Вирусологични методи на изследване— методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, методите за тяхното проникване в клетката и характеристиките на вирусното възпроизвеждане, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и протеините, които те кодират, с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусната инфекция.

Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект , образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .

При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при производството на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканните и клетъчните култури. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (обикновено бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в така наречените дюшеци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, добавя се вирусната суспензия в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя прясна хранителна среда, обикновено без серум.

Клетките на повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани; такава култура се нарича вторична култура. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. Чрез серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат еднослойни или суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, докато суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на смесващи устройства. Има повече от 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да бъдат култивирани в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промени в клетъчната морфология, цитопатични ефекти, които могат да бъдат специфични, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; установяване на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез идентифициране на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или натрупвания на нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и отнемащ време процес. Извършва се за определяне на вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на серовариант на грипния вирус, див или ваксинален щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вируса, получена от един вирион, се нарича вирусен клон, а процесът на получаването му се нарича клониране.

За изолиране на вируси се използва заразяване на възприемчиви лабораторни животни и пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (за хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

Пилешки ембриони се използват за изолиране на редица вируси, като например грипни вируси, а новородени мишки се използват за изолиране на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични реакции и други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на съдържащата вирус течност, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на клетки, унищожени от вируса в еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се откриват чрез оцветяване на културата с интравитални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират багрилото и следователно се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици на 1 мл.

Пречистването и концентрирането на вируси обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в концентрация или градиент на плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусни инфекции се основава на експресни методи, които позволяват да се получи отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните стадии след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация. , откриване на антитела от клас IgM и др.

Електронната микроскопия на отрицателно оцветените вируси позволява да се диференцират вирусите и да се определи тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е доста висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се разграничат вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този дефицит се преодолява чрез използването на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси чрез добавяне на специфичен серум към вирусните частици, като едновременно с това се концентрират вирусните частици, което позволява тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За експресна диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.

Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по чувствителност. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни ДНК или РНК вериги (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта за молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.

Антителата от клас IgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антителата от клас lgM се откриват чрез имунофлуоресценция или чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ, като се използват анти-m антисеруми (серуми срещу тежки вериги на lgM).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се усъвършенстват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика за определяне на увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема през първите дни след заболяването, вторият - след 2- 3 седмици). Диагностична стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас IgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас IgC продължават да съществуват няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза с полиакриламиден гел с последваща имуноиндикация на протеини чрез метода на ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и прави възможно идентифицирането на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на ХИВ инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимно-свързан имуносорбентен анализ са причинени от наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациента към вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването и при анализиране на популациите, променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът за HIV инфекция се използва като потвърждаващ тест за идентифициране на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

Вирусологичен методвключва два основни етапа: изолиране на вируси и тяхното идентифициране. Материали могат да бъдат кръв, други биологични и патологични течности, биопсии на органи и тъкани.

Често се извършват вирусологични кръвни тестове за диагностициране на арбовирусни инфекции. Вирусите на бяс, паротит и херпес симплекс могат да бъдат открити в слюнката. Назофарингеалните тампони се използват за изолиране на патогени на грип и други остри респираторни вирусни инфекции и морбили. Аденовирусите се откриват в тампони от конюнктивата. От изпражненията се изолират различни ентеро-, адено-, рео- и ротавируси.

За изолиране на вируси се използват клетъчни култури, пилешки ембриони и понякога лабораторни животни. Повечето патогенни вируси се отличават с наличието на тъканна и типова специфичност", например, полиовирусът се възпроизвежда само в клетки на примати, следователно, за да се изолира специфичен вирус, се използва подходяща тъканна култура. За да се изолира неизвестен патоген, препоръчително е да инфектират едновременно 3-4 клетъчни култури, като се предполага, че една от тях може да се окаже чувствителна.Наличието на вируса в заразените култури се определя от развитието на специфична клетъчна дегенерация, т.е цитопатогенно действие, откриване на вътреклетъчни включвания, както и въз основа на откриване на специфичен антиген чрез имунофлуоресценция, положителни реакции на хемадсорбция и хемаглутинация.Птичи ембриони с техните слабо диференцирани тъкани са подходящи за култивиране на много вируси.Най-често се използват пилешки ембриони.Когато се размножават в ембриони, вирусите могат да причинят тяхната смърт (арбовируси), появата на промени в хорион-алантоисната мембрана (вируси на едра шарка) или в тялото на ембриона, натрупване на хемаглутинини в ембрионалните течности (грипни вируси, паротит) и вирусен антиген, фиксиращ комплемента.

