Netiesioginės arba pasyviosios hemagliutinacijos (RNHA arba RPHA) reakcija yra jautresnė ir specifiškesnė nei agliutinacijos reakcija. Ši reakcija taip pat naudojama dviem būdais.

1) Antikūnams paciento kraujo serume nustatyti naudojamos eritrocitų diagnostikos, kuriose antigenas adsorbuojamas taninu apdorotų eritrocitų paviršiuje. Kalbant apie šią reakciją, dažniau vartojamas terminas RPGA.

Tiriamasis serumas praskiedžiamas plastikinių plokštelių šulinėliuose ir pridedama eritrocitų diagnostinė medžiaga. Esant teigiamai reakcijai, ant šulinio sienelių atsiranda plona plėvelė „nėrinių skėčio“ pavidalu, o neigiamai – tankios eritrocitų nuosėdos „mygtuko“ pavidalu.

2) Toksinams ir bakterijų antigenams aptikti tiriamojoje medžiagoje naudojamos antikūnų eritrocitų diagnostikos, gaunamos adsorbuojant antikūnus ant eritrocitų. Kalbant apie šią reakciją, dažniau vartojamas terminas RNGA. Pavyzdžiui, antikūnų diagnostikos pagalba nustatomas maro bacilos antigenas, difterijos egzotoksinas, botulino egzotoksinas.

Kumbso reakcija (aptiglobulino testas)

Reakcija naudojama nepilniems antikūnams, pavyzdžiui, antikūnams prieš Rh faktorių, aptikti. Tiriamasis serumas pridedamas prie Rh + eritrocitų, kuriuose tikimasi nepilnų antikūnų prieš Rh faktorių. Prie eritrocitų prisijungę nepilni antikūnai nesukelia agliutinacijos, nes turi tik vieną aktyvų centrą. Tada įpilkite antiglobulino serumo, kuriame yra antikūnų prieš žmogaus globulinus. Kombinuotas su nepilnais antikūnais, antiglobulino serumas sukelia eritrocitų agliutinaciją.

kritulių reakcija

Reakcijos esmė – antigeno nusodinimas (nusodinimas), veikiant specifiniams antikūnams. Norint gauti matomą reakciją, būtinas elektrolito buvimas. Antigenas nusodinimo reakcijoje yra molekuliškai dispersinės medžiagos.

Žiedo kritulių reakcija dedamas į siaurus nusodinimo vamzdelius. Imuninis serumas pilamas į mėgintuvėlį, ant jo atsargiai sluoksniuojama tiriamoji medžiaga. Jame esant antigenui, dviejų skysčių ribose susidaro nepermatomas nuosėdų žiedas.

Reakcija naudojama teismo medicinoje, siekiant nustatyti baltymų rūšis kraujo dėmėse, spermoje ir kt.; nustatyti antigeną diagnozuojant juodligę (Ascoli reakcija), meningitą ir kitas infekcijas; sanitariniuose ir higieniniuose tyrimuose – nustatyti maisto produktų falsifikavimą. Imuniniai nusodinimo serumai gaunami imunizuojant gyvūnus atitinkamu antigenu. Pavyzdžiui, serumas, nusodinantis žmogaus baltymą, gaunamas imunizuojant triušį žmogaus baltymu. Nusodinančio serumo titras yra didžiausias antigeno, su kuriuo jis reaguoja, skiedimas. Serumas dažniausiai naudojamas neskiestas arba atskiestas santykiu 1:5.

Agaro gelio nusodinimo reakcija atliekami keliais būdais. Tai dviguba imunodifuzijos reakcija, radialinė imunodifuzijos reakcija, imunoelektroforezės reakcija.

Dviguba imunodifuzijos reakcija(pagal Ouchterlony). Ištirpęs agaro gelis supilamas į Petri lėkštelę ir, sustingus, joje išpjaunami šuliniai. Į vienus šulinėlius dedamas antigenas, į kitas dedamas imuninis serumas, kuris pasklinda į agarą ir susiliejimo vietoje sudaro baltų juostelių pavidalo nuosėdas.

