Биотехнологични технологии: клетъчни култури. Клетъчни култури Видове клетъчни и тъканни култури

S. Ringer разработи физиологичен разтвор, съдържащ натриеви, калиеви, калциеви и магнезиеви хлориди, за да поддържа сърдечния ритъм на животните извън тялото. През 1885 г. Вилхелм Ру установява принципа на тъканната култура, като извлича част от костния мозък от пилешки ембрион и го държи в топъл физиологичен разтвор в продължение на няколко дни. Рос Гранвил Харисън, който е работил в Медицинския факултет на Джон Хопкинс и след това в Йейлския университет, публикува резултатите от своите експерименти през 1907–1910 г., създавайки методология за тъканна култура. През 1910 г. Пейтън Раут, работейки с клетъчна култура от пилешки сарком, предизвиква образуването на тумори при здрави животни. Това по-късно доведе до откриването на онкогенни вируси (Нобелова награда за физиология или медицина 1966 г.).

Техниките за клетъчни култури се развиха значително през 40-те и 50-те години на миналия век във връзка с изследванията в областта на вирусологията. Отглеждането на вируси в клетъчни култури направи възможно получаването на чист вирусен материал за производството на ваксини. Полиомиелитната ваксина е едно от първите лекарства, масово произвеждани с помощта на технология за клетъчни култури. През 1954 г. Ендерс, Уелър и Робинс получават Нобелова награда „за откриването на способността на полиомиелитния вирус да расте в тъканни култури“. През 1952 г. е получена добре познатата линия човешки ракови клетки HeLa.

Основни принципи на отглеждане

Клетъчна изолация

За култивиране извън тялото живите клетки могат да бъдат получени по няколко начина. Клетките могат да бъдат изолирани от кръвта, но само левкоцитите са способни да растат в култура. Мононуклеарните клетки могат да бъдат изолирани от меките тъкани с помощта на ензими като колагеназа, трипсин, проназа, които разрушават екстрацелуларния матрикс. Освен това парчета тъкан могат да се поставят в хранителната среда.

Култури от клетки, взети директно от обекта (ex vivo), се наричат ​​първични. Повечето първични клетки, с изключение на туморните клетки, имат ограничен живот. След определен брой деления тези клетки остаряват и спират да се делят, въпреки че може да не загубят жизнеспособност.

Има обезсмъртени („безсмъртни“) клетъчни линии, които могат да се възпроизвеждат безкрайно дълго. В повечето туморни клетки тази способност е резултат от произволна мутация, но в някои лабораторни клетъчни линии тя се придобива изкуствено, чрез активиране на гена за теломераза.

Клетъчна култура

Клетките се отглеждат в специална хранителна среда при постоянна температура, а клетките на бозайниците обикновено също изискват специална газова среда, поддържана в инкубатор за клетъчни култури. По правило се регулира концентрацията на въглероден диоксид и водни пари във въздуха, но понякога и на кислород. Хранителните среди за различните клетъчни култури се различават по състав, pH, концентрация на глюкоза, състав на растежни фактори и др. Растежните фактори, използвани в хранителната среда, най-често се добавят заедно с кръвния серум. Един от рисковите фактори в този случай е възможността за заразяване на клетъчната култура с приони или вируси. При култивирането една важна цел е да се елиминира или сведе до минимум употребата на замърсени съставки. На практика обаче това не винаги се постига. Най-добрият, но и най-скъп начин е да добавите пречистени растежни фактори вместо суроватка.

Култивирането на човешки клетки донякъде противоречи на правилата на биоетиката, тъй като клетките, отглеждани в изолация, могат да надживеят родителския организъм и след това да бъдат използвани за експерименти или за разработване на нови лечения и печалба от това. Първото решение в тази област дойде от Върховния съд на Калифорния по делото Джон Мур срещу Калифорнийския университет, което постановява, че пациентите нямат права на собственост върху клетъчни линии, получени от органи, отстранени с тяхно съгласие.

Хибридома

Използване на клетъчни култури

Масовата клетъчна култура е основата за индустриалното производство на вирусни ваксини и различни биотехнологични продукти.

Биотехнологични продукти

Индустриално продукти като ензими, синтетични хормони, моноклонални антитела, интерлевкини, лимфокини и противотуморни лекарства се получават от клетъчни култури. Въпреки че много прости протеини могат да бъдат произведени относително лесно с помощта на rDNA в бактериални култури, по-сложни протеини като гликопротеини в момента могат да бъдат произведени само от животински клетки. Един от тези важни протеини е хормонът еритропоетин. Разходите за отглеждане на клетъчни култури от бозайници са доста високи, така че в момента се провеждат изследвания за възможността за производство на сложни протеини в клетъчни култури от насекоми или висши растения.

Тъканна култура

Клетъчната култура е неразделна част от тъканната култура и технологията за тъканно инженерство, тъй като определя основата за отглеждане на клетки и поддържането им в жизнеспособно състояние ex vivo.

Ваксини

Понастоящем се произвеждат ваксини срещу полиомиелит, морбили, паротит, рубеола и варицела, като се използват техники за клетъчни култури. Поради заплахата от грипна пандемия, причинена от вирусния щам H5N1, правителството на Съединените щати в момента финансира изследвания за получаване на ваксина срещу птичи грип, използвайки клетъчни култури.

Клетъчни култури от небозайници

Растителни клетъчни култури

Растителните клетъчни култури обикновено се отглеждат или като суспензия в течна хранителна среда, или като калусна култура върху твърда хранителна основа. Култивирането на недиференцирани клетки и калус изисква поддържане на определен баланс на растителни растежни хормони, ауксини и цитокинини.

