Métodos de pesquisa virológica— métodos de estudo da biologia dos vírus e sua identificação. Na virologia, são amplamente utilizados métodos de biologia molecular, com os quais foi possível estabelecer a estrutura molecular das partículas virais, os métodos de sua penetração na célula e as características da reprodução viral, a estrutura primária dos ácidos nucléicos e proteínas virais. Métodos estão sendo desenvolvidos para determinar a sequência dos elementos constituintes dos ácidos nucléicos virais e aminoácidos proteicos. Torna-se possível vincular as funções dos ácidos nucléicos e das proteínas que eles codificam com a sequência de nucleotídeos e estabelecer as causas dos processos intracelulares que desempenham um papel importante na patogênese da infecção viral.

Os métodos de pesquisa virológica também são baseados em processos imunológicos (interação do antígeno com anticorpos), propriedades biológicas do vírus (capacidade de hemaglutinação, hemólise, atividade enzimática), características da interação do vírus com a célula hospedeira (natureza do efeito citopático , formação de inclusões intracelulares, etc.).

No diagnóstico de infecções virais, no cultivo, isolamento e identificação de vírus, bem como na produção de preparações vacinais, o método de cultura de tecidos e células é amplamente utilizado. São utilizadas culturas de células primárias, secundárias, estáveis, contínuas e diplóides. As culturas primárias são obtidas pela dispersão do tecido com enzimas proteolíticas (tripsina, colagenase). A fonte das células pode ser tecidos e órgãos (geralmente rins) de embriões humanos e animais. Uma suspensão de células em meio nutriente é colocada nos chamados colchões, garrafas ou placas de Petri, onde, após fixação na superfície do vaso, as células começam a se multiplicar. Para infecção por vírus, geralmente é usada uma monocamada de células. O líquido nutriente é drenado, a suspensão viral é adicionada em certas diluições e, após contato com as células, é adicionado meio nutriente fresco, geralmente sem soro.

As células da maioria das culturas primárias podem ser subcultivadas; tal cultura é chamada de cultura secundária. Com a passagem adicional das células, forma-se uma população de células semelhantes a fibroblastos, capazes de reprodução rápida, a maioria das quais retém o conjunto original de cromossomos. Estas são as chamadas células diplóides. Ao cultivar células em série, são obtidas culturas celulares contínuas e estáveis. Durante as passagens, aparecem células homogêneas de divisão rápida com um conjunto heteroplóide de cromossomos. As linhas celulares estáveis ​​podem ser de camada única ou suspensão. As culturas de camada única crescem na forma de uma camada contínua na superfície do vidro, enquanto as culturas em suspensão crescem na forma de suspensões em vários recipientes usando dispositivos de mistura. Existem mais de 400 linhas celulares derivadas de 40 espécies diferentes de animais (incluindo primatas, aves, répteis, anfíbios, peixes, insetos) e humanos.

Pedaços de órgãos e tecidos individuais (culturas de órgãos) podem ser cultivados em meio nutriente artificial. Estes tipos de culturas preservam a estrutura dos tecidos, o que é especialmente importante para o isolamento e passagem de vírus que não se reproduzem em culturas de tecidos indiferenciados (por exemplo, coronavírus).

Nas culturas de células infectadas, os vírus podem ser detectados por alterações na morfologia celular, efeitos citopáticos, que podem ser específicos, aparecimento de inclusões, pela determinação de antígenos virais na célula e no fluido de cultura; estabelecimento das propriedades biológicas da progênie viral em fluido de cultura e titulação de vírus em cultura de tecidos, embriões de galinha ou animais sensíveis; identificando ácidos nucleicos virais individuais em células por hibridização molecular ou acumulações de ácidos nucleicos pelo método citoquímico utilizando microscopia fluorescente.

Isolar vírus é um processo trabalhoso e demorado. É realizado para determinar o tipo ou variante do vírus que circula na população (por exemplo, para identificar uma sorovariante do vírus influenza, uma cepa selvagem ou vacinal do vírus da poliomielite, etc.); nos casos em que seja necessária a realização de medidas epidemiológicas urgentes; quando surgem novos tipos ou variantes de vírus; se necessário, confirme o diagnóstico preliminar; para indicação de vírus em objetos ambientais. Ao isolar os vírus, leva-se em consideração a possibilidade de sua persistência no corpo humano, bem como a ocorrência de infecção mista causada por dois ou mais vírus. Uma população geneticamente homogênea do vírus obtida de um vírion é chamada de clone viral, e o processo de obtenção é chamado de clonagem.

