Imunoblotting –(do inglês “blot” - spot) - um método para identificar antígenos (ou anticorpos) usando soros (ou antígenos) conhecidos. É uma combinação de eletroforese em gel e ELISA. Inicialmente, as células bacterianas ou vírions são destruídas por ultrassom e, em seguida, todos os antígenos do vírus ou das células bacterianas são separados por eletroforese e um reagente comercial é obtido sobre um filme especial de nitrocelulose. Ao realizar o imunoblotting, o soro do paciente em estudo é aplicado sobre um filme com antígenos conhecidos. Após incubação e lavagem dos anticorpos não ligados, procede-se ao ELISA - anti-soro para imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima e um substrato cromogênico que muda de cor ao interagir com a enzima são aplicados no filme. Na presença de complexos antígeno-anticorpo-anti-soro para complexos imunoglobulina-enzima, aparecem manchas coloridas no transportador. O método de imunotransferência permite detectar separadamente anticorpos para vários antígenos de patógenos (por exemplo, na infecção pelo HIV, o imunotransferência detecta anticorpos para gp120, gp24 e outros antígenos virais).

Radioimunoensaio (RIA)

O método é baseado em uma reação antígeno-anticorpo usando um antígeno ou anticorpo marcado com radionuclídeo. 125I, 14C, 3H, 51Cr e outros radionuclídeos são usados ​​como marcadores. Os complexos imunes resultantes são isolados do sistema e sua radioatividade é determinada em contadores (radiação β). A intensidade da radiação é diretamente proporcional ao número de moléculas de antígeno e anticorpo ligadas.

A versão em fase sólida do RIA usando anticorpos marcados ou antígenos sorvidos nos poços dos painéis de poliestireno é bastante difundida.

O RIA é usado para detectar antígenos de micróbios, vírus, vários hormônios, enzimas, medicamentos, imunoglobulinas, bem como outras substâncias contidas no material de teste em concentrações menores de 10-12–10-15 g/l.

Perguntas de controle

Reação de bacteriólise imunológica: que tipo de reação é; o que é antígeno, o que é anticorpo, mecanismo de reação, métodos de produção, aplicação prática. Reação de hemólise imunológica: ingredientes necessários, procedimento; controles, aplicação prática. Reação de hemólise local em gel (reação de Jerne): princípio da reação, método de formulação, aplicação prática. Reação de fixação do complemento: princípio da reação; o que é formado quando o soro imune interage com um antígeno específico; o que acontece com o complemento se ele estiver presente durante essa interação? Qual será o destino do complemento se não houver afinidade específica entre o antígeno e os anticorpos? Qual reação pode ser usada para determinar o que aconteceu com o complemento; por que esta reação específica é usada; Qual é o resultado positivo visível do RSC? Por que? Qual propriedade do complemento é usada na primeira fase do RSC? Na segunda fase? Se o resultado final do RSC for hemólise, isso significa um resultado positivo ou negativo? Explique os resultados: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Cite os ingredientes do primeiro sistema RSK e os ingredientes do segundo sistema RSK. Por que o soro de teste precisa ser inativado? Como o complemento é titulado? Soro hemolítico: o que contém, como é obtido, qual o título e como é determinado? Quais animais são usados ​​para obter componentes RSC? Metodologia para montagem de RSC no frio. No estadiamento, qual das seguintes reações requer a participação do complemento: precipitação, floculação, aglutinação, detecção de anticorpos incompletos, bacteriólise imunológica, hemólise imunológica, Jerne, RSC? Reação de imunofluorescência (RIF) – indica a sequência de eventos da reação direta de Koons; ingredientes necessários. O que é um antígeno, o que é um anticorpo, com que são marcados os anticorpos, como é levado em consideração o resultado da reação, como é um resultado positivo? Aplicação prática - o que pode ser determinado com esta reação? Reação de imunofluorescência indireta - indicar a sequência de eventos durante essa reação, os ingredientes necessários, qual é o antígeno, quais soros imunes são utilizados; uso pratico; vantagem do RIF indireto em comparação com a reação direta. Ensaio imunoenzimático (ELISA) – princípio de reação; ingredientes necessários; indicar a sequência de eventos ao realizar uma reação para detectar um antígeno no material que está sendo testado; ingredientes necessários; O que acontece quando o resultado é positivo, como fica? Indique a sequência de ações na realização do ELISA para detecção de anticorpos no soro teste; ingredientes necessários; o que acontece se o resultado for positivo? Immunoblotting – princípio de reação; principais etapas; ingredientes necessários; como o resultado é levado em consideração; benefícios da reação. Radioimunoensaio (RIA) – quais as principais etapas da reação; Com o que são marcados os anticorpos ou antígenos, como o resultado é levado em consideração? Microscopia imunoeletrônica - princípio do método; principais etapas; ingredientes necessários; com o que os anticorpos são marcados? como o resultado da reação é levado em consideração. Reações de imobilização – princípio do método, técnica de fixação, componentes, registro de resultados.