Radialinė imunodifuzijos reakcija(pagal Mancini). Imuninis serumas dedamas į ištirpintą agaro gelį, supilamas į indą. Sustingus agarui, jame išpjaunami šulinėliai ir į juos dedami antigenai, kurie, pasklidę į agarą, aplink duobutes suformuoja žiedines kritulių zonas. Kuo didesnė antigeno koncentracija, tuo didesnis žiedo skersmuo. Reakcija naudojama, pavyzdžiui, norint nustatyti įvairias imunoglobulinų klases kraujyje. IgG, IgM, IgA klasių imunoglobulinai šioje reakcijoje veikia kaip antigenai, o antikūnai prieš juos yra specifiniuose monoreceptorių serumuose.

Imunoelektroforezė. Baltymų antigenų elektroforezė atliekama agaro gelyje. Nusodinantis serumas įvedamas į griovelį, kuris eina lygiagrečiai baltymų judėjimo krypčiai. Antigenai ir antikūnai difunduoja į agarą, o jų susitikimo vietoje susidaro kritulių linijos.

Imuninės lizės reakcijos

Antigenas (eritrocitai arba bakterijos), susijungęs su specifiniais antikūnais, sudaro imuninį kompleksą, prie kurio prisijungia komplementas (C1), o komplemento aktyvacija vyksta klasikiniu būdu. Aktyvuotas komplementas lizuoja raudonuosius kraujo kūnelius (hemolizė) arba bakterijas (bakteriolizė). Bakteriolizės reakcija naudojama Vibrio cholerae nustatyti.

hemolizės reakcija. Reakcijos antigenas yra eritrocitai, antikūnai (hemolizinai) yra hemoliziniame serume. Prie eritrocitų prisitvirtina hemolizinai, vyksta komplemento aktyvacija, kuri lizuoja eritrocitus. Drumsta eritrocitų suspensija virsta skaidriu ryškiai raudonu skysčiu - „lako krauju“. Kadangi hemolizės reakcija vyksta tik esant komplementui, ji naudojama kaip komplemento nustatymo indikatorius.

Vietinė hemolizės reakcija gelyje(Jerne reakcija) – hemolizės reakcijos variantas. Naudojamas antikūnus formuojančių ląstelių (AFC) skaičiui blužnyje ir limfmazgiuose nustatyti.

Išlydytas agaro gelis sumaišomas su blužnies ląstelių ir eritrocitų suspensija, o agarui sustingus, pridedamas komplementas. Aplink kiekvieną ląstelę, gaminančią hemolizinus, susidaro hemolizės zona. Tokių zonų skaičius lemia ląstelių, gaminančių hemolizinus, skaičių.

Netiesioginės hemagliutinacijos (RIHA) reakcija

Adsorbuotų diagnostinių preparatų naudojimas grindžiamas gamtoje nuolat diegiamais imunologinio paviršiaus struktūrų atpažinimo principu. Šiuo požiūriu nėra esminių skirtumų tarp, pavyzdžiui, mikrobinės ląstelės ar dirbtinio nešiklio, prikrauto antigenu (antikūnų), naudojimo. Sorbuotų preparatų pagrindu naudojami įvairūs nešikliai – mikrobinės ląstelės, eritrocitai, lateksas, bentoninas, cholesterolis, sefadeksas, dermatolis, aktyvuota anglis, grybelių sporos ir kt.

Po A.T.Kravčenkos (1945) darbo iš gyvybingumo atimti ir įvairiais cheminiais reagentais fiksuoti eritrocitai tapo plačiausiai naudojami kaip antigeno ar antikūnų nešiklis. Remiantis eritrocitų (tiek natūralių, tiek fiksuotų) naudojimo kaip antigeno nešiklio principu, netiesioginės (pasyviosios) hemagliutinacijos reakcija tapo plačiai paplitusi.

Siūlymas naudoti netiesioginę hemagliutinacijos reakciją (IHA) diagnostikos tikslais kilo remiantis anksčiau įgytomis žiniomis apie didelį eritrocitų sorbcijos aktyvumą. Lyginant su daugeliu kitų antigenų ir antikūnų nešėjų, eritrocitai turi tam tikrų pranašumų netiesioginės hemagliutinacijos reakcijoje. Pirma, izotoniniuose druskos tirpaluose jie sudaro gana stabilią sanglaudą ir per trumpą laiką nenusėda. Antra, tos pačios rūšies gyvūnų raudonieji kraujo kūneliai yra vienodo dydžio. Ir, galiausiai, eritrocitai gana lengvai tiesiogiai arba specialiai apdorojant prisiriša įvairius serologiškai aktyvius komponentus.