Para isolar vírus, utiliza-se a infecção de animais de laboratório suscetíveis e embriões de galinha, mas na maioria das vezes é utilizada cultura de tecidos. A presença de um vírus é geralmente determinada pela degeneração celular específica (efeito citopático), pela formação de simplastos e sincícios, pela detecção de inclusões intracelulares, bem como por um antígeno específico detectado por imunofluorescência, hemadsorção, hemaglutinação (para vírus hemaglutinantes), etc. . Esses sinais só podem ser detectados após 2-3 passagens do vírus.

Embriões de galinha são usados ​​para isolar vários vírus, como vírus da gripe, e camundongos recém-nascidos são usados ​​para isolar alguns vírus Coxsackie e vários arbovírus. A identificação de vírus isolados é realizada por meio de reações sorológicas e outros métodos.

Ao trabalhar com vírus, seu título é determinado. A titulação dos vírus geralmente é realizada em cultura de tecidos, determinando a maior diluição do líquido contendo vírus na qual ocorre a degeneração do tecido, inclusões e formação de antígenos específicos do vírus. O método da placa pode ser usado para titular vários vírus. Placas, ou colônias negativas de vírus, são focos de células destruídas pelo vírus em uma cultura de tecidos de camada única sob revestimento de ágar. A contagem de colônias permite uma análise quantitativa da atividade infecciosa dos vírus com base no fato de que uma partícula viral infecciosa forma uma placa. As placas são detectadas pela coloração da cultura com corantes intravitais, geralmente vermelho neutro; as placas não adsorvem o corante e são, portanto, visíveis como pontos claros contra o fundo de células vivas coradas. O título do vírus é expresso como o número de unidades formadoras de placas por 1 ml.

A purificação e concentração de vírus é geralmente realizada por ultracentrifugação diferencial seguida de centrifugação em gradiente de concentração ou densidade. Para purificar vírus, são utilizados métodos imunológicos, cromatografia de troca iônica, imunossorventes, etc.

O diagnóstico laboratorial de infecções virais inclui a detecção do patógeno ou de seus componentes em material clínico; isolar o vírus deste material; sorodiagnóstico. A escolha do método de diagnóstico laboratorial em cada caso individual depende da natureza da doença, do período de doença e das capacidades do laboratório. O diagnóstico moderno de infecções virais baseia-se em métodos expressos que permitem obter uma resposta várias horas após a coleta do material clínico nos estágios iniciais da doença, incluindo a microscopia eletrônica e eletrônica imunológica, bem como a imunofluorescência, método de hibridização molecular. , detecção de anticorpos da classe IgM, etc.

A microscopia eletrônica de vírus corados negativamente permite diferenciar os vírus e determinar sua concentração. O uso da microscopia eletrônica no diagnóstico de infecções virais é limitado aos casos em que a concentração de partículas virais no material clínico é bastante elevada (10 5 em 1 ml e mais alto). A desvantagem do método é a incapacidade de distinguir vírus pertencentes ao mesmo grupo taxonômico. Essa deficiência é superada pelo uso da microscopia eletrônica imune. O método baseia-se na formação de imunocomplexos através da adição de soro específico às partículas virais, ao mesmo tempo que concentra as partículas virais, permitindo a sua identificação. O método também é usado para detectar anticorpos. Para fins de diagnóstico expresso, é realizado exame microscópico eletrônico de extratos de tecidos, fezes, fluido de vesículas e secreções da nasofaringe. A microscopia eletrônica é amplamente utilizada para estudar a morfogênese do vírus; suas capacidades são ampliadas com o uso de anticorpos marcados.

O método de hibridização molecular, baseado na detecção de ácidos nucléicos específicos de vírus, permite detectar cópias únicas de genes e não tem igual sensibilidade. A reação é baseada na hibridização de fitas complementares de DNA ou RNA (sondas) e na formação de estruturas de fita dupla. A sonda mais barata é o DNA recombinante clonado. A sonda é marcada com precursores radioativos (geralmente fósforo radioativo). O uso de reações colorimétricas é promissor. Existem várias opções de hibridização molecular: hibridização spot, hibridização blot, hibridização sanduíche, hibridização in situ, etc.

Os anticorpos da classe IgM aparecem mais cedo que os anticorpos da classe G (no 3º ao 5º dia de doença) e desaparecem após algumas semanas, pelo que a sua detecção indica uma infecção recente. Os anticorpos da classe IgM são detectados por imunofluorescência ou por imunoensaio enzimático utilizando anti-soros anti-m (soros contra as cadeias pesadas de IgM).