Tarefas a serem concluídas durante o processo de auto-estudo.

Preencha a tabela “Reações imunológicas” em relação às reações discutidas neste tópico.

Reações imunológicas

Trabalho do aluno durante uma aula prática

Comece imediatamente o trabalho com a configuração da fase 1 do RSK, mas anote em seu caderno mais tarde (veja abaixo).

1. Reação de hemólise imunológica. Veja uma reação de demonstração da hemólise imunológica, esboce-a na forma de um diagrama, explique o resultado nos tubos experimentais e de controle.

2. Reação de fixação do complemento

a) analisar o RSK conforme tabela;

b) desenhar em um caderno um diagrama da configuração do RSC em forma de tabela;

c) colocar a segunda fase do RSK (a primeira fase é colocada no início da aula);

d) analisar os preparativos diagnósticos necessários ao CRE;

d) levar em consideração o resultado. Formule uma conclusão sobre a presença de anticorpos específicos no soro testado.

3. Reação de imunofluorescência. Estude a tabela, faça um diagrama da reação em seu caderno; observe os soros diagnósticos; determinar o que o soro contém, como é preparado, para qual reação (RIF direta ou indireta) é utilizado. Veja o resultado de demonstração do RIF em um microscópio de fluorescência.

4. Ensaio imunoenzimático (ELISA). Em seu caderno, trace um esquema para configurar uma reação em duas versões: para detectar um antígeno no material em estudo e para detectar anticorpos no soro. Revise o Kit de Ingredientes para HIV e Hepatite B. Identifique o que cada ingrediente contém e para que é usado.

5. Imunoblotting. Faça um diagrama da reação em seu caderno; assista à demonstração - o resultado da reação.

6. Radioimunoensaio (RIA). Faça um diagrama da reação em seu caderno.

7. Microscopia eletrônica imunológica (MEI). Assista à demonstração - o resultado da reação, faça um diagrama da reação em seu caderno, indique com setas o antígeno (vírus) e os anticorpos marcados.

Immunoblotting é um método altamente sensível para detecção de proteínas, baseado em uma combinação de eletroforese e ELISA ou RIA. O imunoblotting é usado como método de diagnóstico para infecção por HIV, etc.

De um modo geral, imunotransferência refere-se à análise de uma mistura de proteínas transferidas para um suporte de membrana sólida, ao qual estão ligadas por ligações covalentes, seguida de imunodetecção.

É possível analisar uma mistura de proteínas aplicadas diretamente ao substrato - análise dot blot - ou após seu fracionamento preliminar por eletrofocagem, eletroforese em disco ou eletroforese bidimensional - análise Western blot.

Os antígenos patogênicos são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, depois transferidos do gel para papel ativado ou membrana de nitrocelulose e revelados por ELISA.

As empresas produzem essas tiras com “manchas” de antígenos. O soro do paciente é aplicado nessas tiras. . Então, após a incubação, o paciente é lavado de anticorpos não ligados e é aplicado soro contra imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima . O complexo formado na tira (antígeno + anticorpo do paciente + anticorpo contra Ig humana) é detectado pela adição de um substrato cromogênico que muda de cor sob a ação de uma enzima.

Esta metodologia também é usada para selecionar clones de bactérias, fagos ou vírus que expressam os produtos genéticos clonados alvo.

A transferência de proteínas para a membrana é realizada passivamente ou por meio de equipamento de eletrotransferência. A eficiência da transferência de proteínas para a membrana é influenciada por muitos fatores, como o peso molecular das proteínas, a porosidade do gel, o tempo de transferência e a composição da solução tampão (trans-tampão) utilizada.

Dependendo dos objetivos e condições do experimento, são selecionadas as condições de transferência que proporcionam os melhores resultados. Nitrocelulose, difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou membranas de náilon carregadas positivamente são comumente usadas como substratos. A nitrocelulose pode ligar até 80-100 μg de proteína por 1 cm2.