Вирусите се идентифицират с помощта на имунологични методи: реакция на инхибиране на хемаглутинацията, фиксиране на комплемента, неутрализация, утаяване в гел, имунофлуоресценция.

3.4 Биологичен метод

Биологичен методсе състои в заразяване на лабораторни животни с различни материали (клинични, лабораторни), за да се посочи патогенът, както и да се определят някои свойства на микроорганизмите, които характеризират тяхната патогенност (токсигенност, токсичност, вирулентност). Като лабораторни животни се използват бели мишки, бели плъхове, морски свинчета, зайци и др.

Възпроизвеждането на болестта при животно е абсолютно доказателство за патогенността на изолирания микроорганизъм (при бяс, тетанус и др.). Следователно, биологичният тест върху животни е ценен и надежден диагностичен метод, особено за тези инфекции, чиито патогени се съдържат в ниски концентрации в изследваната биологична среда на човешкото тяло и растат слабо или бавно върху изкуствена среда.

3.5 Имунологичен метод

Имунологичен метод(серологичен) включва изследвания на кръвен серум, както и други биологични субстрати за идентифициране на специфични антитела и антигени. Класическата серодиагностика се основава на определянето на антитела срещу идентифициран или предполагаем патоген. Положителният резултат от реакцията показва наличието на антитела срещу антигените на патогена в тествания кръвен серум, а отрицателният резултат показва липсата на такива. Откриването на антитела срещу причинителя на редица инфекциозни заболявания в изследвания кръвен серум не е достатъчно за поставяне на диагноза, тъй като може да отразява наличието на постинфекциозен или постваксинален имунитет, следователно „сдвоена“ кръв изследват се серуми, първият, взет в първите дни на заболяването, а вторият, взет с интервал от 7-10 дни. В този случай се оценява динамиката на повишаване на нивото на антителата.

Увеличаването на титъра на антителата в тествания кръвен серум най-малко 4 пъти спрямо първоначалното ниво е диагностично значимо. Това явление се нарича сероконверсия. При редки инфекциозни заболявания, както и вирусен хепатит, HIV инфекция и някои други, наличието на антитела показва, че пациентът е заразен и има диагностична стойност.

В допълнение към определянето на титъра на антитялото, по време на серологичните изследвания е възможно да се определи изотипът на антитялото. Известно е, че при първата среща на човешкото тяло с патоген в острия период на заболяването се открива по-бързо нарастване на антителата, принадлежащи към IgM, чието ниво, достигайки максимална стойност, след това намалява. В по-късните стадии на заболяването се увеличава броят на IgG антителата, които се запазват по-дълго и се определят по време на периода на реконвалесценция. При повторна среща с патогена, благодарение на имунологичната памет, реакциите на хуморалния имунитет се проявяват чрез по-бързо производство на IgG антитела и антитела от клас М се произвеждат в малки количества. Откриването на IgM антитела показва наличието на текущ инфекциозен процес, а наличието на IgG антитела показва минала инфекция или следваксинален имунитет.

Като се вземат предвид характеристиките на първичния и вторичния имунен отговор, анализът на съотношението на IgM и IgG антителата позволява в някои случаи да се разграничи етапът на инфекциозния процес (размах на заболяването, реконвалесценция, рецидив). Например, в случай на вирусен хепатит А (НА), надежден диагностичен метод е определянето на анти-HAV IgM антитела в кръвния серум. Откриването им показва текуща или скорошна HAV инфекция.