Бактериални, дрождеви култури

Основна статия: Бактериална култура

За култивиране на малък брой бактериални и дрождени клетки, клетките се посяват върху твърда хранителна среда на базата на желатин или агар-агар. За масово производство се използва култивиране в течни хранителни среди (бульони).

Вирусни култури

1966).

Техниките за клетъчни култури се развиха значително през 40-те и 50-те години на миналия век във връзка с изследванията в областта на вирусологията. Отглеждането на вируси в клетъчни култури направи възможно получаването на чист вирусен материал за производството на ваксини. Полиомиелитната ваксина е едно от първите лекарства, масово произвеждани с помощта на технология за клетъчни култури. През 1954 г. Ендерс, Уелър и Робинс получават Нобелова награда „за откриването на способността на полиомиелитния вирус да расте в тъканни култури“. През 1952 г. е получена добре познатата линия човешки ракови клетки HeLa.

Основни принципи на отглеждане[ | ]

Клетъчна изолация[ | ]

За култивиране извън тялото живите клетки могат да бъдат получени по няколко начина. Клетките могат да бъдат изолирани от кръвта, но само левкоцитите са способни да растат в култура. Мононуклеарните клетки могат да бъдат изолирани от меките тъкани с помощта на ензими като колагеназа, трипсин, проназа, които разрушават екстрацелуларния матрикс. Освен това в хранителната среда могат да се поставят парчета тъкан и материали.

Култури от клетки, взети директно от обекта (ex vivo), се наричат ​​първични. Повечето първични клетки, с изключение на туморните клетки, имат ограничен живот. След определен брой деления тези клетки остаряват и спират да се делят, въпреки че все още могат да останат жизнеспособни.

Има обезсмъртени („безсмъртни“) клетъчни линии, които могат да се възпроизвеждат безкрайно дълго. В повечето туморни клетки тази способност е резултат от произволна мутация, но в някои лабораторни клетъчни линии тя се придобива изкуствено, чрез активиране на гена за теломераза.

Клетъчна култура[ | ]

Клетките се отглеждат в специални хранителни среди при постоянна температура. Растителните клетъчни култури използват контролирано осветление, а клетките на бозайници обикновено също изискват специална газова среда, поддържана в инкубатор за клетъчни култури. По правило се регулира концентрацията на въглероден диоксид и водни пари във въздуха, но понякога и на кислород. Хранителните среди за различните клетъчни култури се различават по състав, концентрация на глюкоза, състав на растежни фактори и др. Растежните фактори, използвани в среди за клетъчни култури на бозайници, най-често се добавят заедно с кръвен серум. Един от рисковите фактори в този случай е възможността за заразяване на клетъчната култура с приони или вируси. При култивирането една важна цел е да се елиминира или сведе до минимум употребата на замърсени съставки. На практика обаче това не винаги се постига. Най-добрият, но и най-скъп начин е да добавите пречистени растежни фактори вместо суроватка.

Кръстосано замърсяване на клетъчни линии[ | ]

Когато работят с клетъчни култури, учените могат да срещнат проблеми с кръстосано замърсяване.

Характеристики на растежа на клетките[ | ]

При отглеждане на клетки, поради постоянно делене, може да има излишък от тях в културата и в резултат на това възникват следните проблеми:

За поддържане на нормалното функциониране на клетъчните култури, както и за предотвратяване на негативни явления, хранителната среда периодично се подменя, извършва се клетъчно напояване и трансфекция. За да се избегне замърсяване на културите с бактерии, дрожди или други клетъчни линии, всички манипулации обикновено се извършват асептично в стерилна кутия. За потискане на микрофлората към хранителната среда могат да се добавят антибиотици (пеницилин, стрептомицин) и противогъбични лекарства (амфотерицин В).

Култивирането на човешки клетки донякъде противоречи на правилата на биоетиката, тъй като клетките, отглеждани в изолация, могат да надживеят родителския организъм и след това да бъдат използвани за експерименти или за разработване на нови лечения и печалба от това. Първото решение в тази област дойде от Върховния съд на Калифорния по делото Джон Мур срещу Калифорнийския университет, което постановява, че пациентите нямат права на собственост върху клетъчни линии, получени от органи, отстранени с тяхно съгласие.

Хибридома [ | ]

Използване на клетъчни култури[ | ]

Масовата клетъчна култура е основата за индустриалното производство на вирусни ваксини и различни биотехнологични продукти.

Биотехнологични продукти[ | ]

Индустриално продукти като ензими, синтетични хормони, моноклонални антитела, интерлевкини, лимфокини и противотуморни лекарства се получават от клетъчни култури. Въпреки че много прости протеини могат да бъдат произведени относително лесно с помощта на бактериални култури, по-сложни протеини като гликопротеини в момента могат да бъдат произведени само от животински клетки. Един от тези важни протеини е хормонът еритропоетин. Разходите за отглеждане на клетъчни култури от бозайници са доста високи, така че в момента се провеждат изследвания за възможността за производство на сложни протеини в клетъчни култури от насекоми или висши растения.

Тъканна култура[ | ]

Клетъчната култура е неразделна част от тъканната култура и технологията за тъканно инженерство, тъй като определя основата за отглеждане на клетки и поддържането им в жизнеспособно състояние ex vivo.

Ваксини [ | ]

Понастоящем се произвеждат ваксини срещу полиомиелит, морбили, паротит, рубеола и варицела, като се използват техники за клетъчни култури. Поради заплахата от грипна пандемия, причинена от вирусния щам H5N1, правителството на Съединените щати в момента финансира изследвания за получаване на ваксина срещу птичи грип, използвайки клетъчни култури.