Eritrocitų diagnostikos sukūrimas iš stabilizuotų eritrocitų leidžia įveikti sunkumus, kylančius naudojant vietinius eritrocitus.

Tiriant eritrocitus, apdorotus įvairiais fiksatoriais, buvo nustatytos kai kurios bendros jų savybės:

Morfologijoje jie praktiškai nesiskiria nuo šviežių;

Nehemolizuojamas hipotoniniuose tirpaluose, vandenyje ir po užšaldymo-atšildymo;

Galima džiovinti šalčiu;

Jų paviršiaus struktūros išlaiko gebėjimą būti chemiškai modifikuojamos (pvz., taninas, diazo junginiai) ir reaguoja su antigenais ir antikūnais.

Pagrindinis fiksuotų eritrocitų kokybės kriterijus yra galimybė juos naudoti įjautrintiems preparatams gauti, nesant nespecifinės agliutinacijos stabilizuojančiuose skysčiuose.

Rengiant diagnostinius preparatus svarbus eritrocitų paviršiaus paruošimas, siekiant padidinti antigenų sorbcijos gebėjimą. Ypač plačiai paplitęs eritrocitų gydymas taninu.

Jo įtakoje kinta eritrocitų antigeninės savybės (pralaidumas, nusėdimo greitis), didėja jų atsparumas tam tikrų riebalų rūgščių hemoliziniam poveikiui. Tačiau pasiektas pagrindinis dalykas – tanizuoti eritrocitai turi daug didesnę baltymų sorbcijos gebą, kuri šiuo metu plačiai naudojama gaminant kokybiškus antigeninius ir antikūnų diagnostikos preparatus.

Kartu su eritrocitų tanizacija, eritrocitų diagnostikos ir antigeno nešiklio gamybai naudojami cheminiai reagentai, tokie kaip bromelainas, triopzinas, kalio perjodatas, kurie taip pat modifikuoja eritrocitų membranas.

Paruošus eritrocitų paviršių, vyksta pats svarbiausias procesas – hemosensibilizacijos procesas – baigiamasis eritrocitų diagnostinių medžiagų gamybos etapas.

Ryšiui tarp nešiklio ir antigeno sustiprinti naudojamos įvairios konjuguojančios medžiagos – bisdiazobenzidinas, difluorodinitrobenzinas, cianido chloridas, kadmio chloridas ir acto rūgštis, bromo chloridas, formaldehidas, glutaraldehidas, cianogeno bromidas, rivanolis, amidolis ir kt.

Konjuguojančių medžiagų naudojimas padeda pašalinti trūkumus, kuriuos turi tanizuoti eritrocitai, naudojami jautrinimui be konjuguojančių medžiagų.

Plačiausiai naudojamos konjuguojančios medžiagos yra chromo chloridas, glutaraldehidas, diazolo juodasis C ir amidolis. Įjautrinimo chromo chloridu procesas vyksta labai greitai – nuo ​​4 iki 10 minučių, kas patraukia tyrėjų dėmesį. Šiuo atveju naudojamos chromo chlorido koncentracijos nuo 0,05 iki 2 %, pH ne mažesnis kaip 5,0 esant 20-250 C reakcijos mišinio temperatūrai. Įjautrinimo chromo chloridu procese eritrocitų membranos baltymų karboksilo grupės yra aktyvuoti. Dėl to tarp eritrocitų membranos ir sensitino susidaro kovalentinis ryšys.

Netiesioginės hemagliutinacijos reakcija turi didelį specifiškumą, nes eritrocitų agliutinacija atsiranda dėl antigeno sąveikos su antikūnais, adsorbuotais ant eritrocitų. Jo išskirtinis bruožas – didelis jautrumas: joje aptinkama 0,02-0,05 μg antikūnų baltymo. Jautrumu jis gerokai lenkia imunodifuzijos, imunofluorescencijos, radialinės imunodifuzijos, komplemento fiksacijos ir neutralizacijos reakcijas. RNGA yra mažiau jautrus, nei radioimunoelektroforezės metodai, radioaktyviųjų antikūnų baltymų kiekio nustatymas imunosorbente, fermentinis imunologinis tyrimas.

RNGA privalumai yra pakankamai didelis atkuriamumas, paprastas įgyvendinimas ir minimalaus ingredientų kiekio poreikis, ypač naudojant mikrometodą.