Серологичното изследване за откриване на антитела при инфекциозни заболявания е по-достъпен метод за лабораторна диагностика от изолирането на патогена. Понякога положителната серологична реакция служи като единствено доказателство за срещата и взаимодействието на организма с причинителя на съответното инфекциозно заболяване. В допълнение, редица заболявания с подобна клинична картина (например рикетсиоза, ентеровирусни инфекции) могат да бъдат диференцирани само серологично, което отразява значението на серологичните методи при диагностицирането на инфекциозни заболявания.

Курсова работа

"Методи на клиничната вирусология"

Въведение

Лабораторната диагностика на вирусните инфекции се извършва предимно с помощта на електронна микроскопия, чувствителни клетъчни култури и имунологични методи. По правило се избира един метод за диагностициране в зависимост от стадия на вирусната инфекция. Например, и трите подхода могат да бъдат полезни при диагностицирането на варицела, но успешното използване на техниките за микроскопия и клетъчни култури зависи от способността за събиране на задоволителни проби сравнително рано в заболяването.

До голяма степен успехът на вирусната диагностика зависи от качеството на получените проби. Поради тази причина персоналът на лабораторията трябва да участва пряко в събирането на необходимите проби. Характеристиките на пробите, както и методите за доставянето им в лабораторията, са описани от Lennett, Schmidt, Christ и др.

Повечето реактиви и инструменти, използвани в лабораторната диагностика, могат да бъдат закупени от различни компании. В повечето случаи един и същи реагент се произвежда едновременно от няколко компании. Поради тази причина не сме посочили отделни компании, освен ако реактивът не се доставя само от една компания. Във всички останали случаи трябва да се обърнете към общия списък на доставчиците, посочен в табл. 1.

Нямахме за цел да предоставим изчерпателно описание на всички налични в момента методи за диагностициране на човешки вирусни инфекции. На първо място, ние характеризираме основните методи. Когато натрупате опит в независима работа, тези основни техники могат да се използват за решаване на по-сложни проблеми.

1. Електронна микроскопия

За електронно микроскопска диагностика на вирусни инфекции могат да се използват тънки срезове от засегната тъкан. Най-често използваният материал за електронна микроскопия са изпражнения или течност.

Таблица 1. Списък на фирмите, доставящи реактиви и оборудване

везикули, които характеризират някои заболявания, като варицела. Когато се анализира такъв материал, вирусите могат да бъдат открити чрез отрицателно оцветяване, което води до електронно-плътен материал, очертаващ компонентите на вириона. Методът е ефективен, когато концентрацията на вируса е висока в тестовите проби, като например във фекалиите или везикулозната течност. В случаите, когато съдържанието на вирусни частици в пробите е ниско, вероятността за откриване на вируса може да се увеличи чрез концентриране на вируса чрез ултрацентрофугиране или чрез агрегирането му със специфични антитела. Последният метод също е удобен за идентифициране на вируси. Тук ще опишем електронномикроскопския метод за диагностициране на ротавирусна инфекция и метода на имуноелектронна микроскопия, използвайки примера за откриване на специфични антитела срещу парвовируси. Методите на електронната микроскопия са описани по-подробно от Field.

2.1 Директно електронно микроскопско изследване на изпражненията

1. Потопете върха на пастьоровата пипета в изпражненията и изтеглете достатъчно материал, за да получите натривка от 1 cm.

2. Ресуспендирайте фекалната натривка в електронномикроскопско отрицателно контрастно багрило, докато се получи полупрозрачна суспензия. Отрицателното контрастно багрило е 2% разтвор на фосфорноволфрамова киселина в дестилирана вода.

3. За да се получи електронен микроскопски образец, капка от суспензията се поставя върху решетка за електронен микроскоп, покрита с филм от въглерод-формвар. По време на тази операция мрежата се държи с чифт тънки пинсети.

4. Лекарството се оставя на въздух за 30 s.

5. Излишната течност се отстранява чрез докосване на ръба на стъклото с филтърна хартия.

6. Дрогата се изсушава на въздух.