Клетъчни култури от небозайници[ | ]

Растителни клетъчни култури[ | ]

Растителните клетъчни култури обикновено се отглеждат или като суспензия в течна хранителна среда, или като калусна култура върху твърда хранителна основа. Култивирането на недиференцирани клетки и калус изисква поддържане на определен баланс на растителни растежни хормони, ауксини и цитокинини.

Бактериални, дрождеви култури[ | ]

Основна статия:

За култивиране на малък брой бактериални и дрождени клетки, клетките се посяват върху твърда хранителна среда на базата на желатин или агар-агар. За масово производство се използва култивиране в течни хранителни среди (бульони).

Вирусни култури[ | ]

Клетъчна култура

Клетъчна културае процес, чрез който in vitro единични клетки (или една клетка) от прокариоти и еукариоти се отглеждат изкуствено при контролирани условия. На практика терминът "клетъчна култура" се отнася предимно до култивиране на клетки, принадлежащи към една тъкан, произлизаща от многоклетъчни еукариоти, най-често животни. Историческото развитие на технологиите и методите за отглеждане на клетъчни култури е неразривно свързано с култивирането на тъканни култури и цели органи.

История

През 19 век английският физиолог С. Рингер създава физиологичен разтвор, съдържащ натриев, калиев, калциев и магнезиев хлорид, за да поддържа сърдечния ритъм на животните извън тялото. През 1885 г. Вилхелм Ру установява принципа на тъканната култура, като извлича част от костния мозък от пилешки ембрион и го държи в топъл физиологичен разтвор в продължение на няколко дни. Рос Гранвил Харисън, който е работил в Медицинския факултет на Джон Хопкинс и след това в Йейлския университет, публикува резултатите от своите експерименти през 1907–1910 г., създавайки методология за тъканна култура. Техниките за клетъчни култури се развиха значително през 40-те и 50-те години на миналия век във връзка с изследванията в областта на вирусологията. Отглеждането на вируси в клетъчни култури направи възможно получаването на чист вирусен материал за производството на ваксини. Полиомиелитната ваксина е едно от първите лекарства, масово произвеждани с помощта на технология за клетъчни култури.

Основни принципи на отглеждане

Клетъчна изолация

За култивиране извън тялото живите клетки могат да бъдат получени по няколко начина. Клетките могат да бъдат изолирани от кръвта, но само левкоцитите са способни да растат в култура. Мононуклеарните клетки могат да бъдат изолирани от меките тъкани с помощта на ензими като колагеназа, трипсин, проназа, които разрушават екстрацелуларния матрикс. Освен това парчета тъкан могат да се поставят в хранителната среда. Клетките, взети директно от обект, се наричат ​​първични. Повечето първични клетки, с изключение на туморните клетки, имат ограничен живот. След определен брой деления клетките преминават през процеса на стареене и спират да се делят, но не губят жизнеспособност. Има „безсмъртни“ клетъчни линии, които могат да се възпроизвеждат безкрайно. Тази способност е резултат от произволна мутация или е придобита изкуствено чрез потискане на гена на теломераза.

Отглеждане на клетки

Клетките се отглеждат в специални хранителни среди, при постоянна температура и в специална газова среда в инкубатор за клетъчни култури. Хранителните среди за различните клетъчни култури се различават по състав, pH, концентрация на глюкоза, състав на растежни фактори и др. Растежните фактори, използвани в хранителната среда, най-често се получават от кръв. Един от рисковите фактори в този случай е възможността за заразяване на клетъчната култура с приони или вируси. При култивирането една от важните задачи е премахването или минимизирането на употребата на замърсени съставки. На практика обаче това не винаги се постига. Клетките могат да се отглеждат в суспензия или в адхезивно състояние. Някои клетки (като кръвни клетки) естествено съществуват в суспендирано състояние. Има и клетъчни линии, които са били изкуствено модифицирани, за да се предотврати прикрепването им към повърхности, за да се увеличи клетъчната плътност в културата. Отглеждането на прилепнали клетки изисква повърхност, като тъканна култура или пластмаса, покрита с извънклетъчни матрични елементи за подобряване на адхезивните свойства и за насърчаване на растежа и диференциацията. Повечето клетки от меки и твърди тъкани са адхезивни. От адхезивния тип култура се отличава органотипният тип клетъчна култура, която представлява триизмерна среда, за разлика от обикновената лабораторна стъклария. Тази културална система е физически и биохимично най-подобна на живите тъкани, но има някои технически трудности при поддържането (например изисква дифузия).

Кръстосано замърсяване на клетъчни линии

Когато работят с клетъчни култури, учените могат да се сблъскат с проблема с кръстосаното замърсяване. Съдейки по резултатите от изследването, може да се предположи, че в 15-20% от случаите клетките, използвани в експериментите, са били развалени или са били замърсени с клетки от други клетъчни линии.

Характеристики на растежа на клетките

При отглеждане на клетки, поради постоянно делене, може да има излишък от тях в културата. В резултат на това могат да възникнат следните проблеми:

• Натрупване на екскреторни продукти, включително токсични, в хранителната среда.
• Натрупване на мъртви клетки в културата, които са престанали да функционират.
• Натрупването на голям брой клетки има отрицателен ефект върху клетъчния цикъл, растежът и деленето се забавят, клетките започват да стареят и умират (контактно инхибиране на растежа).
• По същата причина може да започне клетъчна диференциация.

За поддържане на нормалното функциониране на клетъчните култури, както и за предотвратяване на негативни явления, хранителната среда периодично се подменя, клетките се прехвърлят и трансфектират. За да се избегне замърсяване на културите с бактерии, дрожди или други клетъчни линии, всички манипулации обикновено се извършват асептично в стерилен шкаф. За потискане на микрофлората към хранителната среда могат да се добавят антибиотици (пеницилин, стрептомицин) и противогъбични лекарства (амфотерицин В).