Pastaraisiais metais RNHA buvo plačiai pritaikyta diagnozuojant infekcinį rinotracheitą, viduriavimą, adenovirusinę infekciją, rota- ir koronavirusinę infekciją, paragripo-3 ir kvėpavimo takų sincitinę infekciją.

Pateikiame eritrocitų diagnostikos, skirtos rota- ir koronavirusinių infekcijų antikūnams nustatyti, gamybos ir naudojimo pavyzdį.

Antikūnų diagnostikos, skirtos rota- ir koronaviruso antigenams RNGA nustatyti, paruošimo būdas yra toks: eritrocitų suspensijos gavimas; fiksuoja jų akroleinus; tanizacija, leidžianti gauti stabilų reikalingo baltymo sorbciją eritrocituose; tanizuotų eritrocitų jautrinimas imunoglobulinais; parengtos diagnostikos specifikos nustatymas. Eritrocitų suspensija ruošiama kliniškai sveiko avino kraują paėmus į kolbą su stiklo karoliukais. Po kraujo defibrinacijos eritrocitai turi būti plaunami 3-5 kartus izotoniniu (0,9%) natrio chlorido tirpalu, centrifuguojant 15-20 minučių 400g.

Siekiant stabilizuoti raudonuosius kraujo kūnelius, jie gydomi akroleinu. Kaip žinote, jo veikimas yra šiek tiek švelnesnis nei formaldehidas ir užtikrina stabilumą bei didesnį eritrocitų aktyvumą. Tam lygūs tūriai 10 % eritrocitų suspensijos sumaišomi su 0,2 % akroleino tirpalu, paruoštu fosfatiniame buferiniame tirpale (PBS), kurio pH yra 7,2. Gauta suspensija laikoma 30 min. 37°C temperatūroje, kruopščiai išmaišant, po to pakartotinai centrifuguojant 5 min. 600-800 g greičiu išleidžiamas akroleinas, kol visiškai išnyks specifinis kvapas. Taip paruoštų eritrocitų privalumas yra tas, kad jie nuimami ateičiai, gali būti ilgai saugomi nepatiriant hemolizės.

Vėliau stabilizuoti 10% koncentracijos eritrocitai du mėnesius laikomi 2–4 °C temperatūroje PBS, kurio pH yra 7,2.

Norint padidinti eritrocitų sorbcijos gebą ir nusėdimą, būtina juos tanizuoti, lygiomis dalimis sumaišant 10% išplautų eritrocitų suspensiją ir tanino tirpalą PBS ir pH 7,2, praskiedus 1:30 000. Mišinys kruopščiai sumaišomas ir palaikomas 370 C temperatūroje 15 min., po to eritrocitai du kartus kruopščiai nuplaunami iš tanino PBS, kurio pH 7,2, ir tris kartus izotoniniu natrio chlorido tirpalu, kurio pH 7,2-7,4.

Optimalus laikas garantuoti kokybiškų eritrocitų diagnostikos priemonių gavimą yra jų įjautrinimas per 24-48 valandas po apdorojimo taninu.

Diagnostikos procese kaip tirpiklis ir konservantas naudojamas 0,3 % fenolizuoto izotoninio natrio chlorido tirpalas su 0,1 % normalaus triušio arba arklio serumo, anksčiau inaktyvuotas 56°C temperatūroje 30 minučių ir adsorbuotas normalių avių eritrocitų. 37°C 30 min.

Tanizuotų eritrocitų jautrinimas turėtų būti atliekamas hiperimuniniu serumu, atitinkamai, prieš galvijų rota ir koronavirusus (pagamintas Ya.R. Kovalenko Visos Rusijos eksperimentinės veterinarijos tyrimų institute). Tuo pačiu metu antirotavirusinio imuninio serumo jautrinanti dozė (baltymų koncentracija) yra 280 μg/ml, o imuninio serumo koronavirusui – 260 μg/ml.

Sensibilizacija atliekama sumaišius vienodus tūrius tanizuotų eritrocitų ir imuninį serumą, pašildytą 30 minučių iki 560C optimalioje koncentracijoje. Be to, pridedama 3 dalys izotoninio natrio chlorido tirpalo, kurio pH yra 7,2, ir 5 dalys 0,1 % chromo chlorido tirpalo. Mišinys, retkarčiais pamaišant, palaikomas kambario temperatūroje 5 minutes. Praėjus nurodytam laikui, mišinys kruopščiai nuplaunamas naudojant PBS, kurio pH 7,2, o po to paruoštos eritrocitų diagnostinės medžiagos resuspenduojamos į konservantą iki 1 % koncentracijos. Paruošta diagnostinė medžiaga savo pagrindines savybes išlaiko 8 mėnesius, jei laikoma 4°C temperatūroje.