7. Ако е необходимо, жизнеспособният вирус се инактивира чрез облъчване на двете страни на решетката с ултравиолетова светлина с интензитет 440 000 μW-s/cm2. В този случай се използва късовълнова ултравиолетова лампа с филтър. Лампата трябва да е на разстояние 15 см от решетката; Времето за облъчване за всяка страна е 5 минути.

8. Ротавирусните вириони могат да бъдат характеризирани под трансмисионен електронен микроскоп с увеличение от 30 000 до 50 000.

2.2 Имуноелектронна микроскопия

Методът на имуноелектронна микроскопия, описан по-долу, е само един от многото подобни имунологични методи. За изследване на вирус-специфични антитела освен това се използва метод, който включва свързване към микроскопичната мрежа на протеин А. Работната концентрация на антивирусните антитела се определя чрез проба и грешка в диапазона от 1/10 до 1/1000. Концентрацията, която посочваме, обикновено се използва в рутинна работа. За да се получат оптимални резултати за взаимодействието на антителата с вируса, серумът, съдържащ парвовирус, се титрува по същия начин.

1. 10 µl антисерум срещу човешки парвовирус се разреждат 100 пъти с PBS. Разтворът се загрява на водна баня до 56°С.

2. Разтопете 10 ml 2% агароза в PBS по обичайния начин и охладете до 56 °C на водна баня.

3. При 56 °C смесете 1 ml разреден антисерум с 1 ml 2% агароза.

4. Прехвърлете 200 µl от получената смес в две ямки на 96-ямкова микротитърна плака.

5. Агарозата се оставя да стегне при стайна температура. Таблетката може да се съхранява при 4°C в продължение на няколко седмици, ако е запечатана с тиксо.

6. Добавете 10 µl серум, съдържащ парвовирус, към ямка, съдържаща смес от агароза и антисерум.

7. Решетка за електронен микроскоп с предварително приготвено покритие от карбон-формвар се поставя върху по-малко блестящата страна върху капка серум.

8. Мрежата се държи 2 часа при 37 °C във влажна камера.

9. С помощта на тънка пинсета извадете мрежата и нанесете капка от 2% фосфорволфрамова киселина върху повърхността на мрежата, която е била в контакт със серума.

10. След 30 s излишната боя се отмива, препаратът се изсушава и вирусът се инактивира.

Агрегираните вирусни частици се изследват под трансмисионен електронен микроскоп при увеличение от 30 000 до 50 000.

3. Идентифициране на вирусни антигени

Вирусите, открити в тъкани или тъканни течности, могат да бъдат идентифицирани чрез специфични за вируса протеини, като се използва реакцията антиген-антитяло. Продуктът от реакцията антиген-антитяло се тества срещу етикет, който се въвежда директно в антивирусни антитела или в антитела, насочени срещу вирус-специфични антитела. Антителата могат да бъдат маркирани с флуоресцеин, радиоактивен йод или ензим, който разцепва субстрата, причинявайки промяна на цвета. В допълнение, реакцията на хемаглутинация се използва за идентифициране на вируса. В ежедневната практика описаните методи се използват главно за откриване на антигени на вируса на хепатит В в кръвта и търсене на антигени на различни вируси, причиняващи различни респираторни заболявания.

Понастоящем много компании произвеждат еритроцитна, радиоактивна и ензимна диагностика, включително за откриване на вируса на хепатит В. Не смятаме за препоръчително да очертаваме методи за работа с тази диагностика: достатъчно е да следвате приложените инструкции. По-долу ще се съсредоточим върху имунофлуоресцентния метод за идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет.

3.1 Идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет чрез имунофлуоресценция

Методът за получаване на препарати от назофарингеален секрет е описан от Gardner и McQuillin. В лабораторни условия тази операция се извършва на два етапа. Първо се приготвя намазка от назофарингеална слуз върху предметно стъкло. Получените петна могат да се съхраняват фиксирани при -20°C в продължение на много месеци. На втория етап намазките се оцветяват за откриване на антигена на респираторния синцитиален вирус. За тази цел се използва методът на индиректната имунофлуоресценция.