Proteínas de baixo peso molecular (com peso molecular inferior a 20 kDa) podem ser perdidas nas lavagens, o que permite estudar preliminarmente o polimorfismo de certos loci genéticos com base nos comprimentos dos fragmentos de restrição de DNA correspondentes.

Além disso, por meio da hibridização Southern, é possível descobrir facilmente se o gene alvo possui um sítio de hidrólise por uma determinada enzima de restrição em sua parte interna, o que permite escolher a estratégia ideal para clonar a região do genoma estudada.

Usando um esquema semelhante, as moléculas de RNA podem ser transferidas de um gel de agarose para um filtro de nitrocelulose. Este método foi chamado de Northern blotting, em oposição a Southern blotting, porque o nome Southern significa "sul" em inglês.

A transferência de proteínas do gel para filtros foi chamada de Western blotting. Proteínas grandes (>100 kDa) desnaturadas em solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) podem ser mal transferidas para a membrana se o etanol estiver presente no tampão trans. O álcool melhora significativamente a transferência de proteínas do gel de SDS-poliacrilamida, mas estreita os poros do gel, o que leva à retenção de proteínas grandes.

A membrana PVDF é otimizada para imunodetecção e é capaz de reter até 160 μg/cm2 de proteínas especificamente ligadas com níveis muito baixos de ligação inespecífica.

Imunoblotting

Uma propriedade importante desta membrana é a possibilidade de seu uso repetido. As membranas de náilon Zeta-Probe ligam-se efetivamente às proteínas SDS na ausência de álcool, e essa ligação é resistente a tratamentos subsequentes. Proteínas de baixo peso molecular também são retidas de forma eficaz. Com uma alta capacidade de ligação de aproximadamente 480 μg de proteína por cm2, as membranas Zeta-Probe permitem a detecção de vestígios de proteína em misturas de teste.

Uma vez imobilizado o antígeno na membrana, os sítios de ligação restantes são bloqueados com soluções de gelatina, albumina sérica bovina ou leite desnatado.

Em seguida, a membrana é incubada em uma solução de anticorpos policlonais ou monoclonais para o antígeno em estudo. Após a lavagem dos anticorpos não ligados, a membrana é incubada em uma solução de anticorpos secundários, que são um conjugado das enzimas fosfatase alcalina (AP) ou peroxidase de rábano (HRP) com anticorpos antiespécies (anticorpos de cabra para imunoglobulinas de coelho, camundongo ou humanas). ) ou proteínas A (proteína de Staphylococcus aureus) ou G (proteína de Streptococcus sp.), possuindo alta afinidade pela região Fc das imunoglobulinas.

A detecção de complexos imunes formados é realizada quimicamente ou quimioluminescentemente. Os substratos para a reação química ao usar conjugados de fosfatase alcalina são 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) ou tetrazólio azul (NBT), e ao usar conjugados de peroxidase de rábano - 4-cloro-1-naftol e peróxido de hidrogênio .

Como resultado de reações enzimáticas, uma faixa ou mancha colorida é formada na membrana no local de localização do complexo antígeno-anticorpo.

A sensibilidade deste método é de 100 pg de proteína quando se utilizam conjugados AP e 100-500 pg quando se utilizam conjugados HRP. A detecção quimioluminescente de complexos imunes permite a detecção de menos de 5 pg de antígeno. O princípio deste método é que quando o HRP reage com o peróxido de hidrogênio e a diacilidrazina luminol cíclica, a luz é emitida no comprimento de onda de 428 nm, que pode ser registrada em um filme fotossensível.

A reação de imunotransferência (IB) foi desenvolvida com base em ELISA. É o método mais específico e sensível de análise imunoquímica. Immunoblotting (do inglês blot - blot, mancha) combina ELISA com eletroforese. É usado para detectar não anticorpos complexos contra o HIV, mas anticorpos para suas proteínas estruturais individuais (proteínas p24, glicoproteínas gp120, gp 41, etc.). Refere-se às reações de especialistas (de confirmação) para o diagnóstico da infecção pelo HIV.

A reação é realizada em várias etapas:

O vírus é destruído em componentes - antígenos (p24, gp120, gp 41, etc.), que são submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida, ou seja, à separação dos antígenos em frações por peso molecular.

2. O gel é coberto por uma membrana de nitrocelulose e as frações de antígeno são transferidas para ele por eletroforese. A nitrocelulose se comporta como papel absorvente. A membrana é cortada em tiras. As empresas produzem essas tiras com “manchas” de antígenos.