Човешки клетъчни линии

Една от най-ранните човешки клетъчни култури, получена от Хенриета Лакс, починала от рак на маточната шийка. Ядрата на клетъчната култура са оцветени в синьо.

Култивирането на човешки клетки донякъде противоречи на правилата на биоетиката, тъй като клетките, отглеждани в изолация, могат да надживеят родителския организъм и след това да бъдат използвани за експерименти или за разработване на нови лечения и печалба от това. Първото решение в тази област дойде от Върховния съд на Калифорния по делото Джон Мур срещу Калифорнийския университет, което постановява, че пациентите нямат права на собственост върху клетъчни линии, получени от органи, отстранени с тяхно съгласие.

Клетъчна линия "Хибридома"

Биотехнологични продукти

Индустриално продукти като ензими, синтетични хормони, моноклонални антитела, интерлевкини, лимфокини и противотуморни лекарства се получават от клетъчни култури. Въпреки че много прости протеини могат да бъдат произведени относително лесно с помощта на rDNA в бактериални култури, по-сложни протеини като гликопротеини в момента могат да бъдат произведени само от животински клетки. Един от тези важни протеини е хормонът еритропоетин. Разходите за отглеждане на клетъчни култури от бозайници са доста високи, така че в момента се провеждат изследвания за възможността за производство на сложни протеини в клетъчни култури от насекоми или висши растения.

Тъканна култура

Клетъчната култура е неразделна част от тъканната култура и технологията за тъканно инженерство, тъй като определя основата за отглеждане на клетки и поддържането им в жизнеспособно състояние ex vivo.

Ваксини

Понастоящем се произвеждат ваксини срещу полиомиелит, морбили, паротит, рубеола и варицела, като се използват техники за клетъчни култури. Поради заплахата от грипна пандемия, Съединените щати финансират изследвания за получаване на ваксина срещу

1966).

Техниките за клетъчни култури се развиха значително през 40-те и 50-те години на миналия век във връзка с изследванията в областта на вирусологията. Отглеждането на вируси в клетъчни култури направи възможно получаването на чист вирусен материал за производството на ваксини. Полиомиелитната ваксина е едно от първите лекарства, масово произвеждани с помощта на технология за клетъчни култури. През 1954 г. Ендерс, Уелър и Робинс получават Нобелова награда „за откриването на способността на полиомиелитния вирус да расте в тъканни култури“. През 1952 г. е получена добре познатата линия човешки ракови клетки HeLa.

Основни принципи на отглеждане

Клетъчна изолация

За култивиране извън тялото живите клетки могат да бъдат получени по няколко начина. Клетките могат да бъдат изолирани от кръвта, но само левкоцитите са способни да растат в култура. Мононуклеарните клетки могат да бъдат изолирани от меките тъкани с помощта на ензими като колагеназа, трипсин, проназа, които разрушават екстрацелуларния матрикс. Освен това в хранителната среда могат да се поставят парчета тъкан и материали.

Култури от клетки, взети директно от обекта (ex vivo), се наричат ​​първични. Повечето първични клетки, с изключение на туморните клетки, имат ограничен живот. След определен брой деления тези клетки остаряват и спират да се делят, въпреки че все още могат да останат жизнеспособни.

Има обезсмъртени („безсмъртни“) клетъчни линии, които могат да се възпроизвеждат безкрайно дълго. В повечето туморни клетки тази способност е резултат от произволна мутация, но в някои лабораторни клетъчни линии тя се придобива изкуствено, чрез активиране на гена за теломераза.

Клетъчна култура

Клетките се отглеждат в специални хранителни среди при постоянна температура. Растителните клетъчни култури използват контролирано осветление, а клетките на бозайници обикновено също изискват специална газова среда, поддържана в инкубатор за клетъчни култури. По правило се регулира концентрацията на въглероден диоксид и водни пари във въздуха, но понякога и на кислород. Хранителните среди за различните клетъчни култури се различават по състав, концентрация на глюкоза, състав на растежни фактори и др. Растежните фактори, използвани в среди за клетъчни култури на бозайници, най-често се добавят заедно с кръвен серум. Един от рисковите фактори в този случай е възможността за заразяване на клетъчната култура с приони или вируси. При култивирането една от важните цели е да се елиминира или сведе до минимум употребата на замърсени съставки. На практика обаче това не винаги се постига. Най-добрият, но и най-скъп начин е да добавите пречистени растежни фактори вместо суроватка.

Кръстосано замърсяване на клетъчни линии

Когато работят с клетъчни култури, учените могат да срещнат проблеми с кръстосано замърсяване.

Характеристики на растежа на клетките

При отглеждане на клетки, поради постоянно делене, може да има излишък от тях в културата и в резултат на това възникват следните проблеми:

• Натрупване на екскреторни продукти, включително токсични, в хранителната среда.
• Натрупване на мъртви клетки в културата, които са престанали да функционират.
• Натрупването на голям брой клетки има отрицателен ефект върху клетъчния цикъл, растежът и деленето се забавят, клетките започват да стареят и умират (контактно инхибиране на растежа).
• По същата причина може да започне клетъчна диференциация.

За поддържане на нормалното функциониране на клетъчните култури, както и за предотвратяване на негативни явления, хранителната среда периодично се подменя, извършва се клетъчно пасиране и трансфекция. За да се избегне замърсяване на културите с бактерии, дрожди или други клетъчни линии, всички манипулации обикновено се извършват асептично в стерилна кутия. За потискане на микрофлората към хранителната среда могат да се добавят антибиотици (пеницилин, стрептомицин) и противогъбични лекарства (амфотерицин В).