3.1.1 Приготвяне на препарати от назофарингеален секрет

1. Слузта от специални форцепс се отмива с 1-2 ml PBS и се прехвърля в центрофужна епруветка.

2. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.

3. Супернатантата се отцежда.

4. Клетъчната пелета се ресуспендира внимателно в 2-3 ml PBS, докато се получи хомогенна суспензия. За да направите това, използвайте пипета на Пастьор с широко гърло.

5. Получената суспензия се прехвърля в епруветка.

6. Добавете още 2-4 ml PBS към суспензията и разбъркайте чрез пипетиране. Отстраняват се големи съсиреци слуз.

7. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.

8. Супернатантата се изхвърля, утайката се ресуспендира в такъв обем PBS, че получената суспензия лесно се отделя от стените на епруветката.

9. Получената суспензия се нанася върху маркирано предметно стъкло.

10. Стъклото се суши на въздух.

Фиксирайте в ацетон за 10 минути при 4°C.

12. След фиксиране стъклото се изсушава отново на въздух.

13. Получените препарати се оцветяват веднага или се съхраняват при -20 °C.

3.1.2. Техника на оцветяване

1. Отпечатайте и разредете търговския RSV антисерум в PBS до препоръчителната работна концентрация.

2. С помощта на пипета на Пастьор нанесете една капка антисерум върху приготвения препарат.

3. Лекарството се поставя във влажна камера.

4. Лекарството се инкубира в продължение на 30 минути при 37 °C.

5. Пробите се промиват внимателно с PBS, за да се отстранят излишните антитела в специален резервоар.

6. Пробите се промиват на три смени с PBS, по 10 минути всяка.

7. Изсушете пробите, отстранете излишния PBS с филтърна хартия и изсушете на въздух.

Етиологичната диагностика на вирусните заболявания се извършва с помощта на вирусологични, вирусоскопски, серологични и молекулярно-генетични методи. Последните три метода могат да се използват като експресни диагностични методи.

Вирусологичен диагностичен метод.

Крайната цел на метода е да се идентифицират вирусите по вид или серологичен вариант.Вирусологичният метод включва няколко етапа:

1) подбор на материал за изследване;

2) обработка на вируссъдържащ материал;

3) замърсяване на чувствителни живи системи с материал;

4) индикация на вируси в живи системи;

5) титруване на изолирани вируси;

6) идентифициране на вируси в имунни реакции.

1. Избор на материал за изследване .

Извършва се в ранните стадии на заболяването, при спазване на правилата, които предотвратяват замърсяването на материала с чужда микрофлора и инфекцията на медицинския персонал. За да се предотврати инактивирането на вирусите по време на транспортирането, материалът се поставя във вирусна транспортна среда (VTS), състояща се от балансиран солев разтвор, антибиотици и серумен албумин. Материалът се транспортира в специален контейнер с термоизолация и затворени найлонови торби, съдържащи лед. При необходимост материалът се съхранява при -20˚C. Всяка проба от материал за изследване трябва да бъде маркирана и етикетирана, като посочва името на пациента, вида на материала, датата на вземане, подробна клинична диагноза и друга информация.

В зависимост от естеството на заболяването материалът за изследване може да бъде:

1) тампони от носната част на фаринкса и тампон от фаринкса;

2) цереброспинална течност;

3) изпражнения и ректални тампони;

6) течност от серозни кухини;

7) намазка от конюнктивата;

8) съдържание на везикули;

8) секционен материал.

За получаване на промивка от орофаринкса се използват 15-20 ml VTS. Пациентът внимателно прави гаргара на VTS за 1 минута и събира изплакването в стерилна бутилка.

Натривка се взема от задната част на гърлото със стерилен памучен тампон, като се натиска върху корена на езика с шпатула. Тампонът се поставя в 2-3 мл ВТС, изплаква се и се изстисква.

Цереброспиналната течност се получава чрез гръбначно-мозъчна пункция. 1-2 ml цереброспинална течност се поставя в стерилен контейнер и се доставя в лабораторията.