Visuose diagnostinių medžiagų gamybos etapuose stebima saviagliutinacija. Parengtų diagnostinių medžiagų specifiškumas nustatomas suskirstant RNGA, kur kaip antigenai buvo naudojami standartiniai RTI virusų, PG-3, adenovirusų, virusinio viduriavimo diagnostikos preparatai, taip pat rota- ir koronaviruso antigenai.

Nustatant RNHA, ruošiami tirtos viruso turinčios medžiagos serijiniai dvigubi skiedimai (20-50 % išmatų mėginių suspensija), o po to į kiekvieną duobutę įpilama vienodo tūrio eritrocitų diagnostikos. Lėkštelės turi būti kelis kartus kruopščiai sukratytos, paliktos kambario temperatūroje, kol eritrocitai visiškai nusistovės kontrolėje. Teigiamos reakcijos rodiklis yra eritrocitų diagnostikos agliutinacija, kai agliutinacijos intensyvumas yra 2+, kai titras yra 1:4 ir didesnis.

Netiesioginės arba pasyviosios hemagliutinacijos (IPHA) reakcija

Ši reakcija yra jautresnė už agliutinacijos reakciją ir naudojama diagnozuojant bakterijų, riketsijų, pirmuonių ir kitų mikroorganizmų sukeltas infekcijas.

RPGA leidžia aptikti nedidelę antikūnų koncentraciją.

Ši reakcija apima raugintus avies eritrocitus arba žmogaus eritrocitus su I grupės krauju, įjautrintus antigenais arba antikūnais.

Jei tiriamajame serume aptinkami antikūnai, naudojami antigenais įjautrinti eritrocitai (eritrocitų diagnostika).

Kai kuriais atvejais, jei reikia nustatyti įvairius antigenus tiriamojoje medžiagoje, naudojami eritrocitai, įjautrinti imunoglobulinais.

Į RPHA rezultatus atsižvelgiama atsižvelgiant į eritrocitų nuosėdų pobūdį.

Teigiamas laikomas reakcijos rezultatas, kai eritrocitai tolygiai padengia visą mėgintuvėlio dugną (apverstas skėtis).

Esant neigiamai reakcijai, eritrocitai mažo disko (mygtuko) pavidalu yra mėgintuvėlio dugno centre.

Agliutinacijos reakcija (RA)

Dėl savo specifiškumo, lengvo nustatymo ir demonstratyvumo agliutinacijos reakcija plačiai paplitusi mikrobiologinėje praktikoje diagnozuojant daugelį infekcinių ligų: vidurių šiltinės ir paratifos (Vidal reakcija), šiltinės (Weigl reakcija) ir kt.

Agliutinacijos reakcija pagrįsta antikūnų (agliutininų) sąveikos su ištisomis mikrobinėmis ar kitomis ląstelėmis (agliutinogenais) specifiškumu. Dėl šios sąveikos susidaro dalelės – aglomeratai, kurie nusėda (agliutinuoja).

Agliutinacijos reakcijoje gali dalyvauti tiek gyvos, tiek negyvos bakterijos, spirochetos, grybai, pirmuonys, riketsijos, taip pat eritrocitai ir kitos ląstelės.

Reakcija vyksta dviem fazėmis: pirmoji (nematoma) yra specifinė, antigeno ir antikūnų jungtis, antroji (matoma) yra nespecifinė, antigenų jungimasis, t.y. agliutinato susidarymas.

Agliutinatas susidaro, kai vienas aktyvus dvivalenčio antikūno centras sujungiamas su determinante antigeno grupe.

Agliutinacijos reakcija, kaip ir bet kuri serologinė reakcija, vyksta esant elektrolitams.

Išoriškai teigiamos agliutinacijos reakcijos pasireiškimas yra dvejopas. Mikrobuose, kuriuose yra tik somatinio O antigeno, mikrobų ląstelės pačios sulimpa tiesiogiai. Tokia agliutinacija vadinama smulkiagrūdžiu. Tai įvyksta per 18-22 valandas.