Култивирането на човешки клетки донякъде противоречи на правилата на биоетиката, тъй като клетките, отглеждани в изолация, могат да надживеят родителския организъм и след това да бъдат използвани за експерименти или за разработване на нови лечения и печалба от това. Първото решение в тази област дойде от Върховния съд на Калифорния по делото Джон Мур срещу Калифорнийския университет, което постановява, че пациентите нямат права на собственост върху клетъчни линии, получени от органи, отстранени с тяхно съгласие.

Хибридома

Използване на клетъчни култури

Масовата клетъчна култура е основата за индустриалното производство на вирусни ваксини и различни биотехнологични продукти.

Биотехнологични продукти

Индустриално продукти като ензими, синтетични хормони, моноклонални антитела, интерлевкини, лимфокини и противотуморни лекарства се получават от клетъчни култури. Въпреки че много прости протеини могат да бъдат произведени относително лесно с помощта на rDNA в бактериални култури, по-сложни протеини като гликопротеини в момента могат да бъдат произведени само от животински клетки. Един от тези важни протеини е хормонът еритропоетин. Разходите за отглеждане на клетъчни култури от бозайници са доста високи, така че в момента се провеждат изследвания за възможността за производство на сложни протеини в клетъчни култури от насекоми или висши растения.

Тъканна култура

Клетъчната култура е неразделна част от тъканната култура и технологията за тъканно инженерство, тъй като определя основата за отглеждане на клетки и поддържането им в жизнеспособно състояние ex vivo.

Ваксини

Понастоящем се произвеждат ваксини срещу полиомиелит, морбили, паротит, рубеола и варицела, като се използват техники за клетъчни култури. Поради заплахата от грипна пандемия, причинена от вирусния щам H5N1, правителството на Съединените щати в момента финансира изследвания за получаване на ваксина срещу птичи грип, използвайки клетъчни култури.

Клетъчни култури от небозайници

Растителни клетъчни култури

Растителните клетъчни култури обикновено се отглеждат или като суспензия в течна хранителна среда, или като калусна култура върху твърда хранителна основа. Култивирането на недиференцирани клетки и калус изисква поддържане на определен баланс на растителни растежни хормони, ауксини и цитокинини.

Бактериални, дрождеви култури

Основна статия: Бактериална култура

За култивиране на малък брой бактериални и дрождени клетки, клетките се посяват върху твърда хранителна среда на базата на желатин или агар-агар. За масово производство се използва култивиране в течни хранителни среди (бульони).

Вирусни култури

Тема 10. Използване на клетъчни култури във вирусологията. Видове клетъчни култури

Контролни въпроси

Задача за следващия урок.

Обобщаване на урока.

Задачи

1. Подгответе пилешките ембриони за заразяване.

2. Инфектирайте пилешки ембриони с вируси на нюкасълска болест и варицела.

3. Отворете заразените пилешки ембриони и вземете CAO и алантоисна течност.

4. Поставете капка RGA с алантоична течност.

Самостоятелна работа на учениците:

а) подготовка на работни места и специално облекло за дисекция на пилешки ембриони, заразени в предишния урок;

б) отваряне на пилешки ембриони, заразени с вируса на нюкасълската болест, изсмукване на алантоисна и амниотична течност, поставяне на капково RGA;

в) дисекция на пилешки ембриони, заразени с вируса на едра шарка, екстракция на CAO, преброяване и изчертаване на петна;

г) подготовка за дезинфекция на инструменти, ембриони, съдове.

1. Какво знаете за методите за индикиране на вируси в пилешки ембриони?

2. Какви методи за получаване на вируссъдържащ материал от пилешки ембриони познавате?

3. Какви са хемаглутиниращите свойства на вирусите и техните приложения? Какъв е механизмът на хемаглутинацията?

Цел на урока:изучават различни видове култури и тяхната номенклатура. Да се ​​изследват материалните средства за производство на клетъчни култури.

Оборудване и материали:Ханкс решения. Ерла, хранителна среда 199, Игла, лакталбумин хидролизат, матраци, флакони, стъклария, готови клетъчни култури, мултимедийно оборудване, презентации MS Office Power Pointпо темата на урока.

Обяснение на учителя.Отглеждането на клетъчни култури за получаване на различни биологични продукти, провеждане на изследвания или диагностична работа е революционен момент на 20 век. Признаването на идеята, че тъканните клетки на висшите животни могат да бъдат изолирани от тялото и след това да се създадат условия за техния растеж и размножаване in vitro, датира от първото десетилетие на 20 век. След като стана известно, че такива процеси са реални, започна вторият етап от работата - отглеждане на клетки и възпроизвеждане на вируси в тях. Третият и четвъртият етап започват с появата на възможността за вмъкване на екзогенно получени гени в клетките и получаване на тяхната експресия и потвърждение за възможността за отглеждане на цяла популация от една клетка (хибрид, което бележи възможността за получаване на трансгенни системи и клониране В момента нито една вирусологична лаборатория не може да мине без клетъчна култура. Клетъчните култури имат следното предимствапред лабораторни животни и пилешки ембриони:

възможно е да се постигне инфекция на почти всички клетъчни култури, което прави възможно получаването на вируссъдържащ материал с най-висока концентрация на вирус с най-ниско съдържание на протеинов баласт;

тъй като е възможно да се получат клетъчни култури от всеки животински вид, видовете ограничения върху култивирането на вируси се премахват;

възможно е да се намеси в инфекциозния процес по всяко време, без да се нарушава целостта на живата система;

можете непрекъснато да наблюдавате развитието на инфекциозния процес;

възможно е получаването на готова вирусна суспензия под формата на културална течност;

културалната течност е напълно стерилна срещу гъбички и бактерии;

техниката на заразяване и получаване на вируссъдържащ материал е изключително проста;

относителна евтиност.