Пробите от изпражненията се събират в рамките на 2-3 дни в стерилни флакони. От получения материал се приготвя 10% суспензия, като се използва разтвор на Hanks. Суспензията се центрофугира при 3000 rpm, супернатантата се събира, към нея се добавят антибиотици и се поставят в стерилен контейнер.

Кръвта, получена чрез венепункция в обем 5-10 ml, се дефибринира чрез добавяне на хепарин. Цялата кръв не се замразява и не се добавят антибиотици. За да се получи серум, кръвните проби се държат в термостат при 37˚C за 60 минути.

Течност от серозни кухини се получава чрез пункция в количество от 1-2 ml. Течността се използва веднага или се съхранява замразена.

Натривка от конюнктивата се взема със стерилен тампон и се поставя във ВТС, след което събраният материал се центрофугира и замразява.

Съдържанието на везикулите се аспирира със спринцовка с тънка игла и се поставя във VTS. Материалът се изпраща в лабораторията под формата на изсушени петна върху предметни стъкла или в запечатани стерилни капиляри или ампули.

Секционният материал се избира възможно най-рано, като се спазват правилата за асептика. За вземане на всяка проба се използват отделни комплекти стерилни инструменти. Количеството на взетата тъкан е 1-3 g, която се поставя в стерилни флакони. Първо се вземат проби от екстракавитарни органи (мозък, лимфни възли и др.). Тъкан от гръдната кухина се събира преди отваряне на коремната кухина. Получените тъканни проби се смилат в хаван с добавяне на стерилен пясък и стерилен разтвор на натриев хлорид, след което материалът се центрофугира. Супернатантата се събира във флакони и се добавят антибиотици. Материалът за вирусологично изследване се използва веднага или се съхранява при -20˚C.

2. Обработка на вируссъдържащ материал.

Провежда се с цел освобождаване на материала от съпътстващата бактериална микрофлора. За тази цел се използват физични и химични методи.

Физически методи:

1) филтриране през различни бактериални филтри;

2) центрофугиране.

Химични методи:

1) третиране на материала с етер в случаи на изолиране на вируси, които нямат суперкапсид;

2) добавяне на смес от хептан и фреон към материала;

3) прилагане на антибиотици (пеницилин - 200-300 U/ml; стрептомицин - 200-500 mcg/ml; нистатин - 100-1000 U/ml).

3. Замърсяване на чувствителни живи системи чрез материал.

1) лабораторни животни;

2) пилешки ембриони;

3) органна култура;

4) тъканна култура.

Лабораторни животни. Използват се бели мишки, морски свинчета, хамстери, зайци и др.Белите мишки са най-чувствителни към голям брой видове вируси. Методът на заразяване на животните се определя от тропизма на вируса към тъканите. Инфекцията в мозъка се използва при изолиране на невротропни вируси (вируси на бяс, полиовируси и др.). Интраназалната инфекция се извършва при изолиране на патогени на респираторни инфекции. Широко използвани са интрамускулни, интравенозни, интраперитонеални, подкожни и други методи на инфекция. Болните животни се евтаназират с етер, отварят се и се взема материал от органи и тъкани.

Пилешки ембриони. Широко достъпен и лесен за използване. Използват се пилешки ембриони на възраст от 5 до 14 дни. Преди заразяването пилешките ембриони са овоскопични: определя се жизнеспособността им, границата на въздушната торбичка и местоположението на ембриона се маркират върху черупката („тъмното око“ на ембриона). Работата с пилешки ембриони се извършва в стерилна кутия със стерилни инструменти (пинсети, спринцовки, ножици, копие и др.). След завършване на част от работата, инструментите се потапят в 70% етилов алкохол и се изгарят преди следващата манипулация. Преди заразяване черупката на пилешкия ембрион се избърсва с тампон, напоен със спирт и алкохолен разтвор на йод. Обемът на тестовия материал, инжектиран в ембриона, е 0,1-0,2 ml. За изолиране на вируси от един материал се използват най-малко 4 пилешки ембриона.

урок № 2 7

ПРЕДМЕТ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НА ВИРУСИТЕ С ЧУВСТВИТЕЛНИ КЛЕТКИ. КУЛТИВИРАНЕ. МЕТОДИ НА ИНДИКАЦИЯи идентификация.АНТИВИРУСЕН ИМУНИТЕТ.