Žvyneliniai mikrobai turi du antigenus – somatinį O antigeną ir žvynelinį H antigeną. Jei ląstelės sulimpa su žvyneliais, susidaro dideli birūs dribsniai ir tokia agliutinacijos reakcija vadinama stambiagrūdžiais. Jis ateina per 2-4 valandas.

Agliutinacijos reakcija gali būti nustatyta tiek kokybiniam, tiek kiekybiniam specifinių antikūnų paciento kraujo serume nustatymui, ir išskirto patogeno rūšies nustatymui. hemagliutinacija mikrobiologinis infekcinis

Agliutinacijos reakcija gali būti nustatyta tiek detalioje versijoje, kuri leidžia dirbti su serumu, praskiestu iki diagnostinio titro, tiek orientacinės reakcijos nustatymo variante, leidžiančiame iš esmės aptikti specifinius antikūnus arba nustatyti antikūnų rūšį. patogenas.

Reakcija atliekama siekiant aptikti patogenų antigenus tiriamojoje medžiagoje, pridedant į ją imuninio serumo. Esant homologiniam antigenui, įvyksta antikūnų surišimas, todėl pridėjus antigenui jautrintų eritrocitų jų agliutinacija nevyksta, o tai vertinama kaip teigiamas rezultatas. Siekiant didesnio reakcijos jautrumo, į tiriamąją medžiagą pridedamas specifinis imuninis serumas minimaliu kiekiu (2 hemagliutinacijos vienetai). Imuninio serumo titras buvo nustatytas anksčiau naudojant RNGA. Vienam hemagliutinuojančiam vienetui paimkite ribojantį serumo praskiedimą, kuris sukelia eritrocitų agliutinaciją.

Metodika. Į polistireno plokštelių arba agliutinacijos mėgintuvėlių šulinėlius įpilama 0,025 ml 1% normalaus triušio serumo tirpalo ir daromi nuoseklūs 2-kartiniai tiriamosios medžiagos skiedimai. Tada į visus šulinėlius įpilama 0,025 ml imuninio serumo, plokštelė suplakama ir paliekama 30 minučių 37ºС temperatūroje arba 1 valandai kambario temperatūroje. Toliau į visus šulinėlius įpilama 0,025 ml antigeninio diagnostinio preparato, sukratoma ir paliekama 2 valandoms, po to atsižvelgiama į rezultatus.

Vykdant šią reakciją, prie RNGA kontrolės pridedama imuninio serumo specifiškumo kontrolė, susidedanti iš specifinio antigeno, imuninio serumo (2, 1, 0,5 hemagliutinuojančių vienetų) ir įjautrintų eritrocitų suspensijos.

RTNGA taip pat naudojamas aptikti specifinius antikūnus (visus ir blokuojančius), kuriems į tiriamąjį serumą pridedamas dozuotas antigeno kiekis. Jeigu jame yra antikūnų, vadinasi, juos suriša antigenas, todėl pridėjus eritrocitų, įjautrintų antikūnais (2-oji RTNHA stadija), eritrocitai nesulimpa.

Kadangi naudojamas minimalus antigeno kiekis (2 neutralizuojančios dozės), reakcija yra labai jautri. Neutralizuojančių dozių skaičius antigeniniame preparate nustatomas naudojant RNGA, o 1 % normalaus triušio serumo tirpale daromi serijiniai 2 kartus didesni antigeno skiedimai ir į šulinėlius įdedamas eritrocitų diagnostinis antikūnas. Neutralizuojanti antigeno dozė yra didžiausias jo praskiedimas, kuris suteikia visišką jautrintų eritrocitų sukibimą.

Prieš reakciją tiriamieji serumai praskiedžiami santykiu 1:5-1:10 ir 30 minučių inaktyvuojami 56°C temperatūroje. Hemagliutininų adsorbcijai į serumą įpilama 50 % formalizuotų arba ką tik nuplautų avių eritrocitų suspensijos 0,1 ml suspensijos 1 ml praskiesto serumo. Mišinys sukratomas ir inkubuojamas 30 minučių 37°C temperatūroje arba 1 valandą kambario temperatūroje, po to eritrocitai nusodinami centrifuguojant. Serumą galite palikti šaldytuve iki kitos dienos eritrocitų nusodinimui.