Os métodos sorológicos em virologia são baseados em reações imunológicas clássicas (ver. Métodos de pesquisa imunológica ): reações de fixação de complemento, inibição de hemaglutinação, neutralização biológica, imunodifusão, hemaglutinação indireta, hemólise radial, imunofluorescência, imunoensaio enzimático, radioimunoensaio. Micrométodos para muitas reações foram desenvolvidos e suas técnicas estão sendo constantemente aprimoradas. Esses métodos são usados ​​​​para identificar vírus usando um conjunto de soros conhecidos e para o sorodiagnóstico para determinar o aumento de anticorpos no segundo soro em comparação com o primeiro (o primeiro soro é coletado nos primeiros dias após a doença, o segundo - após 2- 3 semanas). Um valor diagnóstico não é inferior a um aumento de quatro vezes nos anticorpos no segundo soro. Se a detecção de anticorpos da classe IgM indicar uma infecção recente, então os anticorpos da classe IgC persistem por vários anos e, às vezes, por toda a vida.

Para identificar antígenos individuais de vírus e anticorpos contra eles em misturas complexas sem purificação preliminar de proteínas, é utilizado o imunotransferência. O método combina o fracionamento de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida com posterior imunoindicação de proteínas pelo método de imunoensaio enzimático. A separação de proteínas reduz os requisitos de pureza química do antígeno e torna possível identificar pares individuais de antígeno-anticorpo. Esta tarefa é relevante, por exemplo, no sorodiagnóstico da infecção pelo HIV, onde as reações falso-positivas do ensaio imunoenzimático são causadas pela presença de anticorpos contra antígenos celulares, que estão presentes como resultado da purificação insuficiente de proteínas virais. A identificação de anticorpos nos soros dos pacientes para antígenos virais internos e externos permite determinar o estágio da doença e, na análise de populações, a variabilidade das proteínas virais. O imunoblotting para infecção pelo HIV é usado como um teste confirmatório para identificar antígenos virais individuais e anticorpos contra eles. Ao analisar populações, o método é utilizado para determinar a variabilidade das proteínas virais. O grande valor do método reside na possibilidade de analisar antígenos sintetizados com tecnologia de DNA recombinante, estabelecendo seus tamanhos e a presença de determinantes antigênicos.

Método virológico inclui duas etapas principais: isolamento de vírus e sua identificação. Os materiais podem ser sangue, outros fluidos biológicos e patológicos, biópsias de órgãos e tecidos.

Exames virológicos de sangue são frequentemente realizados para diagnosticar infecções arbovirais. Os vírus da raiva, caxumba e herpes simplex podem ser detectados na saliva. Os esfregaços nasofaríngeos são usados ​​para isolar patógenos da gripe e outras infecções virais respiratórias agudas e do sarampo. Os adenovírus são encontrados em esfregaços conjuntivais. Vários entero-, adeno-, reo- e rotavírus são isolados das fezes.

Para isolar vírus, são utilizadas culturas de células, embriões de galinha e, às vezes, animais de laboratório. A maioria dos vírus patogênicos se distingue pela presença de especificidade de tecido e tipo", por exemplo, o poliovírus se reproduz apenas em células de primatas, portanto, para isolar um vírus específico, é utilizada uma cultura de tecido apropriada. Para isolar um patógeno desconhecido, é aconselhável isolar infectar simultaneamente 3-4 culturas celulares, assumindo que uma delas pode revelar-se sensível.A presença do vírus em culturas infectadas é determinada pelo desenvolvimento de degeneração celular específica, ou seja, ação citopatogênica, detecção de inclusões intracelulares, bem como com base na detecção de um antígeno específico por imunofluorescência, reações positivas de hemadsorção e hemaglutinação. Embriões de aves com seus tecidos pouco diferenciados são adequados para o cultivo de muitos vírus. Na maioria das vezes, são usados ​​embriões de galinha. Quando multiplicados em embriões, os vírus podem causar sua morte (arbovírus), aparecimento de alterações na membrana córion-alantóica (vírus da varíola) ou no corpo do embrião, acúmulo de hemaglutininas nos fluidos embrionários (vírus influenza, caxumba) e antígeno viral fixador de complemento.

Os vírus são identificados por métodos imunológicos: reação de inibição da hemaglutinação, fixação do complemento, neutralização, precipitação em gel, imunofluorescência.

3.4 Método biológico

Método biológico consiste em infectar animais de laboratório com diversos materiais (clínicos, laboratoriais) para indicar o patógeno, bem como determinar algumas propriedades dos microrganismos que caracterizam sua patogenicidade (toxigenicidade, toxicidade, virulência). Camundongos brancos, ratos brancos, porquinhos-da-índia, coelhos, etc. são usados ​​como animais de laboratório.