КОНТРОЛЕН СПИСЪК

1. Вируси, природа и произход. История на откритието. Етапи на развитие на вирусологията. Концепцията за вириона, неговата структура. Химичен състав и свойства на вирусите.

2. Принципи на класификация на вирусите - критерии. Семейства РНК и ДНК вируси (контрола).

3. Тропизъм на вирусите. Взаимодействие на вируси с чувствителни клетки - фази.

4. Култивиране на вируси. Индикация и идентификация на вируси при култивиране върху клетъчни култури и пилешки ембриони. Клетъчни култури, клетъчни линии, подготовка, условия на култивиране.

5. Класификация на вирусните инфекции: а) на клетъчно ниво; б) на ниво организъм.

6. Методи за лабораторна диагностика на вирусни инфекции. Директни методи за изследване на клиничен материал (откриване на вируси, вирусни антигени или вирусни НК). Вирусологичен диагностичен метод. Серодиагностика на вирусни инфекции.

7. Противовирусен имунитет – фактори. Устойчивост на видовете. Неспецифични антивирусни защитни фактори (инхибитори, интерферон, комплемент, фагоцитоза). Придобит имунитет (хуморални и клетъчни механизми).

8. Принципи на специфична профилактика и лечение на вирусни инфекции: ваксини, имунни серуми (имуноглобулини), интерферони, етиотропна химиотерапия.

ЛАБОРАТОРНА РАБОТА

ЛАБОРАТОРНА ДИАГНОСТИКА НА ВИРУСНИ ИНФЕКЦИИ

1. За експресна диагностика използвайте:

а) определяне на вирусен антигенв изследвания материал с помощта на диагностични антивирусни серуми в следните реакции: RIF, ELISA, RIA, противоимуноелектрофореза (CIEF), реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA), реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HAI) и др.;

V) откриване на вирионив патологичен материал с помощта на електронна микроскопия или IEM.

г) откриване на вирусни геномимолекулярно-генетични методи: PCR; молекулярна хибридизация на нуклеинови киселини с използване на белязани проби.

2. Вирусологичен метод

Основни етапи:

1. Събиране на тестовия материал.

2. Селекция на принципа на цитотропизма и получаване на чувствителна тест система, определяща нейната жизнеспособност.

3. Заразяване на избраната система.

4. Индикация на вируса въз основа на откриването на неговата нуклеинова киселина, антигени, хемаглутинин, CPD, включвания.

5. Идентифицирането и титруването на вируса се извършва въз основа на:

а) определяне на вирусни антигени с помощта на имунологични реакции (RIF, ELISA, RPGA, RSK, RN, VIEF и др.); б) патохистологично изследване на органи и тъкани; в) CPP; г) клинични симптоми, биологични тестове (кератоконюнктивални и др.).

Вирусологичен метод (схема)

Материал за изследване (изпражнения, назофарингеални тампони, срезов материал и др.)

Антибиотично лечение за потискане на бактериални и гъбични инфекции

микрофлора, центрофугиране, филтриране

Инфекция серия

Пилешки ембриони

Клетъчни култури

Животни

Индикация за вируси въз основа на следните явления

Забавяне в развитието

смърт, промяна

мембрани на ембриона, RGA

CPP, образуване на плака, RIF, RGads, интерференция

Болест, смърт,

хистологични промени

в тъкани, включвания

Титруване на изолирания вирус; избор на работна доза.

Титър на вируса- максимално разреждане на вируссъдържащия материал, при което все още се наблюдава очакваният ефект (CPE, RGA, смърт на животното).

Идентифициране на изолирания вирусв реакции на неутрализация, RTGads, RSC, потискане на образуването на плаки и др. с диагностични серуми. Тип (вид) вирусопределя се чрез неутрализиране на специфичния ефект на вируса от съответния имунен серум.

Забележка: Титруването и идентифицирането на вируса се извършват с помощта на един и същи феномен.

Култивиране на вируси