Що таке тандемна мас-спектрометрія. Епілепсія у дітей - про ТМС генетичний аналіз

За даними огляду, надрукованого в Clinical Biochemist Reviews, застосування високоефективної рідинної хроматографії у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС) у клінічних лабораторіях надзвичайно зросло протягом останніх 10-12 років. Автори відзначають, що специфічність аналізу ВЕРХ-МС/МС значно перевершує імунологічні методи і класичну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) при аналізі молекул з низькою молекулярною вагою і має значно більшу продуктивність, ніж газова хроматографія-мас-спектрометрія. Популярність цього при рутинних клінічних аналізах нині пояснюється унікальними можливостями методу.

Основними перевагами методу ВЕРХ-МС/МС є:
• Можливість точного кількісного аналізу малих молекул;
• Одночасний аналіз множини цільових сполук;
• Унікальна специфічність;
• Висока швидкість аналізу.

В останні роки багато уваги приділяється часу аналізу і, як наслідок, підвищенню продуктивності лабораторії. Значне скорочення часу аналізу стало можливим завдяки застосуванню коротких аналітичних колонок для ВЕРХ/МС/МС, що одночасно різко збільшило специфічність аналізу. Використання методу іонізації при атмосферному тиску (API), тандемного потрійного квадрупольного мас-спектрометра та вдосконаленої високоефективної рідинної хроматографії, а також відповідних методів підготовки зразків, привели ВЕРХ-МС/МС у перші ряди сучасних аналітичних методів.

Основні сфери застосування ВЕРХ/МС/МС у клінічній медицині:
• Отримання повного профілю метаболізму стероїдів (steroids panels), пуринів та піримідинів та інших сполук,
  скринінг новонароджених на вроджені помилки метаболізму (виявлення кількох десятків захворювань за аналіз);
• Терапевтичний моніторинг лікарських препаратів — імунодепресантів, перотивосудомних, антиретровірусних, антикоагулянтів та будь-яких інших – незалежно від наявності наборів виробника. Не потрібно купувати дорогі набори кожної речовини – можна розробляти власні методики;
• Клінічна токсикологія – аналіз понад 500 наркотичних сполук та їх метаболітів за один аналіз, без підтверджуючого аналізу
  протеоміка та метаболоміка.

Крім того, ВЕРХ-МСМС використовується для скринінгу олігосахаридового в сечі, сульфатиду, довжиноланцюгових жирних кислот, довжиноланцюгових жовчних кислот, метилмалонової кислоти, дослідження порфірій, скринінгу пацієнтів з порушеннями пуринового та піримідинового метаболізму.

Приклади застосування рідинної хроматографії
у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією у клінічних аналізах.

Скринінг новонароджених:Першим прикладом масового застосування ВЕРХ-МС/МС у клінічній діагностиці був скринінг вроджених помилок метаболізму у новонароджених. В даний час в розвинених країнах це рутинний метод і охоплює більше 30 різних захворювань, включаючи ацедемії, аміноацидопатії, дефекти окислення жирних кислот. Слід особливо відзначити дослідження вроджених дефектів, які можуть призвести до серйозних проблем, якщо не вжити негайних заходів (наприклад, збільшені серце або печінка або набряк мозку). Перевагою використання ВЕРХ-МС/МС для скринінгу новонароджених є можливість одночасно аналізу всіх амінокислот та ацилкарнітинів швидким, недорогим та високоспецифічним методом.

Терапевтичний моніторинг лікарських засобів:Розробка та впровадження імунодепресанту сиролімусу (рапаміцин) для запобігання відторгненню органів після трансплантації була одним із основних стимулів впровадження ВЕРХ-МС/МС у клінічні лабораторії. Сучасний метод ВЕРХ-МС/МС дає можливість одночасного визначення такролімусу, сиролімусу, циклоспорину, еверолімусу та мікофенойної кислоти.

ВЕРХ-МС/МС застосовується також для аналізу цитотоксичних, антиретровірусних лікарських речовин, трициклічних антидепресантів, антиконвульсантів та інших препаратів, що потребують індивідуального дозування.

Метод ВЕРХ-МСМС дозволяє розділити та кількісно визначити R- та S-енантіомери варфарину в діапазоні концентрацій 0.1-500 нг/мл.

Наркотичні та болезаспокійливі речовини:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується для аналізу цих сполук завдяки простоті пробопідготовки та малому часу аналізу. В даний час метод використовується в клінічних лабораторіях для скринінгу на наявність широкого спектра наркотичних речовин. Унікальна специфічність та чутливість методу дає можливість одночасного аналізу понад 500 сполук різних класів в одній пробі з мінімальною пробопідготовкою. Так, у разі аналізу сечі досить простого розведення проби в 50-100 разів. При аналізі волосся замість пучка 100-200 волосся для достовірного виявлення фактів споживання наркотичних засобів досить одиничного волосся.

Ендокринологія та аналіз стероїдів:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується в багатьох ендокринологічних лабораторіях для аналізу стероїдів – тестостерону, кортизолу, альдестерону, прогестерону, естріолу та багатьох інших.

Дедалі більше лабораторій починають використовувати ВЕРХ-МС/МС визначення рівня у крові вітаміну Д3 і Д2.

I. Визначення стероїдів (steroid profile).

Лабораторії при лікарнях та клініках нині мають можливість проводити за допомогою ВЕРХ/МС/МС одночасне визначення кількох стероїдів. При цьому немає потреби у великому обсязі зразка, що особливо важливо при аналізах дитячих зразків.

Випадки, за яких доцільно проводити визначення кількох (профілювання) стероїдів:
• Природжена гіперплазія надниркових залоз (Congenital adrenal hyperplasia, CAH) є вродженим дефектом біосинтезу стероїдів. Це спадкова група захворювань, викликана неправильною активністю ензимів кори надниркових залоз, що веде до зниження вироблення кортизолу. Для достовірної діагностики САН рекомендується визначати кортизол, андростендіон та 17-оксипрогестерон. ВЕРХ/МС/МС дозволяє проводити точне кількісне визначення всіх трьох стероїдів за один аналіз зі 100% достовірністю.
• Рутинний скринінг новонароджених з використанням імуноаналізів відрізняється високим рівнем лонопозитивних та хибнонегативних результатів. Визначення за допомогою ВЕРХ/МС/МС не тільки кортизолу, а й альдостерону та 11-деоксикортизолу дозволяє відрізнити первинну недостатність кори надниркових залоз від вторинної.
• ВЕРХ/МС/МС дозволяє проводити визначення стероїдів при простатиті та синдромі хронічного тазового болю.
• ВЕРХ-МС/МС дозволяє визначити профіль стероїдів та ідентифікувати причини передчасного статевого дозрівання, пов'язаного з корою надниркових залоз, у маленьких дітей. Було знайдено, що концентрації тестостерону, андростендіону, дегідроепіандростерону (DHEA) та його сульфату у цих дітей були дещо вищими, ніж у старших дітей контрольної групи.
• Сироватка крові активних курців, пасивних курців і некурців, аналізується на присутність 15 стероїдних гормонів і тиреоїдних гормонів для дослідження зв'язку між пацієнтами, схильними до дії диму, і концентраціями гормонів.
• ВЕРХ/МС/МС використовується для профілювання деяких жіночих стероїдних гормонів у сечі.
• За допомогою ВЕРХ/МС/МС було проведено оцінку концентрацій нейроактивних гормонів з метою запобігання діабетичній нейропатії.

ІІ. Визначення тиреоїдних гормонів

Рутинні методи визначення тиреоїдних гормонів зазвичай засновані на радіоімуноаналізі, який є дорогим і дозволяє визначати тільки Т3 та Т4, що може обмежувати можливості визначення та повного регулювання функцій щитовидної залози.