A reprodução da doença em um animal é prova absoluta da patogenicidade do microrganismo isolado (no caso da raiva, do tétano, etc.). Portanto, um teste biológico em animais é um método diagnóstico valioso e confiável, especialmente para aquelas infecções cujos patógenos estão contidos em baixas concentrações nos meios biológicos estudados do corpo humano e crescem fraca ou lentamente em meios artificiais.

3.5 Método imunológico

Método imunológico(sorológico) inclui estudos de soro sanguíneo, bem como de outros substratos biológicos para identificar anticorpos e antígenos específicos. O sorodiagnóstico clássico baseia-se na determinação de anticorpos contra um patógeno identificado ou suspeito. Um resultado de reação positivo indica a presença de anticorpos contra antígenos patogênicos no soro sanguíneo sendo testado; um resultado negativo indica a ausência de tal. A detecção de anticorpos contra o agente causador de uma série de doenças infecciosas no soro sanguíneo em estudo não é suficiente para o diagnóstico, pois pode refletir a presença de imunidade pós-infecciosa ou pós-vacinal, portanto, sangue “pareado” São examinados os soros, o primeiro, colhido nos primeiros dias da doença, e o segundo, colhido com intervalo de 7 a 10 dias. Nesse caso, avalia-se a dinâmica do aumento dos níveis de anticorpos.

Um aumento no título de anticorpos no soro sanguíneo testado em pelo menos 4 vezes em relação ao nível inicial é diagnóstico significativo. Este fenômeno é chamado de soroconversão. Nas doenças infecciosas raras, assim como nas hepatites virais, infecção pelo HIV e algumas outras, a presença de anticorpos indica que o paciente está infectado e tem valor diagnóstico.

Além de determinar o título de anticorpos, durante os estudos sorológicos é possível determinar o isotipo do anticorpo. Sabe-se que no primeiro encontro do corpo humano com um patógeno no período agudo da doença, detecta-se um aumento mais rápido de anticorpos pertencentes à IgM, cujo nível, atingindo um valor máximo, depois diminui. Nas fases posteriores da doença, aumenta o número de anticorpos IgG, que persistem por mais tempo e são determinados durante o período de reconvalescença. Ao encontrar novamente o patógeno, graças à memória imunológica, as reações de imunidade humoral se manifestam pela produção mais rápida de anticorpos IgG, e os anticorpos da classe M são produzidos em pequenas quantidades. A detecção de anticorpos IgM indica a presença de um processo infeccioso atual, e a presença de anticorpos IgG indica uma infecção passada ou imunidade pós-vacinal.

Tendo em conta as características da resposta imunitária primária e secundária, a análise da proporção de anticorpos IgM e IgG permite, em alguns casos, diferenciar a fase do processo infeccioso (pico da doença, convalescença, recidiva). Por exemplo, no caso da hepatite viral A (HA), um método de diagnóstico confiável é a determinação de anticorpos IgM anti-HAV no soro sanguíneo. A sua detecção indica infecção atual ou recente pelo HAV.

O teste sorológico para detectar anticorpos em doenças infecciosas é um método de diagnóstico laboratorial mais acessível do que o isolamento do patógeno. Às vezes, uma reação sorológica positiva serve como única evidência do encontro e interação do organismo com o agente causador da doença infecciosa correspondente. Além disso, várias doenças com quadro clínico semelhante (por exemplo, riquetsioses, infecções por enterovírus) podem ser diferenciadas apenas sorologicamente, o que reflete a importância dos métodos sorológicos no diagnóstico de doenças infecciosas.

Trabalho do curso

"Métodos de virologia clínica"

Introdução

O diagnóstico laboratorial das infecções virais é realizado principalmente por microscopia eletrônica, culturas de células sensíveis e métodos imunológicos. Via de regra, um método é escolhido para fazer o diagnóstico dependendo do estágio da infecção viral. Por exemplo, todas as três abordagens podem ser úteis no diagnóstico da varicela, mas o uso bem-sucedido de técnicas de microscopia e cultura celular depende da capacidade de coletar amostras satisfatórias relativamente no início da doença.

Em grande medida, o sucesso do diagnóstico viral depende da qualidade das amostras obtidas. Por esta razão, o próprio pessoal do laboratório deve estar directamente envolvido na recolha das amostras necessárias. As características das amostras, bem como os métodos para sua entrega ao laboratório, são descritos por Lennett, Schmidt, Christ, et al.

A maioria dos reagentes e instrumentos utilizados em diagnósticos laboratoriais podem ser adquiridos de diversas empresas. Na maioria dos casos, o mesmo reagente é produzido simultaneamente por diversas empresas. Por este motivo, não indicamos empresas individuais, a menos que o reagente seja fornecido por apenas uma empresa. Em todos os outros casos, deverá consultar a lista geral de fornecedores indicada na tabela. 1.