Immunoblotting - um método indireto adicional

As tiras revestidas com antígenos do HIV são imersas no soro do sujeito e depois lavadas para remover o material não ligado.

4. As tiras são incubadas com soro antiglobulina marcado com peroxidase e lavadas.

O substrato é adicionado e anota-se o número de frações coloridas (manchas) que correspondem à zona de localização do complexo AG-AT.

A presença de bandas em certas áreas da tira confirma a presença no soro testado de anticorpos para antígenos de HIV estritamente definidos. O resultado do imunoblotting é considerado positivo se bandas correspondentes a quaisquer dois dos três antígenos do HIV - p24, gp41 e gp 120 forem visíveis na membrana (Fig. 37).

DESENHOS

LISTA DE REFERÊNCIAS USADAS

Literatura principal

Microbiologia médica, virologia e imunologia: um livro didático para estudantes de medicina. universidades 2ª ed., rev. e adicional - 702 pág. Ed. A.A. Vorobyova. M.: MIA, 2012.

2. Microbiologia, virologia e imunologia: manual para aulas laboratoriais: livro didático/(V.B. Sboychakov e outros); editado por VB Sboychakova, MM Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 pp.: il.

3. Microbiologia médica, imunologia e virologia [recurso eletrônico]: livro didático sobre mel.

universidades - 760 rublos. — Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. São Petersburgo: Spetslit, 2010.

4. Microbiologia médica, virologia e imunologia [recurso eletrônico]: livro didático: em 2 volumes / Vol. 1. - 448 p. — Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Microbiologia médica, virologia e imunologia [recurso eletrônico]: livro didático: em 2 volumes.T. 2. - 480 p. Modo de acesso: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

literatura adicional

1. Reações imunodiagnósticas: livro didático / comp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Editora da Instituição Educacional Orçamentária do Estado de Educação Profissional Superior BSMU do Ministério da Saúde da Rússia, 2016. - 86 p.

2. Características de algumas propriedades que determinam o potencial patogênico de variações cocultivadas de bactérias Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: publicação científica / Yu.Z. Gabidullin, R.S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 seg.

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Imunoblot - o que é isso? Imunoblot no diagnóstico de doenças infecciosas

O que é um imunoblot? Este é um método comum para diagnóstico laboratorial de infecções virais humanas. É uma das formas mais precisas e confiáveis ​​de detectar a presença do HIV.

Em termos de confiabilidade, é ainda maior que o ensaio imunoenzimático (elisa). Os resultados do imunoblot são considerados conclusivos e conclusivos. Informações gerais

Imunoblot - o que é isso? Para reconhecer uma pessoa como portadora do HIV, você deve fazer um exame laboratorial para testar o soro sanguíneo quanto à presença de anticorpos.

As seções de Western blot também são chamadas de Western blots. É usado para detectar infecções virais humanas como um método especializado adicional. Isto é necessário para confirmar o ELISA - um teste laboratorial que permite determinar a presença de anticorpos contra o HIV no sangue. Immunoblot verifica novamente ELISA positivo.

É considerado o mais sensível, complexo e caro.

Alvo

O que é um imunoblot? Este método de teste laboratorial do soro sanguíneo para a presença de anticorpos contra o vírus.

Durante estudos especiais, as proteínas virais totais foram encontradas no gel e nas membranas de nitrocelulose.

Immunoblotting (detecção de anticorpos em soros de pacientes para certos antígenos de patógenos)

O procedimento de corte Western Blot destina-se a determinar a infecção pelo HIV em diferentes estágios. Na primeira etapa, o vírus purificado de suas partes constituintes é submetido à eletroforese e os antígenos nele incluídos são divididos por peso molecular.

O vírus da imunodeficiência humana se reproduz em células vivas incorporadas em sua informação genética. Nesta fase, uma pessoa torna-se portadora do vírus HIV se tiver sido infectada.

A especificidade desta doença é que ela não se manifesta por muito tempo. O vírus destrói os linfócitos, diminuindo assim a imunidade de uma pessoa e o corpo torna-se incapaz de combater infecções.

Se o HIV for tratado correta e prontamente, o paciente viverá até uma idade avançada. A falta de tratamento leva inevitavelmente à morte. A partir do momento da infecção, mas sem tratamento, o período máximo não passa de dez anos.

Peculiaridades

A análise de imunoblot é um método confiável que permite determinar a presença de anticorpos para antígenos do HIV do primeiro e segundo tipos.