Клетъчните култури са най-модерната лабораторна система за култивиране на вируси. Във вирусологичната практика клетъчните култури най-често се използват за първично откриване на вируси и тяхното изолиране от патологичен материал, натрупване на вируса при производството на ваксини и диагностика, поддържане на вирусни щамове в лабораторията, титруване на вируси и като тест обект в реакцията на неутрализация.

За успешното изолиране на вируса трябва да се спазва следното: изисквания:

използваната клетъчна култура трябва да е чувствителна към предполагаемия вирус. Неговата чувствителност се повишава, ако клетките са получени от млади животни (за предпочитане ембриони);

10.1 Видове клетъчни култури.Клетъчната култура е клетките на многоклетъчен организъм, които живеят и се възпроизвеждат при изкуствени условия извън тялото (ин витро).

Техниката на клетъчните култури започва да се развива особено успешно след 40-те години на настоящия век. Това беше улеснено от следните обстоятелства: откриването на антибиотици, които предотвратяват бактериална инфекция на клетъчни култури, откритието от Huang (1943) и Enders (1949) на способността на вирусите да причиняват специфично разрушаване на клетките (цитопатичен ефект) - удобно метод за индикиране на вируси в клетъчни култури и накрая Dulbecco и Vogt (1952) предлагат метод за трипсинизация на тъкани и получаване на еднослойни клетъчни култури.

Във вирусологичната практика се използват следните клетъчни култури.

Първични трипсинизирани клетъчни култури– клетки, получени директно от органи или тъкани на тялото, растящи in vitro в един слой (фиг. 26). Клетъчна култура може да бъде получена от почти всеки орган или тъкан на човек или животно (възрастен или ембрион). Това обаче може да се направи по-добре от ембрионални органи, тъй като ембрионалните клетки имат по-висок потенциал за растеж. Най-често за тези цели се използват бъбреци, бели дробове, кожа, тимус и тестиси на ембриони или млади животни.

Фигура 26. Първична култура на овчи ембрионални белодробни клетки (според N.I. Trotsenko et al.)

За получаване на първични клетки от здраво животно не по-късно от 2-3 часа след клането се вземат съответните органи или тъкани, натрошават се на парчета (1-4 mm) и се третират с ензими: трипсин, панкреатин, колагеназа и други (обикновено трипсин). Ензимите разрушават междуклетъчните вещества и получените отделни клетки се суспендират в хранителна среда и се култивират върху вътрешната повърхност на епруветки или дюшеци в термостат при 37 °C.

Клетките се прикрепят към стъклото и започват да се делят. В развитието на клетъчните култури се разграничават няколко фази: адаптация, логаритмичен растеж, стационар и стареене (клетъчна смърт). Докато се размножават, клетките се разполагат върху повърхността на стъклото и когато то се покрие изцяло в един слой, те контактуват една с друга и спират да се делят (контактно инхибиране). Върху стъклото се образува слой с дебелина една клетка (затова тези клетъчни култури се наричат ​​еднослойни или еднослойни).

Обикновено монослоят се образува в рамките на 3-5 дни. Скоростта на образуването му зависи от вида на тъканта, възрастта на животното, качеството на хранителната среда, концентрацията на клетките в семената и други фактори.

Хранителната среда се променя, когато се замърси с клетъчни отпадъци. Монослоят остава жизнеспособен 7-21 дни (в зависимост от вида на клетките и състава на хранителната среда).

Интензивността на клетъчното възпроизвеждане и състоянието на монослоя се наблюдават визуално под микроскоп с ниско увеличение (x10 леща). За тази цел е по-добре да използвате обърнат микроскоп.

За култивиране на вируси се използват млади клетъчни култури (веднага след като се образува монослой).

Субкултури.Във вирусологичната практика често се използват субкултури, които се получават от първични клетки, отгледани в матраци, като се отстраняват от стъкло с разтвор на версен или трипсин, ресуспендират се в нова хранителна среда и се засяват повторно върху нови матраци или епруветки. След 2-3 дни се образува монослой.

На практика субкултура може да се получи от всички първични клетъчни култури. (Пилешките фибробласти се субкултивират по-лошо.) Субкултурите не са по-ниски по чувствителност към вируси от първичните клетъчни култури, освен това са по-икономични и е възможно да се открие клетъчно замърсяване с вируси. Субкултурите получават от 2–5 пасажа (трансплантации) и много рядко до 8–10. Последващите пасажи водят до промени в клетъчната морфология и тяхната смърт .

Ако клетъчните култури са преминали през повече от 10 пасажа, те вече са в етап на преход към непрекъснати клетъчни култури.

Непрекъснати клетъчни култури- Това са клетки, способни да се възпроизвеждат извън тялото неограничено време. В лабораториите се поддържат чрез субкултивиране от един съд в друг (при смяна на хранителната среда).

Непрекъснатите клетки се получават от първични клетъчни култури с повишена растежна активност чрез продължителни субкултури в определен режим на култивиране. Обикновено работата по получаване на нови клетъчни линии продължава няколко месеца. Смята се, че механизмът на произход на непрекъснатите клетъчни култури е резултат от генетична променливост на клетките или селекция на единични клетки, присъстващи в първичната първоначална култура.

Клетките на трансплантираните култури имат еднаква форма, хетерплоиден набор от хромозоми (в първичните клетки е диплоиден), стабилни при условия на растеж in vitro, някои от тях имат онкогенна активност. Последното свойство ограничава използването на непрекъснати клетъчни култури за култивиране на вируси при производството на ваксини.