Não pretendemos fornecer uma descrição abrangente de todos os métodos atualmente disponíveis para diagnosticar infecções virais humanas. Primeiramente caracterizamos os principais métodos. À medida que você ganha experiência trabalhando de forma independente, essas técnicas básicas podem ser usadas para resolver problemas mais complexos.

1. Microscopia eletrônica

Para o diagnóstico microscópico eletrônico de infecções virais, podem ser utilizadas finas seções de tecido afetado. O material mais comum usado para microscopia eletrônica são fezes ou líquidos.

Tabela 1. Lista de empresas fornecedoras de reagentes e equipamentos

vesículas que caracterizam algumas doenças, como a varicela. Ao analisar esse material, os vírus podem ser detectados por meio de coloração negativa, o que resulta em material eletrodenso que delineia os componentes do vírion. O método é eficaz quando a concentração do vírus é elevada nas amostras de teste, como nas fezes ou no fluido vesicular. Nos casos em que o teor de partículas virais nas amostras é baixo, a probabilidade de detecção do vírus pode ser aumentada através da concentração do vírus por ultracentrifugação ou pela agregação com anticorpos específicos. O último método também é conveniente para identificar vírus. Descreveremos aqui o método de microscopia eletrônica para diagnosticar a infecção por rotavírus e o método de microscopia imunoeletrônica usando o exemplo de detecção de anticorpos específicos para parvovírus. Os métodos de microscopia eletrônica são descritos com mais detalhes por Field.

2.1 Exame microscópico eletrônico direto de fezes

1. Mergulhe a ponta de uma pipeta Pasteur nas fezes e retire material suficiente para obter um esfregaço de 1 cm.

2. Ressuspender o esfregaço fecal em corante de contraste negativo para microscopia eletrônica até obter uma suspensão translúcida. O corante de contraste negativo é uma solução de ácido fosfotúngstico a 2% em água destilada.

3. Para obter uma amostra de microscopia eletrônica, uma gota da suspensão é colocada em uma grade de microscopia eletrônica revestida com um filme de carbono-formvar. Durante esta operação, a malha é segurada com uma pinça fina.

4. O medicamento é deixado no ar por 30 segundos.

5. O excesso de líquido é retirado tocando a borda do copo com papel filtro.

6. A droga é seca ao ar.

7. Se necessário, o vírus viável é inativado irradiando ambos os lados da grade com luz ultravioleta com intensidade de 440.000 μW-s/cm2. Neste caso, é utilizada uma lâmpada ultravioleta de ondas curtas com filtro. A lâmpada deve ficar a uma distância de 15 cm da grade; O tempo de irradiação para cada lado é de 5 minutos.

8. Os vírions de rotavírus podem ser caracterizados sob um microscópio eletrônico de transmissão com ampliação de 30.000 a 50.000.

2.2 Microscopia imunoeletrônica

O método de microscopia imunoeletrônica descrito abaixo é apenas um dos muitos métodos imunológicos semelhantes. Além disso, para estudar anticorpos específicos de vírus, é utilizado um método que envolve a ligação à rede microscópica da proteína A. A concentração de trabalho de anticorpos antivirais é determinada por tentativa e erro na faixa de 1/10 a 1/1000. A concentração que indicamos costuma ser utilizada em trabalhos rotineiros. Para obter resultados ideais para a interação dos anticorpos com o vírus, o soro contendo parvovírus é titulado da mesma forma.

1. 10 µl de anti-soro para parvovírus humano são diluídos 100 vezes com PBS. A solução é aquecida em banho-maria a 56°C.

2. Derreta 10 ml de agarose a 2% em PBS da maneira usual e resfrie até 56°C em banho-maria.

3. A 56 °C, misture 1 ml de anti-soro diluído com 1 ml de agarose a 2%.

4. Transfira 200 µl da mistura resultante para dois poços de uma placa de microtitulação de 96 poços.

5. Deixa-se a agarose assentar à temperatura ambiente. O comprimido pode ser conservado a 4°C durante várias semanas se for selado com fita adesiva.

6. Adicione 10 µl de soro contendo parvovírus a um poço contendo uma mistura de agarose e anti-soro.

7. Uma grade de microscopia eletrônica com revestimento de carbono-formvar pré-preparado é colocada no lado menos brilhante sobre uma gota de soro.

8. A malha é mantida durante 2 horas a 37 °C numa câmara húmida.

9. Com uma pinça fina, retire a tela e aplique uma gota de ácido fosfotúngstico 2% na superfície da tela que esteve em contato com o soro.

10. Após 30 s, o excesso de tinta é lavado, o preparo é seco e o vírus é inativado.

As partículas virais agregadas são examinadas sob um microscópio eletrônico de transmissão com uma ampliação de 30.000 a 50.000.