Se uma pessoa estiver infectada, após duas semanas os anticorpos poderão ser detectados muito mais tarde. Uma característica especial do VIH é que a quantidade de anticorpos aumenta rapidamente e permanece no sangue do paciente. Mesmo que estejam presentes, a doença pode demorar dois ou mais anos para se manifestar. O método ELISA nem sempre indica com precisão a presença da doença, sendo necessária a confirmação dos resultados dos cortes de PCR e Western blot caso o imunoensaio enzimático apresente resultado positivo.

Indicações para

Que tipo de “immunoblot” já foi descoberto, mas qual está sendo introduzido no estudo?

O motivo do teste para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) será um resultado ELISA positivo. É necessária a realização de ensaio imunoenzimático em pacientes que serão submetidos a cirurgia. Além disso, você deve fazer uma análise das mulheres que planejam engravidar, bem como daquelas que são promíscuas. Seções de Western blot são prescritas para pacientes com infecção por HIV se os resultados do Elisa forem ambíguos.

Os seguintes sintomas alarmantes podem ser o motivo para consultar um médico: rápida perda de peso; fraqueza, perda de função; distúrbios intestinais (diarréia), que dura três semanas; desidratação; febre; aumento dos gânglios linfáticos no corpo; desenvolvimento de candidíase, tuberculose , pneumonia, toxoplasmose, exacerbação de herpes.

O paciente não precisa se preparar antes de doar sangue venoso.

Não coma 8 a 10 horas antes do teste. Na véspera da doação de sangue, não é recomendado ingerir bebidas alcoólicas ou café, praticar exercícios físicos intensos ou sentir ansiedade.

Onde fazer a análise?

Onde posso fazer o teste de HIV?

ELISA, análise de imunoblot, realizada em clínicas privadas da cidade, dá resultados em um dia. O diagnóstico urgente também é possível. Nas instituições públicas, os exames médicos Elisa e Western blot são gratuitos, de acordo com a legislação da Federação Russa.

Triagem obrigatória de doenças infecciosas em gestantes e pacientes que necessitam de internação ou cirurgia. Como é feito esse exame?

Como realizar o ELISA? Immunoblot positivo/negativo confirma ou refuta os resultados do elisa. O procedimento é bem simples. O especialista coleta sangue venoso, o que leva menos de cinco minutos.

Após a amostragem, o local da injeção deve ser desinfetado e coberto com um curativo. A amostragem é feita com o estômago vazio, portanto após o procedimento não fará mal nenhum comer uma barra de chocolate amargo ou uma bebida doce quente.

Para receber encaminhamento para um teste gratuito em uma instituição médica pública, você deve consultar um terapeuta.

Em geral, o imunoblot não difere dos demais exames de sangue pela coleta. A metodologia de pesquisa é simples. Se um vírus estiver presente no sangue de uma pessoa, o corpo começa a produzir anticorpos para destruí-lo. Para cada vírus existem muitos antígenos proteicos. A detecção destes anticorpos é a base do método de secção Western blot. Preço

Quanto tempo dura a análise? O imunoblot do HIV é um dos testes mais baratos.

Em média, os métodos de triagem por imunoensaio variam de 500 a 900 rublos. As seções de Western Blot são o estudo de testes, cujo custo varia de três a cinco mil rublos. Métodos mais complexos são muito mais caros. Por exemplo, para análise da reação em cadeia da polimerase (PCR), você precisará pagar cerca de 12.000 rublos.

interpretação de resultados

Os métodos mais comuns para diagnosticar a infecção pelo HIV são o ensaio imunoenzimático e o imunotransferência.

Eles são usados ​​para determinar anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana no soro. A infecção geralmente é confirmada por dois testes: de triagem e confirmatório. Os resultados devem ser interpretados por um médico, que diagnostica e prescreve o tratamento. Se o imunoblot for positivo, significa que existe um vírus no corpo humano.

Um resultado positivo não deve ser motivo para tratamento independente, pois cada paciente pode ter seu quadro da doença.

A análise qualitativa inclui triagem e certificação. Se o vírus não for detectado no paciente, o resultado é “negativo”. Quando este certificado é detectado, são realizados estudos de triagem adicionais. Análise de imunoblot, que confirma ou refuta a triagem. Se as tiras de teste aparecerem em certas áreas escuras (localização de proteínas), é feito o diagnóstico de HIV.

Se os resultados forem duvidosos, os testes são realizados no prazo de três meses.

É possível prevenir a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana se seguir algumas regras: evitar contato sexual casual, usar preservativo durante o contato, não usar drogas.