Непрекъснати клетъчни култури могат да бъдат получени както от здрави животински тъкани, така и от туморни тъкани. Сред тях най-широко използваните клетъчни линии са: HeLa (от рак на шийката на матката при жена); Ner-2 (от човешки ларингеален карцином); KB (от рак на устата); VNK-21 (бъбрек на новороден хамстер); PPES (трансплантиран свински плоден бъбрек); PPT (трансплантиран телешки бъбрек); PPO (трансплантиран овчи бъбрек); TR (от трахеална лигавица на говеда); L (миши фибробласти); SOC (от сърцето на маймуната cynomolgus) и др.

Трансплантираните клетки имат предимства пред първичните: подготовката им е много по-проста, спестяват се трудови и материални ресурси; тези култури могат да бъдат предварително проверени за наличие на латентни вируси и микрофлора; клоналните линии осигуряват по-стандартни условия за размножаване на вируса, отколкото първичните линии, които представляват смесена популация от клетки. Повечето трансплантирани клетки имат по-широк спектър на чувствителност към вируси, отколкото съответните първични култури.

Трансплантираните клетки обаче имат и недостатъци: те са предразположени към злокачествено заболяване, тоест злокачествено израждане, независимо от произхода, и намаляването на чувствителността към вируси при тях настъпва по-бързо, отколкото при първичните клетки, така че е необходимо да се използват клонални линии на трансплантирани клетки.

Трансплантираните клетки се поддържат чрез периодично повторно засяване. Най-често се използва методът без центрофуга. За следващата субкултура се избира 2-3-дневна култура с добър монослой, хранителната среда се отцежда и клетъчният монослой се покрива с 0,02% разтвор на версен, загрят до 35-37 ° C. Диспергиращият ефект на версена се обяснява със свързването му на двувалентни катиони (Mg ++, Ca ++), които насърчават прикрепването на клетките към стъклото и осигуряват целостта на клетъчната култура. Под въздействието на версен клетките се закръглят и отделят от стъклото.

10-15 минути след закръгляване на килийките, версенът се отцежда, като се оставя малко количество от него (в дюшек от 1 л - 5-10 мл, в дюшек от 0,1 л - 2-3 мл) и се оставя за още 5-10 минути, като периодично клетките се промиват с версен, след което се добавя малко количество хранителна среда. След разклащане клетките се преброяват в камерата на Goryaev, първоначалната клетъчна суспензия се разрежда с хранителна среда за растеж до необходимата концентрация (80-200 хиляди в 1 ml) и се излива в епруветки или матраци с разбъркване, затворени с гумени запушалки и се култивира в термостат при 37 ° C в продължение на 3-4 дни, докато се образува непрекъснат монослой. Обикновено клетките в камерата на Goryaev не се броят, а се субкултивират в съотношение от 1:2 до 1:6, в зависимост от вида на клетките. Съставът на хранителната среда също зависи от вида на клетките, но по-често при култивиране на трансплантируеми клетки се използва среда Eagle 199 или смеси от тези среди с лакталбумин хидролизат.

Важно е да се отбележи, че когато се поддържат трансплантирани клетки чрез системно повторно посяване, поне един матрак се оставя в лабораторията без субкултура, в случай че последният пасаж е неподходящ.

Диплоидни клетъчни култури.Международният комитет по клетъчни култури даде следната дефиниция на диплоидните клетки: това е морфологично хомогенна популация от клетки, стабилизирана по време на култивиране in vitro, имаща ограничена продължителност на живота, характеризираща се с три фази на растеж, запазвайки кариотипа, характерен за оригиналната тъкан по време на пасажа , свободни от замърсители и не притежаващи туморогенна активност, когато са трансплантирани в хамстери.

Диплоидните клетъчни култури, както и непрекъснатите, се получават от първични клетъчни култури. Кариотипът на клетките е много лабилен и при конвенционалните методи на клетъчно култивиране се променя в първите дни. Следователно са необходими специални методи за обработка на тъкани, висококачествени хранителни среди и фетален серум за дългосрочно поддържане на клетки in vitro в диплоидно състояние. Този проблем е решен за първи път успешно от американски учени Hayflick и Moorhead (1961).

Диплоидните клетки се получават от различни тъкани на човешки ембриони (бели дробове, бъбреци, мускулно-кожна тъкан, сърце и др.) и животни (фетален бъбрек на говеда, свине, BHK-21 - бъбрек на хамстер и др.).

Диплоидните клетки, за разлика от трансплантируемите, имат ограничени възможности за преминаване. Максималният брой пасажи е 50±10, след което броят на делящите се клетки рязко намалява и те умират. Диплоидните клетки обаче могат да се използват дълго време, тъй като при всеки пасаж част от клетките могат да бъдат замразени (минус 196 °C) и, ако е необходимо, възстановени.

Диплоидните клетки имат предимства пред трансплантираните и първичните клетки: те могат да бъдат в жизнеспособно състояние в продължение на 10-12 дни, без да променят хранителната среда; при смяна на средата веднъж седмично, те остават жизнеспособни в продължение на 4 седмици; Особено подходящи са за продължително култивиране на вируси, запазват чувствителността на оригиналната тъкан към вируси.

Суспензионни клетъчни култури.През 1953 г. Owen et al. показа способността на клетките да се размножават в свободно суспендирано състояние. През следващите години този метод беше значително подобрен: създадено е модерно оборудване, което осигурява възпроизвеждането на клетки със строго определени параметри (температура, рН, скорост на смесване) и много линии от непрекъснати клетки са адаптирани за възпроизвеждане при тези условия (VNK-21 , Her-2, MDVC и др.). Отглеждането на вируси в суспензионни клетъчни култури разкрива големи възможности в индустриалното производство на ваксини и диагностика. Въпреки това, само трансплантируемите клетки са добре култивирани в суспензия.