3. Identificação de antígenos virais

Os vírus encontrados em tecidos ou fluidos teciduais podem ser identificados por proteínas específicas do vírus usando a reação antígeno-anticorpo. O produto da reação antígeno-anticorpo é testado contra um marcador que é introduzido diretamente em anticorpos antivirais ou em anticorpos direcionados contra anticorpos específicos de vírus. Os anticorpos podem ser marcados com fluoresceína, iodo radioativo ou uma enzima que cliva o substrato causando uma mudança de cor. Além disso, a reação de hemaglutinação é utilizada para identificar o vírus. Na prática cotidiana, os métodos descritos são utilizados principalmente para detectar antígenos do vírus da hepatite B no sangue e procurar antígenos de vários vírus que causam diversas doenças respiratórias.

Atualmente, muitas empresas produzem diagnósticos eritrocitários, radioativos e enzimáticos, inclusive para detecção do vírus da hepatite B. Não consideramos aconselhável delinear métodos para trabalhar com esses diagnósticos: basta seguir as instruções anexas. A seguir focaremos no método de imunofluorescência para identificação do vírus sincicial respiratório nas secreções nasofaríngeas.

3.1 Identificação do vírus sincicial respiratório em secreções nasofaríngeas por imunofluorescência

O método para obtenção de preparações de secreções nasofaríngeas é descrito por Gardner e McQuillin. Em condições de laboratório, esta operação é realizada em duas etapas. Primeiro, um esfregaço de muco nasofaríngeo é preparado em uma lâmina de vidro. Os esfregaços resultantes podem ser armazenados fixados a -20°C durante muitos meses. Na segunda etapa, os esfregaços são corados para detectar o antígeno do vírus sincicial respiratório. Para tanto, é utilizado o método de imunofluorescência indireta.

3.1.1 Preparação de preparações de secreções nasofaríngeas

1. O muco da pinça especial é lavado com 1-2 ml de PBS e transferido para um tubo de centrífuga.

2. Centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm numa centrífuga de mesa.

3. O sobrenadante é drenado.

4. O sedimento celular é cuidadosamente ressuspenso em 2-3 ml de PBS até ser obtida uma suspensão homogénea. Para fazer isso, use uma pipeta Pasteur de gargalo largo.

5. A suspensão resultante é transferida para um tubo de ensaio.

6. Adicione mais 2-4 ml de PBS à suspensão e misture pipetando. Grandes coágulos de muco são removidos.

7. Centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm numa centrífuga de mesa.

8. O sobrenadante é descartado, o sedimento é ressuspenso em tal volume de PBS que a suspensão resultante é facilmente separada das paredes do tubo.

9. A suspensão resultante é aplicada a uma lâmina de vidro marcada.

10. O vidro é seco ao ar.

Fixar em acetona por 10 minutos a 4°C.

12. Após a fixação, o vidro é novamente seco ao ar.

13. As preparações resultantes são coradas imediatamente ou armazenadas a -20 °C.

3.1.2. Técnica de coloração

1. Imprima e dilua o anti-soro comercial de RSV em PBS até a concentração de trabalho recomendada.

2. Usando uma pipeta Pasteur, aplique uma gota de anti-soro na preparação preparada.

3. O medicamento é colocado em câmara úmida.

4. O medicamento é incubado durante 30 minutos a 37°C.

5. As amostras são cuidadosamente lavadas com PBS para remover o excesso de anticorpos num reservatório especial.

6. As amostras são lavadas em três turnos de PBS, 10 minutos cada.

7. Seque as amostras, remova o excesso de PBS com papel filtro e deixe secar ao ar.

O diagnóstico etiológico das doenças virais é realizado por métodos virológicos, virusoscópicos, sorológicos e genéticos moleculares. Os últimos três métodos podem ser usados ​​como métodos de diagnóstico expresso.

Método de diagnóstico virológico.

O objetivo final do método é identificar vírus por espécie ou variante sorológica. O método virológico inclui várias etapas:

1) seleção de material para pesquisa;

2) processamento de material contendo vírus;

3) contaminação de sistemas vivos sensíveis com material;

4) indicação de vírus em sistemas vivos;

5) titulação de vírus isolados;

6) identificação de vírus em reações imunológicas.

1. Seleção de material para pesquisa .

É realizado nos estágios iniciais da doença, obedecendo às normas que evitam a contaminação do material com microflora estranha e infecção do pessoal médico. Para evitar a inativação dos vírus durante o transporte, o material é colocado em meio de transporte viral (VTS) composto por solução salina balanceada, antibióticos e albumina sérica. O material é transportado em contêiner especial com isolamento térmico e sacos plásticos fechados contendo gelo. Se necessário, o material é armazenado a -20˚C. Cada amostra de material para pesquisa deverá ser marcada e etiquetada indicando o nome do paciente, tipo de material, data da coleta, diagnóstico clínico detalhado e outras informações.