Eksperimento metu tiriamoji medžiaga skiedžiama 1 % normalaus triušio serumo tirpalu 0,025 ml tūrio mikrotitravimo skydelio šulinėliuose. Tada į kiekvieną šulinėlį įpilama 2 neutralizuojančios antigeno dozės, kurių tūris yra 0,025 ml. Lėkštelės suplakamos ir paliekamos 30 minučių 37°C arba 1 valandą kambario temperatūroje. Tada į visas duobutes įpilama 0,025 ml diagnostinio antikūno eritrocitų. Plokštelės suplakamos ir inkubuojamos 1,5-2 valandas kambario temperatūroje, po to atsižvelgiama į reakcijos rezultatus. Apskaitą galima atlikti ir kitą dieną. Tirto serumo titras laikomas didžiausiu jo praskiedimu, kuriame eritrocitai nesulimpa.

Patirtis lydi šių rūšių kontrolės:

1) įjautrintų eritrocitų stabilumas (eritrocitai + 1% normalaus triušio serumo tirpalas);

2) hemagliutininų išeikvojimas kiekviename tiriamajame serume (tiriamojo serumo mažiausiu skiedimu + formalinizuoti eritrocitai);

3) minimalios neutralizuojančios antigeno dozės nustatymo teisingumas (2, 1 ir 0,5 antigeno neutralizuojančios dozės + antikūnas eritrocitų diagnostika).

Atvirkštinė netiesioginė hemagliutinacija (rong) naudojama norint nurodyti bakterijų ir virusų antigenus tiriamojoje medžiagoje, taip pat greitajai daugelio infekcijų diagnostikai.

Priešingai nei RNHA, šioje reakcijoje eritrocitus jautrina ne antigenas, o antikūnai, kurių agliutinacija įvyksta pridedant antigeno.

Eritrocitai preliminariai fiksuojami formalinu arba glutaraldehidu, o vėliau sujungiami su gama globulinu, kuris išskiriamas iš imuninių serumų ir išgryninamas iš kitų serumo baltymų. Gama globulino prisijungimas prie eritrocitų paviršiaus vyksta chromo chlorido pagalba. Tam į 8 tūrius distiliuoto vandens įpilama 1 tūris imunoglobulinų, išskirtų iš imuninio serumo, 1 tūris 50 % formalizuotų eritrocitų suspensijos ir 1 tūris 0,1-0,2 % chromo chlorido tirpalo. Mišinys paliekamas 10-15 minučių kambario temperatūroje, tada eritrocitai apdorojami kaip pasyvioje hemagliutinacijos reakcijoje.

Antikūnų diagnostikos specifiškumas tikrinamas pasyviosios hemagliutinacijos slopinimo reakcijoje su homologiniu antigenu. Reakcija turi būti slopinama homologiniu antigenu mažiausiai 16 kartų, o ne slopinama heterologiniu. Naudokite spontaninės hemagliutinacijos nebuvimo kontrolę.

Šios reakcijos pagalba patogenai nurodomi medžiagoje, paimtoje iš mirusių žmonių ir gyvūnų organų, pavyzdžiui, iš smegenų, blužnies, plaučių kepenų. Paruoškite šių organų 10 % suspensiją izotoniniame natrio chlorido tirpale, centrifuguokite juos 30–60 minučių 10 000 aps./min. greičiu ir naudokite supernatantą kaip antigeną.

Metodika. Paruoškite 2 kartus didesnį tiriamosios medžiagos (antigeno) praskiedimą stabilizuojančiame tirpale. Įlašinkite po 1 lašą kiekvieno antigeno praskiedimo į 3 gretimus mikrogardelės šulinukus (reakcijai reikia 3 lygiagrečių šulinėlių eilių). Į kiekvieną pirmosios eilės šulinėlį įlašinamas 1 lašas stabilizuojančio tirpalo, į antrosios eilės šulinėlius įlašinamas 1 lašas homologinio imuninio serumo, praskiedimo santykiu 1:10, į šulinėlius įlašinamas 1 lašas heterologinio imuninio serumo. trečia eilė. Antroji ir trečioji eilutės yra reakcijos specifiškumo valdikliai. Mišinys paliekamas 20 minučių kambario temperatūroje.