• В даний час при використанні ВЕРХ-МСМС проводиться одночасний аналіз у зразках сироватки крові п'яти тиреоїдних гормонів, включаючи тироксин (Т4), 3,3′,5-трииодотиронин (Т3), 3,3′,5′- (rT3), 3 ,3'- дііодотиронін (3,3'-T2) та 3,5-дііодотиронін (3,5-T2) в діапазоні концентрацій 1 -500 нг/мл.
• Метод ВЕРХ/МС/МС застосовується також для аналізу складу гормонів пацієнтів, які пройшли тиреоїдектомію. Визначаються рівні концентрацій тироксину (Т4), трійодотіроніна (Т3), вільного Т4 і тиреоїд стимулюючого гормону (ТSH) після операції. Встановлено, що ВЕРХ/МС/МС є чудовим способом встановлення взаємозв'язку між ТSH та концентраціями тиреоїдних гормонів.
• Метод ВЕРХ/МС/МС був застосований для визначення тироксину (Т4) у слині та сироватці крові людини. Метод відрізняється високою відтворюваністю, точністю та межею виявлення 25 пкг/мл. Проведені дослідження показали, що існує діагностична залежність у концентраціях Т4 у слині між еутиреоїдними випробуваними та пацієнтами з хворобою Грейвса.

Метод ВЕРХ/МС/МС в даний час має чутливість, специфічність і точність, необхідних для надійного визначення всіх стероїдів в біологічних рідинах і таким чином підвищує діагностичні можливості, особливо у разі визначення наборів стероїдів.

ІІІ. Визначення 25-оксівітаміну Д методом ВЕРХ/МС/МС

25-окси вітамін Д (25ОД) є основною циркулюючою формою вітаміну Д і попередником його активної форми. (1,25-діоксівітамін Д). Зважаючи на тривалий період його напіввиведення, визначення 25ОД важливе для визначення статусу вітаміну Д в організмі пацієнта. Вітамін Д існує у двох формах: вітамін Д3 (холекальциферол) та вітамін Д2 (ергокальциферол). Обидві форми метаболізують у відповідні 25ОД форми. Дуже велике значення для діагностики має наявність аналітичних методів, які можуть визначати з високою точністю обидві форми вітаміну і дозволяють проводити моніторинг пацієнтів з порушеннями вмісту вітаміну Д. Застосовувані методи досі не дозволяли проводити роздільне визначення вітаміну Д2 і Д3. Крім того, при високих концентраціях вітаміну Д2 занижується кількість Д3, що визначається. Іншим недоліком є ​​застосування радіоактивних ізотопів. Застосування методу ВЕРХ/МС/МС дозволило уникнути застосування радіоактивних ізотопів, а й проводити роздільне визначення обох активних форм вітаміну.

Метод застосовний для наступних пацієнтів:
1. При підозрі на зниження вмісту вітаміну Д в організмі;
2. При підозрі на незрозумілий токсичний вплив;
3. При обстеженні пацієнтів, які проходили курс лікування щодо зниженого вмісту вітаміну Д;
4. Використання ВЕРХ/МС/МС дозволило проводити окреме визначення обох форм моніторингу пацієнтів.

IV. Визначення імунодепресантів методом ВЕРХ/МС/МС

Після трансплантації органів необхідно приймати імунодепресанти протягом усього життя, щоб уникнути реакції відторгнення. Маючи дуже вузький терапевтичний діапазон і високу токсичність, імунодепресанти вимагають індивідуального дозування для досягнення максимального ефекту. Тому життєво важливим є моніторинг основних імунодепресантів: циклоспорину А, такролімусу, сиролімусу та еверолімусу для регулювання дози ліків для кожного індивідуального пацієнта залежно від концентрації препарату в крові.

Імуноаналіз все ще використовується для моніторингу перелічених лікарських препаратів, проте ці методи дорогі та їх специфічність, точність та відтворюваність обмежені. Відомі випадки загибелі пацієнтів від неправильного дозування імунодепресантів, що ґрунтуються на результатах, отриманих за допомогою імунологічних методів. Нині імуноаналізи замінюються у клінічних лабораторіях на ВЕРХ/МС/МС. Так, у клініці університету Мюнхена щодня проводиться аналіз близько 70 зразків на вміст сиролімусу та циклоспорину А з використанням ВЕРХ/МС/МС системи. Вся підготовка зразків та керування приладом здійснюється одним співробітником. Лабораторія переключається також аналіз такролімусу цим методом.

• Описано застосування ВЕРХ/МС/МС для одночасного рутинного визначення такролімусу, сиролімусу, аскоміцину, деметиксисиролімусу, циклоспорину А і циклоспорину G в крові. Діапазон обумовлених концентрацією 1.0 - 80.0 нг/мл. Для циклоспорину 25 - 2000 нг/мл. Протягом року у лабораторії було проаналізовано понад 50,000 зразків.
• Оскільки було встановлено, що одночасне застосування такролімусу та сиролімусу дає позитивний терапевтичний ефект, було розроблено простий та ефективний ВЕРХ/МС/МС метод роздільного їх визначення у крові для клінічних аналізів. Аналіз одного зразка займає 2.5 хвилини з точністю від 2.46% - 7.04% для такролімусу і 5.22% - 8.30% для сиролімусу для всієї аналітичної кривої. Нижня межа визначення такролімусу 0.52 нг/мл, сиролімусу - 0.47 нг/мл.

V. Визначення гомоцистеїну методом ВЕРХ/МС/МС

Гомоцистеїн становить інтерес при серцево-судинних захворюваннях (тромбоемболії, хворобах серця, атеросклерозі) та інших клінічних станах (депресії, хвороби Альцхаймера, остеопорозі, ускладненнях при вагітності та ін.). Існуючі методи аналізу гомоцистеїну, включаючи імуноаналіз, є дорогими. Розроблено швидкий ВЕРХ/МС/МС метод аналізу гомоцистеїну для клінічного застосування рутинного при аналізі великої кількості зразків. Іонізація проводилася методом електророзпилення. Метод є відтворюваним, високоспецифічним та точним. Достоїнствами методу є також низька вартість реагентів та простота пробопідготовки. На добу можна проводити аналіз 500 і більше зразків.

Висновок

Слід зазначити, що навіть при тому, що в даний час використовуються значно вдосконалені методи імуноаналізу, в силу технічних принципових обмежень, даний метод ніколи не матиме порівнянну з ВЕРХ-МСМС точність і специфічність до цільової речовини, особливо в присутності метаболітів. Це не тільки призводить до низької точності методу ІФА та високого відсотка хибно-позитивних та хибно-негативних результатів, але й не дозволяє порівнювати результати, отримані у різних клінічних відділеннях при використанні методу ІФА. Застосування ВЕРХ-МС/МС усуває цей недолік, дозволяє проводити високоспецифічний, точний та швидкий аналіз великої кількості зразків з високою достовірністю у присутності метаболітів та відсутності перешкод від супутніх та ендогенних речовин, що перебувають у плазмі та крові пацієнтів.

Незважаючи на дорожнечу приладового комплексу, як показує світова практика, при правильній експлуатації, даний комплекс окупається за 1-2 роки. Це відбувається, перш за все, завдяки низькій собівартості одного аналізу за рахунок одночасного аналізу десятків і сотень сполук та відсутності необхідності придбання дорогих діагностичних наборів. Крім цього, у лабораторії з'являється можливість самостійно розробляти будь-які необхідні методики аналізу та не залежати від виробника наборів.

Вибір правильної конфігурації приладового комплексу

Існує велика кількість різних методів мас-спектрометрії та типів мас-спектрометрів, призначених для вирішення найрізноманітніших завдань – від структурної ідентифікації складних білкових макромолекул масою сотні тисяч Дальтон до рутинного високопродуктивного кількісного аналізу малих молекул.

Для успішного вирішення поставленої задачі однією з основних умов є вибір правильного типу обладнання. Немає універсального приладу, що дозволяє вирішувати весь спектр аналітичних завдань. Так, прилад, призначений на вирішення завдання ідентифікації мікроорганізмів, неспроможний проводити кількісний аналіз малих молекул. І навпаки. Справа в тому, що, незважаючи на загальну назву, це абсолютно різні прилади, що працюють на різних фізичних принципах. У першому випадку це часпрогоновий мас-спектрометр з лазерним джерелом іонізації - MALDI-TOF, а в другому - потрійний квадруполь з іонізацією електроспреєм - ВЕРХ-МСМС.