Dependendo da natureza da doença, o material para pesquisa pode ser:

1) esfregaços da parte nasal da faringe e esfregaços da faringe;

2) líquido cefalorraquidiano;

3) fezes e esfregaços retais;

6) fluido de cavidades serosas;

7) esfregaço da conjuntiva;

8) conteúdo de vesículas;

8) material seccional.

Para obter uma lavagem da orofaringe, são utilizados 15-20 ml de VTS. O paciente gargareja cuidadosamente o VTS por 1 minuto e coleta o enxágue em frasco estéril.

Um esfregaço é retirado da parte posterior da garganta com um cotonete estéril, pressionando a raiz da língua com uma espátula. O tampão é colocado em 2-3 ml de VTS, enxaguado e espremido.

O líquido cefalorraquidiano é obtido através de uma punção lombar. 1-2 ml de líquido cefalorraquidiano são colocados em um recipiente estéril e entregues ao laboratório.

As amostras de fezes são coletadas dentro de 2-3 dias em frascos estéreis. Uma suspensão a 10% é preparada a partir do material resultante usando solução de Hanks. A suspensão é centrifugada a 3.000 rpm, o sobrenadante é coletado, são adicionados antibióticos e colocados em recipiente estéril.

O sangue obtido por punção venosa em um volume de 5 a 10 ml é desfibrinado pela adição de heparina. O sangue total não é congelado e não são adicionados antibióticos. Para a obtenção do soro, as amostras de sangue são mantidas em termostato a 37˚C por 60 minutos.

O líquido das cavidades serosas é obtido por punção na quantidade de 1-2 ml. O líquido é consumido imediatamente ou armazenado congelado.

Um esfregaço da conjuntiva é retirado com um swab estéril e colocado em um VTS, após o qual o material coletado é centrifugado e congelado.

O conteúdo das vesículas é aspirado com seringa de agulha fina e colocado no VTS. O material é enviado ao laboratório na forma de esfregaços secos em lâminas de vidro ou em capilares ou ampolas estéreis lacrados.

O material seccional é selecionado o mais cedo possível, observando regras assépticas. Conjuntos separados de instrumentos estéreis são usados ​​para coletar cada amostra. A quantidade de tecido retirada é de 1-3 g, que é colocada em frascos estéreis. Primeiro, são retiradas amostras de órgãos extracavitários (cérebro, gânglios linfáticos, etc.). O tecido da cavidade torácica é coletado antes da abertura da cavidade abdominal. As amostras de tecido resultantes são trituradas em almofariz com adição de areia estéril e solução estéril de cloreto de sódio, após o que o material é centrifugado. O sobrenadante é coletado em frascos e são adicionados antibióticos. O material para pesquisa virológica é utilizado imediatamente ou armazenado a -20˚C.

2. Processamento de material contendo vírus.

É realizado com o objetivo de liberar o material da microflora bacteriana que o acompanha. Para tanto, são utilizados métodos físicos e químicos.

Métodos físicos:

1) filtração através de vários filtros bacterianos;

2) centrifugação.

Métodos químicos:

1) tratamento do material com éter nos casos de isolamento de vírus que não possuem supercapsídeo;

2) adição de uma mistura de heptano e freon ao material;

3) administração de antibióticos (penicilina - 200-300 U/ml; estreptomicina - 200-500 mcg/ml; nistatina - 100-1000 U/ml).

3. Contaminação de sistemas vivos sensíveis por materiais.

1) animais de laboratório;

2) embriões de galinha;

3) cultura de órgãos;

4) cultura de tecidos.

Animais de laboratório. São utilizados ratos brancos, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos, etc.. Os ratos brancos são os mais sensíveis a um grande número de tipos de vírus. O método de infecção dos animais é determinado pelo tropismo do vírus aos tecidos. A infecção no cérebro é usada para isolar vírus neurotrópicos (vírus da raiva, poliovírus, etc.). A infecção intranasal é realizada quando são isolados patógenos de infecções respiratórias. Métodos de infecção intramuscular, intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo e outros são amplamente utilizados. Os animais doentes são sacrificados com éter, abertos e o material é coletado de órgãos e tecidos.