Į visus šulinėlius įlašinkite 1 lašą 1 % jautrintų eritrocitų suspensijos (eritrocitų antikūnų diagnostikos) ir lėkšteles gerai suplakite. Į reakcijos rezultatus atsižvelgiama po 30-40 min. Esant specifiniam antigenui, pirmoje ir trečioje eilutėje (su heterologiniu serumu) pastebima hemagliutinacija, o antroje eilėje, kur antigenas anksčiau neutralizuotas homologiniu serumu, jo nėra.

Reakciją lydi įjautrintų eritrocitų kontrolė dėl spontaniškos agliutinacijos.

Atvirkštinė netiesioginė hemagliutinacijos slopinimo reakcija (RTONGA) leidžia nustatyti antikūnų buvimą žmonių ir gyvūnų serume.

Metodika. Serumai skiedžiami 10 kartų izotoniniu natrio chlorido tirpalu, kaitinami 20 minučių 65 °C temperatūroje, kad sunaikintų nespecifinius inhibitorius, tada paruošiami 2 kartus didesni serumo skiedimai stabilizuojančiame tirpale ir darbinėje antigeno dozėje. 4 agliutinavimo vienetai. Į mikropanelės šulinėles įlašinkite po 1 lašą kiekvieno serumo skiedinio ir įlašinkite į juos 1 lašą antigeno, kurio praskiedimas atitinka darbinę dozę. Mišinio komponentams 20 minučių kontaktuojant kambario temperatūroje, į visus šulinėlius įlašinamas 1 lašas diagnostinių eritrocitų antikūnų ir gerai suplakamas. Po 1,5-2 valandų inkubacijos kambario temperatūroje į reakcijos rezultatus atsižvelgiama atliekant hemagliutinaciją. Serumo titras yra didžiausias jo praskiedimas, kuris visiškai slopina hemagliutinacijos reakciją keturiais antigeną agliutinuojančiais vienetais.

Reakciją lydi įjautrintų eritrocitų kontrolė dėl spontaninės agliutinacijos, kai yra: a) stabilizuojantis tirpalas; b) normalus antigenas (iš medžiagos, kurioje nėra viruso); c) tiriamasis serumas. Reakcijos pranašumas yra jos universalumas ir galimybė ją panaudoti įvairiems antigenams aptikti.

Hemagliutinacijos rezultatų įvertinimas. Į RNGA, RONGA ir RTONGA rezultatus atsižvelgiama pagal eritrocitų agliutinacijos laipsnį: (++++) - visiška agliutinacija; (+++) - mažiau visiška agliutinacija; (++) - dalinė agliutinacija; (+) - agliutinacijos pėdsakai; (–) – agliutinacijos nebuvimas.

Reakcija laikoma teigiama, jei agliutinacija yra baigta (++++) arba beveik baigta (+++), diagnostika savaime neagliutinuojasi esant kiekvienam reakcijos komponentui, o antigeno arba antikūno specifiškumo kontrolė yra teigiama. .

Šie reakcijos paskambino netiesioginis (pasyvus), nes jie naudoja Ag (arba AT), dirbtinai sorbuotą ant įvairių korpuskulinių dalelių paviršiaus.

Netiesioginės arba pasyviosios hemagliutinacijos reakcija (RNGA, RPGA) yra viena jautriausių serologinių reakcijų. Jis pagrįstas AT gebėjimu sąveikauti su Ag, fiksuotu ant įvairių eritrocitų, kurie tuo pat metu agliutinuojasi. Siekiant didesnio diagnostikos stabilumo, eritrocitai formalizuojami.

Atvirkštinis RNGA naudojamas antigenui nustatyti kraujo serume; tam ant eritrocitų fiksuojasi ne Ag, o AT. Šio tipo reakcijos plačiai naudojamos diagnozuojant infekcines ligas, nustatant nėštumą, nustatant padidėjusį jautrumą vaistams ir kt.

Pasyvi hemagliutinacijos slopinimo reakcija (RTPGA) - tolimesnis vystymas RNGA; tam tikra prasme kontroliuoja savo specifiškumą. Skirtingai nei RNGA, susideda iš trijų komponentų; Ag, AT ir Ag (AT) adsorbuoti ant eritrocitų. Iš pradžių Ag reaguoja su AT (standartinis antiserumas), tada į mišinį pridedami eritrocitai, įjautrinti tuo pačiu Ag (arba AT). Jei Ag sąveikos metu su AT sistemoje nelieka laisvojo AT (arba Ag), tai eritrocitų diagnostikos agliutinacija nepastebima.