Другим за значимістю параметром є вибір правильної конфігурації системи. Існує кілька основних виробників мас-спектрометричного обладнання. У приладів кожного виробника є не лише свої сильні, але й слабкі сторони, про які вони зазвичай вважають за краще мовчати. Кожен виробник випускає свою лінійку приладів. Вартість одного аналітичного комплексу знаходиться в інтервалі вартістю від 100 000 до 1 000 000 і більше доларів. Вибір оптимального виробника і правильної конфігурації устаткування дозволить як заощадити значні фінансові ресурси, а й ефективніше вирішувати поставлене завдання. На жаль, існує багато прикладів, коли обладнання лабораторії проводилося без урахування цих факторів. Результат - обладнання, що простоює, даремно витрачені гроші.

Третім чинником, визначальним успішну роботу лабораторії, є персонал. Для роботи на мас-спектрометрах потрібний висококваліфікований персонал. На жаль, в жодному ВНЗ Росії немає курсу сучасної практичної мас-спектрометрії, особливо стосовно клінічних додатків, і завдання навчання персоналу кожної лабораторії доводиться вирішувати самотужки. Звісно, ​​2-3 днів ознайомлювального тренінгу, проведеного виробником після запуску устаткування, цілком замало розуміння основ методу та придбання навичок роботи у приладі.

Четвертим чинником є ​​готових методик аналізу. Кожна лабораторія має свої пріоритетні завдання, для вирішення яких необхідно розробляти свої методики. Робити це може людина, яка має досвід роботи на приладі не менше 2-3 років. Фірми-виробники іноді постачають одну-дві загальні методики рекомендаційного характеру, але адаптують їх під конкретні завдання лабораторії.

У ТОВ «БіоФармЕксперт»працюють фахівці з багаторічним стажем роботи на різних типах мас-спектрометрів, а також розроблення методик та постановка високопродуктивних аналізів. Тому ми надаємо такі послуги:

1. Вибір оптимальної конфігурації пристрою під конкретні завдання клієнта.
2. Закупівля, постачання та запуск обладнання провідних виробників тандемних мас-спектрометрів. Поетапне навчання персоналу протягом року з моменту запуску обладнання.
3. Набір готових методик та баз даних для вирішення основних клінічних завдань.
4. Розробка методик аналізу та вирішення конкретних завдань клієнта у його лабораторії із залученням його персоналу.
5. Методична підтримка всіх стадіях роботи.

[06-225 ] Аналіз крові на амінокислоти (32 показники)

5645 руб.

Замовити

Амінокислоти – важливі органічні речовини, у структурі яких знаходяться карбоксильна та амінна групи. Комплексне дослідження, що визначає вміст амінокислот та їх похідних у крові дозволяє виявити вроджені та набуті порушення амінокислотного обміну.

* Склад дослідження:

1. Аланін (ALA)
2. Аргінін (ARG)
3. Аспарагінова кислота (ASP)
4. Цитрулін (CIT)
5. Глутамінова кислота (GLU)
6. Гліцин (GLY)
7. Метіонін (MET)
8. Орнітін (ORN)
9. Фенілаланін (PHE)
10. Тирозин (TYR)
11. Валін (VAL)
12. Лейцин (LEU)
13. Ізолейцин (ILEU)
14. Гідроксипролін (HPRO)
15. Серін (SER)
16. Аспарагін (ASN)
17. Глутамін (GLN)
18. Beta-аланін (BALA)
19. Таурін (TAU)
20. Гістидин (HIS)
21. Треонін (THRE)
22. 1-метилгістидин (1MHIS)
23. 3-метилгістидин (3MHIS)
24. Alpha-аміномасляна к-та (AABA)
25. Пролін (PRO)
26. Цистатіонін (CYST)
27. Лізин (LYS)
28. Цистін (CYS)
29. Цистеїнова кислота (CYSA)

Синоніми росіяни

Скринінг аміноацидопатій; амінокислотний профіль.

Синонімианглійські

Amino Acids Profile, Plasma.

Методдослідження

Високоефективна рідинна хроматографія.

Який биоматериал можна використовуватиме дослідження?

Венозну кров.

Як правильно підготуватись до дослідження?

• Виключити із раціону алкоголь протягом 24 годин до дослідження.
• Чи не приймати їжу протягом 8 годин до дослідження, можна пити чисту негазовану воду.
• Повністю виключити прийом лікарських засобів протягом 24 годин перед дослідженням (за погодженням з лікарем).
• Виключити фізичну та емоційну перенапругу протягом 30 хвилин до дослідження.
• Не курити протягом 30 хвилин до дослідження.

Загальна інформація про дослідження

Амінокислоти - органічні речовини, що містять карбоксильні та амінні групи. Відомо близько 100 амінокислот, але в синтезі білка беруть участь лише 20. Дані амінокислоти називаються "протеїногенними" (стандартними) і по можливості синтезу в організмі класифікуються на замінні та незамінні. До незамінних амінокислот відносяться аргінін, валін, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін. Замінними амінокислотами є аланін, аспарагін, аспартат, гліцин, глутамат, глутамін, пролін, серин, тирозин, цистеїн. Протеїногенні та нестандартні амінокислоти, їх метаболіти беруть участь у різних обмінних процесах в організмі. Дефект ферментів на різних етапах трансформації речовин може призводити до накопичення амінокислот та їх продуктів перетворення, негативно впливати на стан організму.

Порушення метаболізму амінокислот можуть бути первинними (уродженими) або вторинними (придбаними). Первинні аміноацидопатії зазвичай успадковуються аутосомно-рецесивно або зчеплені з Х-хромосомою і виявляються в ранньому дитячому віці. Захворювання розвиваються внаслідок генетично обумовленого дефіциту ферментів та/або транспортних білків, пов'язаних із метаболізмом певних амінокислот. У літературі описано понад 30 варіантів аміноацидопатії. Клінічні прояви можуть змінюватись від легких доброякісних порушень до тяжкого метаболічного ацидозу або алкалозу, блювання, затримки розумового розвитку та росту, летаргії, коми, синдрому раптової смерті новонароджених, остеомаляції та остеопорозу. Побічні порушення обміну амінокислот можуть бути пов'язані із захворюваннями печінки, шлунково-кишкового тракту (наприклад, виразковий коліт, хвороба Крона), нирок (наприклад, синдром Фанконі), недостатнім або неадекватним харчуванням, новоутвореннями. Рання діагностика та своєчасне лікування дозволяють запобігти розвитку та прогресуванню симптомів захворювання.

Дане дослідження дозволяє комплексно визначити концентрацію в крові стандартних та непротеїногенних амінокислот, їх похідних та оцінити стан амінокислотного обміну.

Аланін (ALA) здатний синтезуватись в організмі людини з інших амінокислот. Він бере участь у процесі глюконеогенезу у печінці. За деякими даними, підвищений вміст аланіну в крові асоційований з підвищенням артеріального тиску, індексу маси тіла, .

Аргінін (ARG) залежно від віку та функціонального стану організму відноситься до напівзамінних амінокислот. У зв'язку з незрілістю ферментних систем недоношені діти не здатні до його утворення, тому потребують зовнішнього джерела надходження цієї речовини. Підвищення потреби в аргініні виникає при стресі, оперативному лікуванні, травмах. Дана амінокислота бере участь у розподілі клітин, загоєнні ран, вивільненні гормонів, утворенні окису азоту та сечовини.

Аспарагінова кислота (ASP) може утворюватися з цитруліну та орнітину і бути попередником деяких інших амінокислот. Аспарагінова кислота та аспарагін (ASN)беруть участь у глюконеогенезі, синтезі пуринових основ, азотистому обміні, функції АТФ-синтетази. У нервовій системі аспарагін грає роль нейротрансмітера.