Caso a doença seja detectada em gestante, é importante seguir as recomendações do médico assistente e não se esquecer de fazer o teste para a presença do vírus.

O que é Western blotting?

A identificação de proteínas em misturas complexas ou extratos de vários tecidos é um dos problemas frequentemente encontrados. Utilizando uma ferramenta como anticorpos específicos, é possível determinar a proteína em estudo com um mínimo de tempo e custos financeiros.

No método Western blotting, na primeira etapa, uma mistura de proteínas é separada por eletroforese na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) e depois transferida para uma membrana de nitrocelulose por eletrotransferência.

A essência deste método é que após a eletroforese o gel é colocado sobre uma membrana de nitrocelulose entre camadas de papel de filtro. O “sanduíche” assim montado é colocado em um campo elétrico para que os complexos proteína-SDS se movam através da placa de gel e sejam imobilizados (como resultado da sorção inespecífica) na superfície da membrana de nitrocelulose.

A ligação do complexo proteína-SDS à membrana de nitrocelulose envolve principalmente forças de natureza elétrica, e essa interação é multiponto e leva ao “espalhamento” de proteínas na superfície da membrana. Assim, após a eletrotransferência, obtemos uma réplica de um gel sobre nitrocelulose com proteínas localizadas da mesma forma que em um gel de poliacrilamida.

Após eletroforese SDS, eletrotransferência e sorção de proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose, a conformação terciária da proteína é bastante alterada, se for geralmente correto falar sobre a existência de uma estrutura terciária para a proteína após um tratamento tão severo. Portanto, para detecção imunoquímica da proteína em estudo, normalmente são utilizados apenas anticorpos mono ou policlonais específicos para regiões lineares da molécula proteica.

51. Imunoensaio enzimático, imunotransferência. Mecanismo, componentes, aplicação.

Os anticorpos específicos para epítopos conformacionais (ou regiões que envolvem contactos intersubunidades) geralmente não são adequados para utilização em Western blotting.

Após a transferência da proteína, a membrana é incubada sequencialmente com anticorpos específicos para a proteína em estudo e, em seguida, com anticorpos secundários específicos para os fragmentos Fc dos anticorpos primários, conjugados com um marcador enzimático (ou algum outro) (Fig.

1A). No caso em que os anticorpos primários específicos do antígeno em estudo são conjugados diretamente ao marcador, não são necessários anticorpos secundários (Fig. 1 B). Os complexos imunológicos formados no local de localização da proteína em estudo são “manifestados” por meio de um substrato cromogênico (dependendo do tipo de marcador).

A sensibilidade e especificidade do método dependem muito de quais anticorpos são utilizados na pesquisa.

Os anticorpos utilizados devem ser específicos para uma sequência de aminoácidos única, característica apenas da proteína em estudo. Caso contrário, é possível a interação (especialmente no caso de extratos de proteína bruta) de anticorpos com diversas moléculas de proteína, o que por sua vez levará ao aparecimento de várias faixas coloridas na membrana.

A identificação da proteína em estudo neste caso é muitas vezes difícil ou mesmo impossível.

O segundo fator importante a ter em mente ao escolher os anticorpos é a afinidade. Quanto maior a afinidade dos anticorpos utilizados, mais brilhantes e claras são as bandas de proteína coradas e maior a sensibilidade do método. Ao usar anticorpos de alta afinidade, pode ser alcançada uma sensibilidade de 1 ng ou até mais.

Para visualizar o resultado da interação entre um antígeno ligado à membrana e anticorpos, são utilizados anticorpos secundários, conjugados com agentes capazes de produzir determinado sinal sob determinadas condições.

Normalmente, uma enzima (peroxidase ou fosfatase) é usada como tal agente, cujo produto de reação é colorido e precipita na membrana na forma de um precipitado insolúvel.

Também é possível usar rótulos fluorescentes neste método.

Arroz. 1. Esquema de coloração imunoquímica da proteína em estudo: A - utilizando anticorpos secundários conjugados a um marcador enzimático; B - o anticorpo primário é conjugado diretamente a um marcador enzimático.

Protocolo:

I. Preparação de gel e membrana e eletrotransferência de proteínas

Após electroforese, o gel de poliacrilamida é colocado num banho com tampão de transferência (Tris 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, etanol a 10%).

Duas folhas de papel filtro, cortadas no formato do cassete absorvente e umedecidas com tampão absorvente, são colocadas na parte do cassete que ficará voltada para o ânodo. Em seguida, uma membrana de nitrocelulose pré-umedecida com o mesmo tampão é colocada sobre o papel filtro, certificando-se de que não haja bolhas de ar entre a membrana e o papel.