Embriões de galinha. Amplamente disponível e fácil de usar. São utilizados embriões de galinha com idade de 5 a 14 dias. Antes da infecção, os embriões de galinha são ovoscópicos: sua viabilidade é determinada, a borda do saco aéreo e a localização do embrião são marcadas na casca (o “olho escuro” do embrião). O trabalho com embriões de galinha é realizado em caixa estéril com instrumentos estéreis (pinças, seringas, tesouras, lança, etc.). Após a conclusão de um fragmento de trabalho, as ferramentas são imersas em álcool etílico 70% e queimadas antes da próxima manipulação. Antes da infecção, a casca de um embrião de galinha é limpa com um algodão embebido em álcool e uma solução alcoólica de iodo. O volume do material de teste injetado no embrião é de 0,1-0,2 ml. Para isolar vírus de um material, são utilizados pelo menos 4 embriões de galinha.

lição não. 2 7

ASSUNTO: INTERAÇÃO DE VÍRUS COM CÉLULAS SENSÍVEIS. CULTIVO. MÉTODOS DE INDICAÇÃOe identificação.IMUNIDADE ANTI-VIRAL.

LISTA DE CONTROLE

1. Vírus, natureza e origem. História da descoberta. Estágios de desenvolvimento da virologia. O conceito de virion, sua estrutura. Composição química e propriedades dos vírus.

2. Princípios de classificação de vírus – critérios. Famílias de vírus RNA e DNA (controle).

3. Tropismo de vírus. Interação de vírus com células sensíveis - fases.

4. Cultivo de vírus. Indicação e identificação de vírus quando cultivados em culturas celulares e embriões de galinha. Culturas celulares, linhas celulares, preparação, condições de cultivo.

5. Classificação das infecções virais: a) a nível celular; b) ao nível do organismo.

6. Métodos de diagnóstico laboratorial de infecções virais. Métodos diretos de estudo de material clínico (detecção de vírus, antígenos virais ou NK virais). Método de diagnóstico virológico. Sorodiagnóstico de infecções virais.

7. Imunidade antiviral - fatores. Resistência das espécies. Fatores de defesa antivirais inespecíficos (inibidores, interferon, complemento, fagocitose). Imunidade adquirida (mecanismos humorais e celulares).

8. Princípios de prevenção e tratamento específicos de infecções virais: vacinas, soros imunes (imunoglobulinas), interferons, quimioterapia etiotrópica.

TRABALHO DE LABORATÓRIO

DIAGNÓSTICO LABORATÓRIO DE INFECÇÕES VIRAIS

1. Para diagnóstico expresso, use:

A) determinação de antígeno viral no material estudado utilizando soros antivirais diagnósticos nas seguintes reações: RIF, ELISA, RIA, contra-imunoeletroforese (CIEF), reação de hemaglutinação passiva (RPHA), reação de inibição de hemaglutinação (HAI), etc.;

V) detecção de vírions em material patológico usando microscopia eletrônica ou IEM.

d) detecção de genomas de vírus métodos de genética molecular: PCR; hibridização molecular de ácidos nucleicos utilizando sondas marcadas.

2. Método virológico

Etapas principais:

1. Coleta do material de teste.

2. Seleção baseada no princípio do citotropismo e obtenção de um sistema teste sensível, determinando sua viabilidade.

3. Infecção do sistema selecionado.

4.Indicação do vírus com base na detecção de seu ácido nucléico, antígenos, hemaglutinina, CPD, inclusões.

5. A identificação e titulação do vírus são realizadas com base em:

a) determinação de antígenos virais por meio de reações imunológicas (RIF, ELISA, RPGA, RSK, RN, VIEF, etc.); b) exame anatomopatológico de órgãos e tecidos; c) PCP; d) sintomas clínicos, exames biológicos (ceratoconjuntivais, etc.).

Método virológico (esquema)

Material de teste (fezes, esfregaços nasofaríngeos, material seccional, etc.)

Tratamento antibiótico para suprimir infecções bacterianas e fúngicas

microflora, centrifugação, filtração

Série de infecção

Embriões de galinha

Culturas de células

Animais

Indicação de vírus com base nos seguintes fenômenos

Atraso no desenvolvimento

morte, mudança

membranas do embrião, RGA

CPP, formação de placa, RIF, RGads, interferência

Doença, morte,

alterações histológicas

em tecidos, inclusões

Titulação do vírus isolado; seleção da dose de trabalho.

Título de vírus- diluição máxima do material contendo vírus, em que ainda se observa o efeito esperado (CPE, RGA, morte do animal).

Identificação do vírus isolado em reações de neutralização, RTGads, RSC, supressão da formação de placas, etc. com soros diagnósticos. Tipo (tipo) de vírus determinado pela neutralização do efeito específico do vírus pelo soro imunológico apropriado.

Nota: A titulação e a identificação do vírus são realizadas utilizando o mesmo fenômeno.

Cultivo de vírus