Цитрулін (CIT) може утворюватися з орнітину або аргініну та є важливим компонентом циклу утворення сечовини у печінці (орнітинового циклу). Цитрулін входить до складу філаггріна, гістонів та відіграє роль в аутоімунному запаленні при ревматоїдному артриті.

Глутамінова кислота (GLU) - Замінна амінокислота, яка має велике значення в азотистому обміні. Вільна глутамінова кислота використовується в харчовій промисловості як підсилювач смаку. Глутамінова кислота та глутаматє важливими збуджуючими нейротрансмітерами у нервовій системі. Зниження вивільнення глутамату відзначається при класичній фенілкетонурії.

Гліцин (GLY) є замінною амінокислотою, яка може утворюватися із серину під дією піридоксину (вітаміну В6). Він бере участь у синтезі білків, порфіринів, пуринів і є гальмівним медіатором у центральній нервовій системі.

Метіонін (MET) - Незамінна амінокислота, максимальний вміст якої визначається в яйцях, кунжуті, злаках, м'ясі, рибі. З нього може утворюватися гомоцистеїн. Дефіцит метіоніну призводить до розвитку стеатогепатиту;

Орнітін (ORN) не кодується людською ДНК і не включається в синтез білка. Дана амінокислота утворюється з аргініну та відіграє ключову роль у синтезі сечовини та виведенні аміаку з організму. Препарати, що містять орнітин, застосовуються для лікування цирозу, астенічного синдрому.

Фенілаланін (PHE) - Незамінна амінокислота, яка є попередником тирозину, катехоламінів, меланіну. Генетичний дефект метаболізму фенілаланіну призводить до накопичення амінокислоти та її токсичних продуктів та розвитку аміноацидопатії – фенілкетонурії. Захворювання асоційоване з порушеннями розумового та фізичного розвитку, судомами.

Тирозин (TYR)надходить до організму з їжею або синтезується з фенілаланіну. Є попередником нейротрансмітерів (дофаміну, норадреналіну, адреналіну) та пігменту меланіну. При генетичних порушеннях метаболізму тирозину виникає тирозинемія, що супроводжується пошкодженням печінки, нирок та периферичною нейропатією. Важливе диференційно-діагностичне значення має відсутність підвищення рівня тирозину в крові при фенілкетонурії, на відміну від деяких інших патологічних станів.

Валін (VAL), лейцин (LEU)і ізолейцин (ILEU)– незамінні амінокислоти, які є важливими джерелами енергії у м'язових клітинах. При ферментопатіях, які порушують їхній метаболізм і призводять до накопичення даних амінокислот (особливо лейцину), виникає "хвороба кленового сиропу" (лейциноз). Патогномонічною ознакою даного захворювання є солодкий запах сечі, який нагадує кленовий сироп. Симптоми аміноацидопатії виникають з раннього віку і включають блювання, зневоднення, летаргію, гіпотонію, гіпоглікемію, судоми та опистотонус, кетоацидоз та патологію центральної нервової системи. Захворювання нерідко закінчується летально.

Гідроксипролін (HPRO)утворюється при гідроксилювання проліну під впливом вітаміну С. Дана амінокислота забезпечує стабільність колагену та є головною його складовою. При дефіциті вітаміну С порушується синтез гідроксипроліну, знижується стабільність колагену та виникає ушкодження слизових оболонок – симптоми цинги.

Серін (SER)входить до складу практично всіх білків і бере участь у формуванні активних центрів багатьох ферментів організму (наприклад, трипсину, естераз) та синтез інших замінних аміноксилот.

Глутамін (GLN)є частково замінною амінокислотою. Потреба у ньому значно зростає при травмах, деяких шлунково-кишкових захворюваннях, інтенсивних фізичних навантаженнях. Він бере участь у азотистому обміні, синтезі пуринів, регуляції кислотно-лужного балансу, виконує нейромедіаторну функцію. Ця амінокислота прискорює процеси загоєння та відновлення після травм та операцій.

Гамма-аміномасляна кислота (GABA)синтезується з глутаміну та є найважливішим гальмівним нейромедіатором. Препарати ГАМК застосовують для лікування різних неврологічних порушень.

Бета-аміноізомасляна кислота (BAIBA)є продуктом метаболізму тиміну та валіну. Підвищення її рівня в крові спостерігається при дефіциті бета-аміноізобутірат-піруват-амінотрансферази, голодуванні, отруєнні свинцем, променевої хвороби та деяких новоутвореннях.

Альфа-аміномасляна кислота (AABA)- Попередник синтезу офтальмової кислоти, що є аналогом глутатіону в кришталику ока.

Бета-аланін (BALA),на відміну від альфа-аланіну, не бере участь у синтезі білків в організмі. Дана амінокислота входить до складу карнозину, який як буферна система перешкоджає накопиченню кислот у м'язах під час фізичних навантажень, зменшує м'язовий біль після тренувань, прискорює процеси відновлення після травм.

Гістидин (HIS)- незамінна амінокислота, яка є попередником гістаміну, входить до складу активних центрів багатьох ферментів, міститься в гемоглобіні, сприяє відновленню тканин. При рідкісному генетичному дефекті гістидази виникає гістидинемія, яка може виявитися гіперактивністю, затримкою розвитку, труднощами при навчанні та в деяких випадках розумовою відсталістю.

Треонін (THRE)– есенціальна амінокислота, необхідна для синтезу білка та утворення інших амінокислот.

1-метилгістидин (1MHIS)є похідним ансерину. Концентрація 1-метилгістидину в крові та сечі корелює з вживанням м'ясної їжі та зростає при дефіциті. Підвищення рівня даного метаболіту виникає при дефіциті карозинази в крові та спостерігається при хворобі Паркінсона, розсіяному склерозі.

3-метилгістидин (3MHIS)є продуктом метаболізму актину та міозину та відображає рівень розпаду білків у м'язовій тканині.

Пролін (PRO)синтезується в організмі із глутамату. Гіперпролінемія внаслідок генетичного дефекту ферментів або на тлі неадекватного харчування, підвищеного вмісту молочної кислоти в крові, захворювань печінки може призводити до судом, розумової втоми та іншої неврологічної патології.

Лізин (LYS)– есенціальна амінокислота, яка бере участь у формуванні колагену та відновленні тканин, функції імунної системи, синтезі білків, ферментів та гормонів. Недостатність гліцину в організмі призводить до астенії, зниження пам'яті та порушення репродуктивних функцій.

Альфа-аміноадипінова кислота (AAA)- Проміжний продукт метаболізму лізину.

Цистеїн (CYS)є незамінною амінокислотою для дітей, людей похилого віку та людей з порушенням всмоктування поживних речовин. У здорових людей ця амінокислота синтезується з метіоніну. Цистеїн входить до складу кератинів волосся, нігтів, бере участь у формуванні колагену, є антиоксидантом, попередником глутатіону і захищає печінку від шкідливої ​​дії метаболітів алкоголю. Цістінє димерною молекулою цистеїну. При генетичному дефекті транспорту цистину в ниркових канальцях та стінках кишечника виникає цистинурія, що призводить до формування каменів у нирках, сечоводах та сечовому міхурі.

Цистатіонін (CYST)- Проміжний продукт обміну цистеїну при його синтезі з гомоцистеїну. При спадковому дефіциті ферменту цистатіонази або набутому гіповітамінозі В 6 рівень цистатіоніну в крові та сечі підвищується. Даний стан описується як цистатіонінурія, яка протікає доброякісно без явних патологічних ознак, проте в поодиноких випадках може виявлятися дефіцитом інтелекту.

Цистеїнова кислота (CYSA)утворюється при окисленні цистеїну та є попередником таурину.

Таурін (TAU)синтезується з цистеїну і, на відміну від амінокислот, є сульфокислотою, що містить сульфогрупу замість карбоксильної групи. Таурін входить до складу жовчі, бере участь в емульгації жирів, є гальмівним нейромедіатором, покращує репаративні та енергетичні процеси, має кардіотонічні та гіпотензивні властивості.