Нов подход за култивиране на клетки в суспензия е използването на микроносители (Sephadex, силикагел, Cytolar и др.). Върху микроносителите култивираните клетки образуват монослой. По този начин този метод позволява методи на суспензионно култивиране за отглеждане на клетки в зависимост от прикрепването към твърд субстрат: първични, субкултури, диплоидни. Тези клетки се наричат ​​повърхностно зависими.

Методът на култивиране върху микроносители (фиг. 27) в момента е изключително популярен, тъй като отваря големи перспективи в клетъчната биотехнология, в производството на ваксини и други биологично активни вещества (интерферон, хормони и др.).

Фигура 27. Култивиране на клетки върху микроносители (схема)

10.2 Съхранение на клетъчни култури.Всеки от трите основни вида клетъчни култури - първични култури, диплоидни щамове и непрекъснати клетъчни линии, използвани във вирусологичните изследвания, често трябва да бъдат запазени, тъй като при продължително преминаване на клетки in vitro съществува опасност от бактериално замърсяване и неконтролирани (генетични) промени в самите клетки.

Най-простият метод за запазване на клетъчни култури е да се съхраняват при 4 °C до 1–6 седмици. Успешно е използвано съхранение на клетъчни щамове при условия на сух лед (минус 78 °C) и течен азот (минус 196 °C). За да направите това, клетките се отстраняват от матраците, суспендират се в концентрация 10 6 в 1 ml хранителна среда, съдържаща 10–40% серум и 10% пречистен стерилен глицерин като защитни вещества (DMSO - диметилсулфоксид се използва успешно вместо това от глицерин). След това клетъчната суспензия се излива в ампули, запечатва се и се държи 1–3 часа при 4 °C, след което клетките се замразяват в смес от етилов алкохол и сух лед. Скоростта на охлаждане не трябва да надвишава 1 °C на минута. Когато температурата падне до минус 25 °C, ампулите се поставят в сух лед за съхранение. Ако за съхранение се използва течен азот, тогава ампулите с клетки се охлаждат до минус 70 ° C и се поставят в течен азот. Съхраняването на клетки в течен азот в продължение на няколко години не променя тяхната пролиферативна активност или чувствителност към вируси.

Замразените клетки се възстановяват по следния начин: ампулата със замразени клетки бързо се потапя във водна баня за 1-2 минути с леко разклащане, след това клетките се изсипват в матрак, добавя се подходящото количество среда за растеж и се култивират в термостат при 37 °C. За да се отстрани глицеролът или DMSO, културалната среда се заменя на следващия ден след засяването.

При транспортиране на клетки матраците с израснал монослой се пълнят догоре със средата и се затварят с гумена запушалка. В лабораторията хранителната среда се отцежда и се използва при култивирането на тези клетки под формата на добавки към хранителната среда, използвана в тази лаборатория.

Клетъчните суспензии могат също да се транспортират при 4 °C. При благоприятни условия на транспортиране, с изключение на прегряване и замръзване на клетките, 80–90% от тях остават жизнеспособни до 7–8 дни.

Работата с клетъчна култура изисква абсолютна стерилност, внимателна подготовка на стъклария, подходящи разтвори, хранителни среди и висококачествена вода.

10.3 Замърсяване на клетъчни култури.Работата с клетъчни култури, използването им във вирусологични и други изследвания и в биотехнологиите изисква постоянен мониторинг за отсъствие на чужди агенти (замърсители). Замърсителите могат да бъдат вируси, бактерии, гъбички, микоплазми и клетки от други клетъчни култури. Микоплазмите са едни от най-честите замърсители, особено в непрекъснатите клетъчни линии. Навременното откриване на тях, други микроорганизми или вируси в клетъчната култура е важно условие за поддържане на високото качество на последните. Сертифицирането на стабилни клетъчни линии включва като необходим тест контрол за липса на микоплазмено замърсяване, което трябва да стане задължително за всички лаборатории, където работят с клетъчни култури.

Рязкото подкисляване на хранителната среда в колбите с култури и нейната опалесценция може да бъде следствие от замърсяване на клетъчни култури с микоплазми. За идентифициране на последните се използват следните методи: инокулация върху хранителни среди, тестови култури, цитологични, авторадиографски и електронномикроскопски.

В случай на заразяване клетъчните култури се унищожават и култивирането се възобновява от резервни разсади, съхранявани в течен азот. На обеззаразяване подлежат само редки и уникални култури.

Възможно е да се предотврати размножаването и да се потиснат бактериите, случайно попаднали в клетъчната култура, с помощта на антимикробни лекарства (антибиотици и др.), добавени към хранителната среда непосредствено преди употребата им. Тези лекарства трябва да се дозират строго и да се използват диференцирано. Тяхното използване е необходимо условие, когато рискът от замърсяване нараства в процеса на получаване на първични клетъчни култури при мащабно култивиране на суспензионни клетки, масово култивиране на непрекъснати клетки, както и във всички случаи на комбиниране на клетъчен материал.

При работа с клетъчни култури се използват много антимикробни (нетоксични) лекарства в оптимални дози, естеството на тяхното действие е дадено в таблица 5. Изборът на ефективно лекарство или комплекс от лекарства зависи от чувствителността на специфичните замърсители към тях .

Таблица 5.

Антимикробни лекарства за клетъчни култури (L. P. Dyakonov и др.)