O gel deve então ser cuidadosamente colocado sobre a membrana, prestando novamente especial atenção para garantir que não existem bolhas de ar entre o gel e a membrana. A formação do sanduíche é completada por duas camadas de papel filtro umedecido, que são colocadas na superfície do gel (Fig. 2). O sanduíche resultante é preso em um cassete e colocado entre os eletrodos de forma que a membrana fique voltada para o ânodo.

Arroz. 2. Esquema de eletrotransferência de proteínas para a membrana.

II. Transferência elétrica

A eletrotransferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose é realizada em um tampão contendo Tris 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, etanol a 10% por 30-50 min a uma voltagem constante de 100 V.

O tempo de eletrotransferência depende do tamanho das proteínas que estão sendo transferidas; quanto maior a proteína, mais tempo leva a eletrotransferência. A qualidade da eletrotransferência e a localização das bandas proteicas são avaliadas através da coloração da membrana de nitrocelulose com uma solução de Ponceau S a 0,3% em ácido acético a 1%. Antes da coloração imunoquímica, a membrana deve ser lavada várias vezes com uma solução aquosa fracamente alcalina de Tris para remover o corante ligado às proteínas.

III. Coloração imunoquímica de proteínas imobilizadas em uma membrana de nitrocelulose

Para bloquear locais de ligação inespecífica de anticorpos, a membrana é incubada com agitação constante à temperatura ambiente por 30 minutos em PBST (para melhor bloqueio, pode-se usar uma solução de PBST contendo 10% de leite em pó desnatado).

Após o bloqueio, a membrana é incubada durante uma hora à temperatura ambiente com agitação constante em PBST contendo 1-10 μg/ml de anticorpos específicos.

A concentração ideal de anticorpos é selecionada empiricamente e depende da afinidade de interação dos anticorpos com o antígeno.

No final da incubação, lave a membrana 5 vezes com PBST e transfira-a para uma solução de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. A diluição do conjugado geralmente é indicada pelo fabricante na embalagem, ou é selecionada empiricamente pelo pesquisador. Incubar a membrana na solução de anticorpo secundário durante 1 hora com agitação constante.

Após lavagem completa (trocar o tampão pelo menos 5-6 vezes), a membrana PBST é transferida para uma solução de substrato cromogênico contendo 3 mg de diaminobenzidina (DAB) e 10 μl de peróxido de hidrogênio a 30% em 10 ml de Tris-HCl 0,1 M , pH 7,6.

A incubação é realizada com agitação durante 5 a 10 minutos. Após a conclusão da incubação com o substrato, a membrana deve ser lavada com PBST, seca com papel filtro e uma cópia eletrônica deve ser feita imediatamente por digitalização colorida. Se a membrana secar completamente, as listras de proteína pintadas desbotam e a imagem fica menos brilhante e contrastante.

Nota: DAB é tóxico e potencialmente cancerígeno. Trabalhe apenas com luvas de borracha!

O diagnóstico oportuno da infecção pelo HIV torna-se uma medida extremamente importante, uma vez que o início precoce do tratamento pode determinar em grande parte o desenvolvimento da doença e prolongar a vida do paciente. Nos últimos anos, houve progressos significativos na identificação desta terrível doença: os sistemas de testes mais antigos estão a ser substituídos por outros mais avançados, os métodos de exame estão a tornar-se mais acessíveis e a sua precisão está a aumentar significativamente.

Neste artigo falaremos sobre métodos modernos de diagnóstico da infecção pelo HIV, cujo conhecimento é útil para o tratamento oportuno deste problema e para a manutenção de uma qualidade de vida normal do paciente.

Métodos de diagnóstico de HIV

Na Rússia, é realizado um procedimento padrão para diagnosticar a infecção pelo HIV, que inclui dois níveis:

• Sistema de teste ELISA (análise de triagem);
• imunotransferência (IB).

Outros métodos também podem ser usados ​​para diagnóstico:

• testes rápidos.

Sistemas de teste ELISA

Na primeira fase do diagnóstico, é utilizado um teste de rastreio (ELISA) para detectar a infecção pelo VIH, que se baseia em proteínas do VIH criadas em laboratórios que capturam anticorpos específicos produzidos no organismo em resposta à infecção. Após sua interação com os reagentes (enzimas) do sistema de teste, a cor do indicador muda. A seguir, essas alterações de cor são processadas por meio de equipamentos especiais, que determinam o resultado da análise realizada.