У спортивному харчуванні амінокислоти та протеїни знайшли широке поширення та використовуються для збільшення м'язової маси. У вегетаріанців через відсутність у раціоні тваринного білка може виникнути дефіцит деяких незамінних амінокислот. Дане дослідження дозволяє оцінити адекватність таких видів харчування та за необхідності провести їх корекцію.

Навіщо використовується дослідження?

• Діагностика спадкових та набутих захворювань, пов'язаних із порушенням метаболізму амінокислот;
• диференціальна діагностика причин порушень азотистого обміну; виведення аміаку з організму;
• моніторинг дотримання дієтотерапії та ефективності лікування;
• оцінка харчового статусу та модифікація харчування.

Коли призначається дослідження?

• При підозрі на порушення метаболізму амінокислот у дітей, у т. ч. новонароджених (блювання, діарея, метаболічний ацидоз, особливий запах та забарвлення пелюшок, порушення розумового розвитку);
• при гіперамоніємії (збільшенні рівня аміаку в крові);
• при обтяженому сімейному анамнезі, наявності уроджених аміноацидопатій у родичів;
• під час контролю над дотриманням дієтичних рекомендацій, ефективності лікування;
• при обстеженні спортсменів (наприклад, бодібілдерів), які вживають спортивне харчування (протеїни та амінокислоти);
• під час обстеження вегетаріанців.

Що означає результати?

• Аланін (ALA):

• Аргінін (ARG):

• Аспарагінова кислота (ASP):

• Цитрулін (CIT):

• Глутамінова кислота (GLU):

• Гліцин (GLY)

• Метіонін (MET)

• Орнітін (ORN)

• Фенілаланін (PHE)

• Тирозин (TYR)

• Валін (VAL)

• Лейцин (LEU)

• Ізолейцин (ILEU)

• Гідроксипролін (HPRO)

• Серін (SER)

• Аспарагін (ASN)

• Alpha-аміноадипінова кислота (AAA)

• Глутамін (GLN)

• Beta-аланін (BALA): 0 - 5 мкмоль/л.
• Таурін (TAU)

• Гістидин (HIS)

• Треонін (THRE)

• 1-метилгістидин (1MHIS)

• 3-метилгістидин (3MHIS)

• Gamma-аміномасляна к-та (GABA)

• Beta-аміноізомасляна к-та (BAIBA)

• Alpha-аміномасляна к-та (AABA): 0 - 40 мкмоль/л.
• Пролін (PRO)

• Цистатіонін (CYST): 0 - 0,3 мкмоль/л.
• Лізин (LYS)

• Цистін (CYS)

• Цистеїнова кислота (CYSA): 0.

Інтерпретація результатів здійснюється з урахуванням віку, особливостей харчування, клінічного стану та інших лабораторних даних.

Збільшення загального рівня амінокислот у крові можливе при:

• еклампсії;
• порушення толерантності до фруктози;
• діабетичному кетоацидозі;
• ниркової недостатності;
• синдром Рейє.

Зниження загального рівня амінокислот у крові може виникнути при:

• гіперфункції кори надниркових залоз;
• лихоманці;
• хвороби Хартнупа;
• хореї Хантінгтона;
• неадекватне харчування, голодування (квашіоркоре);
• синдром мальабсорбції при тяжких захворюваннях шлунково-кишкового тракту;
• гіповітаміноз;
• нефротичний синдром;
• лихоманці паппатачі (москітної, флеботомної);
• ревматоїдний артрит.

Первинні аміноацидопатії

Підвищення аргініну, глутаміну- Дефіцит аргінази.

Підвищення аргінінсукцинату, глутаміну- Дефіцит аргіносукцинази.

Підвищення цитруліну, глутаміну- Цитрулінемія.

Підвищення цистину, орнітину, лізину- Цистинурія.

Підвищення валіна, лейцину, ізолейцину– хвороба кленового сиропу (лейциноз).

Підвищення фенілаланіну- фенілкетонурія.

Підвищення тирозину- Тирозинемія.

Вторинні аміноацидопатії

Підвищення глутаміну- Гіперамоніємія.

Підвищення аланіна- Лактацидоз (молочнокислий ацидоз).

Підвищення гліцину- Органічні ацидурії.

Підвищення тирозину- Транзиторна тирозинемія у новонароджених.

Література

• Part 8. Amino Acids. In: Scriver CR, Beaudet AL, Valle D, Sly WS, Childs B, Kinzler KW, Vogelstein B, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York, NY: McGraw-Hill, Inc; 2001; 1665-2105.
• Part IV. Disorders of amino acid metabolism and transport. Fernandes J, Saudubray J-M, Van den Berghe G, eds. Inborn Metabolic Diseases Diagnosis and Treatment. 3 rd ed. New York, NY: Springer; 2000; 169-273.
• Part 2. Disorders of amino acid metabolism. Nyhan WL, Barshop BA, Ozand PT, eds. Atlas of Metabolic Diseases. 2 nd ed. New York, NY: Oxford University Press Inc; 2005; 109-189.
• Blau N, Duran M, Blaskovics ME, Gibson KM, eds. Physician's Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases. 2 nd ed. New York, NY: Springer; 2003.
• Human Metabolome Database. Режим доступу: http://www.hmdb.ca/

В епоху Нового часу з розквітом природничо-наукової думки особлива увага стала приділятися «тварини електрики». Допитливі уми були схвильовані досвідами Луїджі Гальвані, який змусив скорочуватися лапку жаби. Пізніше, з появою «вольтова стовпа», кожен, хто вважає себе сучасною людиною і натуралістом, проводив подібні експерименти. Фізичні властивості м'язової тканини досліджувалися за допомогою струму, і апофеозом «подібності до Творця» вважався досвід, при якому імпульс постійного струму змушував скорочуватися м'язи трупа.

З розвитком електротехніки та появою дослідів Фарадея з'явилося нове обладнання, яке дозволяло отримувати магнітні поля за допомогою струму та навпаки. Так, поступово народилася ідея використання безпосередньо електричного струму, а магнітного поля впливу на ділянки кори мозку. Адже магнітне поле народжує електричний струм, а він викликає різні процеси в організмі. Саме з цієї ідеї народився метод, який отримав назву транскраніальної магнітотерапії. Що це таке і як визначає його наука?

Визначення

ТКМС, або транскраніальна магнітна стимуляція - це спосіб, що застосовується в науковій та клінічній практиці, що дозволяє без болю та наведення електричного струму на відстані стимулювати кору головного мозку магнітним полем, отримуючи різні відповіді на вплив коротких імпульсів магнітного поля. Цей метод застосовується як для діагностики, так лікування деяких видів захворювань.

Суть методики та механізм дії

Прилад для електромагнітної стимуляції мозку ґрунтується на принципі збудження електромагнітної індукції. Відомо властивість струму, проходячи через котушку індуктивності, народжуватиме магнітне поле. Якщо підібрати характеристики струму і котушки так, щоб магнітне поле було сильним, а вихрові струми мінімальними, перед нами і буде апарат ТКМС. Основна послідовність подій може бути такою:

Блок приладу генерує імпульси високоамплітудних струмів, розряджаючи конденсатор, коли відбувається замикання високовольтного сигналу. Конденсатор відрізняється великою силою струму та високою напругою – ці технічні характеристики дуже важливі для отримання сильних полів.

Ці струми прямують у ручний зонд, у якому розташований генератор магнітного поля – індуктор.

Зонд переміщається дуже близько від шкіри голови, тому магнітне поле, що народжується, потужністю до 4 Тесла передається на кору головного мозку.

Сучасні індуктори мають примусове охолодження, оскільки вони однаково сильно нагріваються внаслідок вихрових струмів. Стосуватися тіла пацієнта ними не можна – можна отримати опік.

