida por um antígeno homólogo em pelo menos 16 vezes e não inibida por um heterólogo. Use o controle para a ausência de hemaglutinação espontânea.

Com a ajuda dessa reação, os patógenos são indicados no material retirado dos órgãos de pessoas e animais mortos, por exemplo, do cérebro, baço, fígado dos pulmões. Prepare uma suspensão desses órgãos a 10% em solução isotônica de cloreto de sódio, centrifugue-os por 30-60 minutos a 10.000 rpm e use o sobrenadante como antígeno.

Metodologia. Prepare diluições duplas do material de teste (antígeno) em uma solução estabilizadora. Faça 1 gota de cada diluição de antígeno em 3 poços adjacentes do microarray (a reação leva 3 linhas paralelas de poços). 1 gota de solução estabilizadora é adicionada a cada poço da primeira linha, 1 gota de soro imune homólogo na diluição de 1:10 é adicionado aos poços da segunda linha, 1 gota de soro imune heterólogo é adicionado aos poços de a terceira linha. A segunda e terceira filas servem como controles para a especificidade da reação. A mistura é deixada por 20 minutos em temperatura ambiente.

Adicione 1 gota de suspensão a 1% de eritrócitos sensibilizados (diagnóstico de anticorpo eritrocitário) a todos os poços e agite bem as placas. Os resultados da reação são levados em consideração após 30-40 minutos. Na presença de antígeno específico, observa-se hemaglutinação na primeira e terceira fileira (com soro heterólogo) e ausente na segunda fileira, onde o antígeno é previamente neutralizado com soro homólogo.

A reação é acompanhada por controles de eritrócitos sensibilizados para aglutinação espontânea.

Reação de inibição indireta da hemaglutinação reversa (RTONGA) permite determinar a presença de anticorpos no soro de humanos e animais.

Metodologia. Os soros são diluídos 10 vezes com solução isotônica de cloreto de sódio, aquecidos por 20 minutos a uma temperatura de 65 ° C para destruir inibidores não específicos e, em seguida, diluições de 2 vezes de soros são preparadas em uma solução estabilizadora e uma dose de trabalho de antígeno contendo 4 unidades aglutinantes. Colocar 1 gota de cada diluição de soro nas cavidades do micropainel e adicionar 1 gota de antígeno, cuja diluição corresponde à dose de trabalho. Após os componentes da mistura estarem em contato por 20 minutos em temperatura ambiente, 1 gota de diagnóstico de anticorpo eritrocitário é adicionado a todos os poços e agitados completamente. Após 1,5-2 horas de incubação à temperatura ambiente, os resultados da reação são levados em consideração por hemaglutinação. O título sérico é sua maior diluição, o que inibe completamente a reação de hemaglutinação com quatro unidades aglutinantes de antígenos.

A reação é acompanhada de controles de eritrócitos sensibilizados para aglutinação espontânea na presença de: a) solução estabilizadora; b) antígeno normal (de material que não contém vírus); c) o soro teste. A vantagem da reação está em sua versatilidade e na possibilidade de utilizá-la para detectar diversos antígenos.

Avaliação dos resultados da hemaglutinação. Os resultados de RNGA, RONGA e RTONGA são considerados de acordo com o grau de aglutinação eritrocitária: (++++) - aglutinação completa; (+++) - aglutinação menos completa; (++) - aglutinação parcial; (+) - traços de aglutinação; (–) – ausência de aglutinação.

A reação é considerada positiva se a aglutinação for completa (++++) ou quase completa (+++), o diagnosticum não aglutinar espontaneamente na presença de cada componente da reação e o controle de especificidade do antígeno ou anticorpo for positivo .

Esses reações chamado indireto (passiva), pois utilizam Ag (ou AT) sorvido artificialmente na superfície de várias partículas corpusculares.

A reação de hemaglutinação indireta ou passiva (RNGA, RPGA) é uma das reações sorológicas mais sensíveis. Baseia-se na capacidade de AT interagir com Ag fixado em vários eritrócitos, que ao mesmo tempo aglutinam. Para maior estabilidade de diagnosticums, os eritrócitos são formalizados.

RNGA reverso usado para detectar antígeno no soro sanguíneo; para isso, não Ag, mas AT são fixados em eritrócitos. Reações desse tipo são amplamente utilizadas para diagnosticar doenças infecciosas, estabelecer gravidez, detectar hipersensibilidade a drogas, etc.

Reação passiva de inibição da hemaglutinação (RTPGA) - desenvolvimento adicional RNGA; em certo sentido, controla sua especificidade. Diferente RNGA, inclui três componentes; Ag, AT e Ag (AT) adsorvidos em eritrócitos. Inicialmente, o Ag reage com AT (antissoro padrão), depois adicionam-se à mistura eritrócitos sensibilizados com o mesmo Ag (ou AT). Se, durante a interação de Ag com AT, AT livre (ou Ag) não permanecer no sistema, então a aglutinação do diagnóstico de eritrócitos não é observada.