Чотири тесла – це дуже велика величина. Досить сказати, що це перевищує потужність високопідлогового МРТ-томографа, що дають по 3 Тл на великому кільці електромагнітів. Ця величина можна порівняти з даними великих дипольних магнітів Великого адронного колайдера.

Стимуляція може проводитись у різних режимах – однофазному, двофазному тощо.Можна вибрати тип котушки індуктора, які дозволяють дати по-різному сфокусоване магнітне поле на різну глибину мозку.

У корі породжуються вторинні процеси – деполяризація мембран нейронів та генерація електричного імпульсу. Метод ТМС дозволяє, переміщуючи індуктор, домогтися стимуляції різних ділянок кори та отримати різну відповідь.

Транскраніальна магнітна стимуляція потребує розшифрування результатів. Пацієнту спрямовуються серії різних імпульсів, а результатом є виявлення мінімального порогу моторної відповіді, його амплітуда, час затримки (латентність) та інші фізіологічні показники.

Якщо лікар впливає на кору, то в результаті можуть скорочуватися м'язи тулуба згідно з «руховим гомункулусом», тобто відповідно до кіркового представництва м'язів моторної зони. Це і є МВП, або викликані моторні потенціали.

Якщо при цьому на потрібний м'яз накласти датчики та провести електронейроміографію, то можна "продзвонити" нервову тканину з урахуванням характеристики наведеного імпульсу.

Показання до процедури

Крім функції дослідження, «штучний» імпульс, створений нейронами, може мати лікувальну дію при м'язових захворюваннях. У дітей із ДЦП процедура ТКМС стимулює розвиток м'язів, надає позитивний ефект при спастичності. Транскраніальна магнітна стимуляція застосовується для діагностики та лікування наступних захворювань:

• розсіяного склерозу та інших демієлінізуючих захворювань;
• церебрального атеросклерозу, дифузних судинних уражень головного мозку;
• наслідків поранень та травм головного та спинного мозку;
• радикулопатії, мієлопатії, ураження черепно-мозкових нервів (параліч Белла);
• хвороби Паркінсона та вторинного паркінсонізму;
• різних деменцій (Альцгеймер).

Крім цього, метод транскраніальної магнітної стимуляції може допомогти при діагностиці мовленнєвих порушень, при проблемах, пов'язаних з нейрогенним сечовим міхуром, при ангіоцефалгіях (мігрені) та при епілепсії.

Накопичено солідний досвід (переважно зарубіжний), коли ця методика застосовується при депресії, афективних станах та неврозах.Допомагає ТКМС при обсесивно-компульсивних станах (нав'язливому неврозі). Її курсове застосування сприяє ліквідації психотичної симптоматики при загостреннях шизофренії, а також при різних галюцинаціях.

Але такий метод, який використовує сильні магнітні поля, не може не мати протипоказань.

Протипоказання

Незважаючи на те, що ТКМС неінвазивна методика, її ефектором є сильні магнітні поля. Потрібно пам'ятати, що на відміну від МРТ, де людське тіло цілком піддається впливу потужного магнітного поля, транскраніальна магнітотерапія генерує його на відстані кілька сантиметрів. Є низка серйозних і навіть абсолютних протипоказань до її проведення, наприклад, феромагнітні матеріали всередині черепа (імплантати), або слухові апарати. Кардіостимулятор також є протипоказанням, але теоретичним, оскільки лише випадково може опинитися у зоні дії магнітного поля.

В даний час з'явилися прилади для глибокої стимуляції мозку, наприклад при хворобі Паркінсона. У разі проведення процедури також протипоказано.

До клінічних протипоказань відносяться:

• осередкові утворення центральної нервової системи, які можуть спричинити епіприпадок;
• призначення засобів, які можуть підвищити збудливість кори головного мозку (та отримати синхронний розряд);
• черепно-мозкова травма із тривалою втратою свідомості;
• анамнестично – припадок чи епілепсія, епіактивність на енцефалограмі;
• підвищений внутрішньочерепний тиск.

Як видно з вищевикладеного, основна небезпека – отримати синхронне півкульне або тотальне вогнище порушення нейронів кори, або епілептичний напад.

Про побічні ефекти

Наївно було б думати, що така серйозна дія, як вторинна індукція нейронного потенціалу дії сильним магнітним полем, може протікати без будь-яких побічних ефектів. До найчастіше виникаючих станів відносять:

• дискомфорт у шлунку та нудота;
• страх при несподіваних скорочення м'язів;
• почервоніння шкірних покривів;
• тимчасова втрата мови (при стимуляції зони Брока), що часто супроводжується насильницьким сміхом;
• болі в м'язах голови та обличчя;
• запаморочення та втома;
• тимчасова втрата слуху.

Також апарат застосовують дуже обережно під час роботи з дітьми. Стимулюючи моторні акти дитини, важко очікувати від неї повного контролю та розслаблення. Існує небезпека, що при випадковому проведенні зонда з котушкою біля серця апарат може спричинити порушення ритму серця. Зазвичай магнітне поле викликає екстрасистолію і допомоги не потрібно.Але у пацієнтів з миготливою аритмією при тиреотоксикозі це може призвести до погіршення стану.

У нашого малюка напади почалися в 2,5 місяці, але нічого не віщувало їх початок. Вагітність та пологи пройшли добре, спадковості ніякої немає. Тому для нас стало дуже важливо знайти причину епілепсії нашого малюка, щоб зрозуміти, як скоригувати лікування і чи можна нам ще планувати дітей.

Насамперед у терміновому порядку, якщо це щойно трапилося з вашою дитиною і ви не знаєте причини нападів, вам необхідно здати:

1) Кров на «ТМС» (Тандемна мас-спектрометрія (спектр ацилкарнітинів, амінокислот)). Майте на увазі, що здається капілярна кров на спеціальному бланку.

2) Сечу денну та ранкову на «Газову хроматографію зразків сечі (органічні ацидурії)»
Якщо у вашої дитини щось зі списку спадкових хвороб обміну, то чим швидше ви це з'ясуйте, тим швидше зможете починати спеціальне лікування та шансів, що дитина нормально розвиватиметься буде більше. Час тут проти вас.

Ми здавали ці аналізи (у народі, просто «центр на Москваріччі, буд.1»). На жаль, кров на ТМС там роблять близько 14 днів. Тому для швидкості ми здали кров на ТМС ще й у МЦ "Геномед". Так у вас є шанс отримати результати швидше, та й порівняти з коли отримаєте обидва висновки.

Якщо напади у вашої дитини почалися в неонатальному періоді, тобто сенс здати кров на «Панель "НБО з початком у неонатальний період" (амінокислоти, ацилкарнітини, органічні кислоти сечі, дуже довголанцюгові жирні кислоти, ізофокусування трансферинів)» в Медико-генетичному науковому центрі (У народі, просто «центр на Москваріччі, буд.1»).

3) Аналіз «Скринінг-тести на ЛБНв Медико-генетичному науковому центрі(У народі, просто «центр на Москваріччі, буд.1»). Це визначення активності лізосомних ферментів у плямах висушеної крові:β-D-глюкозидазу, a-D-глюкозидазу, a-L-ідуронідазу,сфінгомієліназу, галактоцереброзідазу, а-галактозидазу)»Так само коли ми привезли висушені краплі капіляр А краплях крові зробити ще про всяк випадок, якщо можна одну і ту ж кров використовувати для двох аналізів. Це ми так само зробили в Медико-генетичному науковому центрі (у народі просто «центр на Москваріччі, буд.1»).

4) Аналіз «Активність біотинідази»в Медико-генетичному науковому центрі(У народі, просто «центр на Москваріччі, буд.1»). Як нам пояснили, цей параметр є у переліку аналізу «кров на ТМС», але іноді під час загального аналізу показує норму, а якщо перездати на конкретно біотинідазу, то може показати відхилення. Робиться 1-2 тижні.

5) Аналіз Панель " Спадкові епілепсіїв МЦ «Геномед»(Вартість 33 000 руб). Робіть одночасно, т.к. роблять її насправді 4-5 календарних місяців. А час не чекає. Там зібрані всі поломки в генах, які можуть спричинити епілепсію. Якщо ж знайдуть поломку в гені, то є шанс дізнатися про те, як проходить лікування у дітей з такою самою поломкою в гені. Після аналізу обов'язково запишіться на консультацію, краще до .

​

За генетикою є центри в Німеччиниі США. Можете списатись із ними.

6) Аналіз « Хромосомний мікроматковий аналіз розширений» в МЦ "Геномед" (вартість 30 000 руб). Це подібно до каріотипу, тільки ретельніше. Шукають поломку у хромосомах, яка може викликати відхилення у розвитку. Роблять 14-30 днів.

7) Центр орфанних та інших рідкісних захворюваньу дітей при Морозівській лікарні. Ми ще там не були, але плануємо до них сходити з усіма аналізами, щоб вони нам підказали, які ще можна здати аналізи для пошуку причини епілепсії у нашого малюка. Доповнимо інформацію після відвідування.

8) Михайлова С.В.- зав.відділенням медичної генетики при РДКБ Усі ваші аналізи можна надіслати на електронну пошту, в темі вказати для Михайлової С.В. . Їй передадуть ваші аналізи і протягом кількох днів вам надішлють протокол засідання, в якому вкажуть, які аналізи вам ще можна зробити і до кого рекомендують звернутися.

9) Захарова Є.Ю – зав. Лабораторією спадкових хвороб обміну при Медико-генетичному науковому центрі (Москворіччя, 1). Ви також можете надіслати листа на ел.адресу (в темі вказати для Захарової Є.Ю.), з описом перебігу хвороби, з вашими аналізами і попросити порадити, які ще аналізи можна здати.

10) Харківський спеціалізований медико-генетичний центр (ХСМГЦ)під керівництвом д.м.н. Гречанина Юлії Борисівни. На форумі «Діти ангели» є ціла тема про цей інститут, до якого можна вислати потягом сечу для аналізу. Ви надсилаєте вашу історію хвороби, всі аналізи, висновки на електронну пошту, надсилаєте сечу поїздом і вам дають рекомендації фахівці центру.

1 ФДБУ «Медико-генетичний науковий центр» РАМН

2 ГБОУ ВПО «Ростовський державний медичний університет МОЗ Росії»

3 ДБУЗ "Краєва клінічна лікарня № 1 ім. професора С.В.Очаповського" департаменту охорони здоров'я Краснодарського краю

4 ФДБУ “Медико-генетичний науковий центр”

З метою обґрунтування впровадження масового обстеження новонароджених на спадкові хвороби обміну (НБО) методом тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) проведено ретроспективне дослідження архівних зразків крові дітей (n=86), які померли на першому році життя. Зміни профілів амінокислот та ацилкарнітинів виявлено у 4 випадках (4,7 %). В одному з них виявлено специфічне для хвороби запаху сечі кленового сиропу багаторазове підвищення концентрації лейцину, ізолейцину та валіну. Клінічна картина та виявлення мутації у першому екзоні гена BCKDHB (с.98delG) у гетерозиготному стані опосередковано підтвердили діагноз лейцинозу. В інших трьох випадках виявлені зміни профілю амінокислот та ацилкарнітинів не мають такого ж специфічного характеру. У цих випадках були б необхідні повторні дослідження крові методом МС/МС, додаткові клінічні та біохімічні дослідження. В результаті проведеного дослідження підтверджено необхідність впровадження методу МС/МС у програми неонатального скринінгу на НБО для їх своєчасної діагностики та лікування.

ретроспективна діагностика

тандемна мас-спектрометрія

спадкові хвороби обміну

1. Краснопільська К. Д. Спадкові хвороби обміну речовин. Довідковий посібник для лікарів. – М.: РГО «Центр соціальної адаптації та реабілітації дітей «Фохат», 2005. – 364 с.

2. Михайлова С. В., Захарова Є. Ю., Петрухін А. С. Нейрометаболічні захворювання у дітей та підлітків. Діагностика та підходи до лікування. – М.: «Літерра», 2011. – 352 с.

3. Chace H. D. Rapid diagnosis з MCAD хитромудрою цитатою octanoylcarnitine та інших acylcarnitines в новому блоці шлунка при тандему маси спектрометрії / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Clinical Chemistry. – 1997. – V. 43. – № 11. – Р. 2106-2113.

4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Atlas of metabolic diseases. - Second edition. - London: Hodder Arnold, 2005. - 788 p.

5. Rashed M. S. Clinical application of tandem mass spectrometry: 1 years diagnosis and screening for inherited metabolic diseases // J. of Chrom. B. – 2001. – V. 758. – № 27-48.

6. Sweetman L. Naming і counting disorders (counditions) входять в нове скріншення panels / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Pediatrics. – 2006. – V. 117. – P. 308-314.

7. Van Hove J. L. Medium-chain acl-CoA дегідрогенас нездатності: diagnosis з acylcarnititne analysis in blood/Van Hove JL, Zhang W., Kahler S. G. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 1993. – V. 52. – P. 958-966.

Вступ

На сьогоднішній день відомо понад 500 нозологічних форм спадкових хвороб обміну (НБО). Основна частина НБО зустрічається вкрай рідко, але їхня сумарна частота в популяції становить 1:1000-1:5000. Як правило, НБО маніфестують на першому році життя неспецифічними симптомами, що клінічно маскують їх під іншу, неспадкову соматичну патологію. Разом з тим, своєчасна діагностика метаболічних спадкових захворювань важлива, тому що для багатьох з них розроблені і продовжують розроблятися ефективні методи патогенетичного лікування, без якого захворювання часто залишається фатальним. Загальновизнано, що одним із найбільш виправданих та ефективних підходів до раннього виявлення спадкової патології є неонатальний генетичний скринінг. Розвиток методу тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) з електроспрейною іонізацією зробив великомасштабний мас-спектрометричний скринінг застосовним у практиці масового обстеження на НБО до кінця 90-х років ХХ століття. Цей високочутливий мікрометод дозволяє одночасно визначати у кількох мікролітрах крові концентрації десятків амінокислот та ацилкарнітинів, що мають значення для діагностики НБО. Ефективність лабораторного тесту МС/МС дозволила включити його до державних програм неонатального скринінгу новонароджених дітей на аміноацидопатії, органічні ацидурії та дефекти мітохондріального β-окислення жирних кислот у ряді країн. Тим не менш, в Російській Федерації метод МС/МС не впроваджено в систему масового обстеження новонароджених дітей і доступний для селективного скринінгу на НПВ лише в поодиноких федеральних медичних центрах.

Метою даного дослідження стало наукове обґрунтування необхідності включення до регіональних програм масового обстеження новонароджених дітей досліджень методом МС/МС для діагностики аміноацидопатій, органічних ацидурій та дефектів мітохондріального β-окислення жирних кислот на основі проведення ретроспективного мас-спектрометричного аналізу зразків крові хворих дітей, захворювання летальним кінцем на першому році життя.

Пацієнти та методи дослідження

В даний час ретроспективне дослідження включені діти (n=86, співвідношення хлопчики: дівчатка 48/38), які померли на першому році життя (у віці від 5 діб до 11 місяців життя) протягом одного календарного року (2010 рік) на адміністративній території Краснодарського краю . У дослідження включені діти з вродженими вадами розвитку (n=29), інфекційними захворюваннями - пневмонія, сепсис, бактеріальний менінгоенцефаліт (n=37), перинатальним ураженням ЦНС (n=11), синдромом раптової смерті (n=6) та іншими захворюваннями ( n = 3). Контрольну групу склали 438 клінічно здорових новонароджених дітей (227 дівчаток, 211 хлопчиків) віком 3-8 днів. У цій групі було визначено референсні значення концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у капілярній крові у здорових дітей періоду новонародженості.

Матеріалом дослідження послужили архівні зразки периферичної крові на стандартних паперових тест-бланках, отримані на 3-8 день життя, щодо стандартного неонатального скринінгу. Концентрацію амінокислот та ацилкарнітинів (табл. 1) у крові визначали методом тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) за допомогою квадрупольного тандемного мас-спектрометра Agilent 6410 (AgilentTechnologies, США) за сертифікованою методикою компанії CHROMSYSTEM № V0. виконано у лабораторії медичної генетики ДБОУ ВПО «Ростовський державний медичний інститут МОЗ Росії».

Таблиця 1

Метаболіти, що визначаються методом МС/МС

Статистична обробка даних проводилася з використанням пакету прикладних програм Statistica 6,0 та електронних таблиць Excel 2007. Для визначення описових числових характеристик змінних застосовувалися стандартні методики статистичного аналізу: розрахунок медіани, 0,5 і 99,5 перцентилів.

Для підтверджуючої молекулярно-генетичної діагностики лейцинозу проводили виділення ДНК із сухих плям крові, використовуючи набір реактивів DiatomDNAPrep (ТОВ Біоком, Росія). Підбір праймерів для ПЛР ампліфікації здійснювали для 10 екзонів генів BCKDHA та BCKDHB. Секвенування ПЛР-фрагментів для виявлення рідкісних мутацій проводилося згідно з протоколом фірми-виробника на генетичному аналізаторі ABIPrism 3500 (AppliedBiosystem, США).

Результати дослідження та їх обговорення

В результаті дослідження концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у периферичній крові 438 клінічно здорових новонароджених дітей було визначено 0,5 та 99,5 перцентіліконцентрацій досліджених метаболітів, які використовувалися нами надалі як референсні значення (табл. 2). Зіставлення концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів, визначених у зразках крові 86 померлих на першому році життя дітей, з референсними значеннями концентрацій, показало, що у 82 пацієнтів (95,3 %) жоден із досліджуваних показників не виходив за межі 0,5 та 99, 5 перцентилів контрольної групи, що дозволило відмовитися від робочої версії про наявність у них порушень обміну амінокислот та карнітинів, які не верифіковані прижиттєво. Однак у 4 дітей (4,7%) концентрації деяких амінокислот та ацилкарнітинів у кілька разів перевищували верхні межі референсного інтервалу контрольної групи (табл. 2).

Таблиця 2

Результати ретроспективної оцінки концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у новонароджених (n=4) з рівнем окремих метаболітів поза діапазоном 0,5-99,5 перцентилів

* Примітка:

Пацієнт 1 – хлопчик КМ (діагноз: обструктивний бронхіоліт), помер у віці 11 місяців;

Пацієнт 2 – хлопчик КФ (діагноз: пневмонія), помер у віці 1 місяця;

Пацієнт 3 – дівчинка ЛВ (діагноз: сепсис), помер у віці 12 діб.

Пацієнт 4 – дівчинка ПА (діагноз: пневмонія), померла у віці 6 діб.

У першому випадку у пацієнта КМ, який помер у віці 11 місяців, з діагнозом обструктивний бронхіоліт, тандемна мас-спектрометрія амінокислот і ацилкарнітинів в архівних зразках крові виявила зміни вмісту лейцину, ізолейцину та валіну, які носять досить специфічний характер. метаболічного дефекту в дорозі катаболізму лейцину та ізолейцину. У досліджених архівних зразках крові виявлено збільшення концентрації лейцину та ізолейцину більш ніж у 9 разів та валіну – більш ніж у 3 рази порівняно з референсними значеннями, що дозволяє припустити діагноз «хвороби із запахом сечі кленового сиропу».

З наявних клінічних даних на користь лейцинозу у дитини КМ свідчили наступні клінічні прояви: рання відмова від природного вигодовування, симптоми неонатальної енцефалопатії, наростання неврологічної симптоматики – зміни м'язового тонусу, судоми, епілепсія, затримка психомоторного розвитку. У дитини часто спостерігалися інфекційні захворювання дихальних шляхів з тяжким перебігом, які стали причиною облітеруючого бронхіоліту, що спричинив смерть у віці 11 місяців. Ми не маємо інформації про те, чи був у дитини специфічний запах сечі, але збільшення концентрації типових для лейцинозу метаболітів та характерна клінічна симптоматика підтверджують наше припущення. Крім того, на користь діагнозу хвороби запаху сечі кленового сиропу свідчать результати проведеної діагностики ДНК лейцинозу з використанням архівних зразків крові. Молекулярно-генетичний аналіз дозволив виявити у дитини делецію с.98delG у першому екзоні гена BCKDHB у гетерозиготному стані. Ця ж мутація виявлена ​​у крові матері. З огляду на обмежену кількість архівних зразків крові дитини та недоступність біологічного матеріалу її батька другу мутацію виявити не вдалося. Тим не менш, сукупність клінічних, біохімічних та молекулярно-генетичних даних підтверджують діагноз лейцинозу (або хвороби із запахом сечі кленового сиропу, MIM ID 248600) у вивченому випадку.

В інших трьох випадках виявлені зміни профілю амінокислот та ацилкарнітинів не мають такого ж специфічного характеру, як у попередньому випадку. Припускати певні НБО, ґрунтуючись на даних МС/МС, тим більше – затверджувати з достовірністю, у цих випадках неможливо. Для диференціальної діагностики аміноацидопатій та органічних ацидурій необхідні були б повторні дослідження крові методом МС/МС, додаткові клінічні та біохімічні дослідження.

Ступінь підвищення специфічних для захворювань метаболітів варіабельний і залежить від багатьох факторів. Характер харчування дитини, прийом деяких лікарських препаратів повинні враховуватись при інтерпретації результатів. Так, прийом препаратів, що містять вальпроєву кислоту або середньоланцюгові тригліцериди, призводить до підвищення С6, С8 та С10, що ускладнює діагностику недостатності середньоланцюгової ацил-КоАдегідрогенази. Прийом лікарських препаратів, що містять карнітин, також може призводити до підвищення концентрацій коротко- і середньоланцюжкових ацилкарнітинів. Вміст довголанцюгових ацилкарнітинів у плазмі та цільній крові по-різному, оскільки вони асоційовані з мембранами еритроцитів, отже, показник гематокриту має певне значення. За деяким винятком, півтора – дворазове збільшення концентрації потребує повторного аналізу крові. Так, патогномонічні для пропіонової та ізовалеріанової ацидурії рівні метаболітів зазвичай підвищуються більш ніж у 5 разів, а навіть незначна зміна концентрації глутарилкарнітину вимагає не тільки повторного аналізу крові, але й додаткового дослідження органічних кислот сечі, характерних для глутарової ацидурії I типу.

Висновок

Проведене методом МС/МС ретроспективне дослідження зразків крові дітей раннього віку, що померли від різних причин, дозволило припустити у ряді випадків спадкову патологію обміну речовин. В одному з них підтверджено діагноз хвороби запах сечі кленового сиропу (лейциноз). Своєчасні діагностичні заходи у подібних випадках є важливою складовою диференціальної діагностики вроджених помилок метаболізму. Дослідження концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у зразках біологічних рідин може мати діагностичну цінність в аналізі випадків дитячої смертності. Посмертно встановлений діагноз спадкового захворювання на обмін речовин у померлої дитини є показанням для медико-генетичного консультування сім'ї. Необхідне широке впровадження методу МС/МС у неонатальний скринінг як основного інструменту для виявлення аміноацидопатій, органічних ацидемій та дефектів β-мітохондріального окиснення жирних кислот у новонароджених для своєчасної діагностики та лікування НБО.

Рецензенти:

Полевиченко Олена Володимирівна, д-р мед. наук, професор, головний науковий співробітник відділу реабілітації та медико-соціальної допомоги ФДБУ «ФНКЦ дитячої гематології, онкології та імунології імені Дмитра Рогачова» МОЗ Росії, м. Москва.

Михайлова Світлана Віталіївна, д-р мед. наук, завідувач відділення медичної генетики ФДБУ «Російська дитяча клінічна лікарня МОЗ Росії», м. Москва.

Бібліографічне посилання