Esses testes ELISA podem mostrar resultados algumas semanas após a introdução da infecção pelo HIV. Este teste não determina a presença do vírus, mas detecta a produção de anticorpos contra ele. Às vezes, no corpo humano, a produção de anticorpos contra o HIV começa 2 semanas após a infecção, mas na maioria das pessoas eles são produzidos posteriormente, após 3-6 semanas.

Existem quatro gerações de testes ELISA com sensibilidades variadas. Nos últimos anos, têm sido cada vez mais utilizados sistemas de testes de terceira e quarta gerações, baseados em peptídeos sintéticos ou proteínas recombinantes e com maior especificidade e precisão. Podem ser usados ​​para diagnosticar a infecção pelo VIH, monitorizar a prevalência do VIH e garantir a segurança ao testar sangue doado. A precisão dos sistemas de teste ELISA de geração III e IV é de 93-99% (os testes produzidos na Europa Ocidental são mais sensíveis - 99%).

Para realizar um teste ELISA, são retirados 5 ml de sangue da veia do paciente. Devem decorrer pelo menos 8 horas entre a última refeição e a análise (geralmente é realizada pela manhã com o estômago vazio). Recomenda-se fazer esse teste não antes de 3 semanas após a suspeita de infecção (por exemplo, após relação sexual desprotegida com um novo parceiro sexual).

Os resultados do teste ELISA são obtidos em 2 a 10 dias:

• resultado negativo: indica ausência de infecção pelo HIV e não requer contato com especialista;
• resultado falso negativo: pode ser observado nos estágios iniciais da infecção (até 3 semanas), nos estágios posteriores da AIDS com supressão grave do sistema imunológico e com preparo sanguíneo inadequado;
• resultado falso positivo: pode ser observado em algumas doenças e em caso de preparo sanguíneo inadequado;
• resultado positivo: indica infecção pelo HIV, exige realização de IB e contato do paciente com especialista do centro de aids.

Por que um teste ELISA pode dar resultados falsos positivos?

Resultados falso-positivos do teste ELISA para HIV podem ocorrer devido ao processamento inadequado do sangue ou em pacientes com as seguintes condições e doenças:

• mieloma múltiplo;
• doenças infecciosas causadas pelo vírus Epstein-Barr;
• estado depois;
• doenças autoimunes;
• no contexto da gravidez;
• condição após a vacinação.

Pelas razões descritas acima, podem estar presentes no sangue anticorpos inespecíficos de reação cruzada, cuja produção não foi provocada pela infecção pelo HIV.

Nos últimos anos, a frequência de resultados falso-positivos diminuiu significativamente devido ao uso de sistemas de teste de geração III e IV, que contêm peptídeos mais sensíveis e proteínas recombinantes (são sintetizados por engenharia genética in vitro). Após a introdução de tais testes ELISA, a frequência de resultados falsos positivos diminuiu significativamente e é de cerca de 0,02-0,5%.

Um resultado falso positivo não significa que a pessoa esteja infectada pelo HIV. Nesses casos, a OMS recomenda a realização de outro teste ELISA (necessariamente geração IV).

O sangue do paciente é enviado para um laboratório de referência ou arbitragem com a marca “repetir” e testado usando um sistema de teste ELISA de geração IV. Se o resultado da nova análise for negativo, o primeiro resultado é considerado errôneo (falso positivo) e o IS não é realizado. Se o resultado for positivo ou duvidoso durante o segundo teste, o paciente deverá realizar IB após 4-6 semanas para confirmar ou refutar a infecção pelo HIV.

Bloqueio imunológico

Um diagnóstico definitivo da infecção pelo HIV só pode ser feito após a obtenção de um resultado positivo de imunoblotting (IB). Para isso, utiliza-se uma tira de nitrocelulose, sobre a qual são aplicadas proteínas virais.

A coleta de sangue para IB é realizada em uma veia. Em seguida, passa por um processamento especial e as proteínas contidas em seu soro são separadas em um gel especial de acordo com sua carga e peso molecular (a manipulação é feita com equipamentos especiais sob a influência de um campo elétrico). Uma tira de nitrocelulose é aplicada ao gel de soro sanguíneo e o blotting (“blotting”) é realizado em uma câmara especial. A tira é processada e se os materiais utilizados contiverem anticorpos contra o HIV, eles se ligam às bandas antigênicas do IB e aparecem como linhas.

IB é considerado positivo se:

• de acordo com os critérios do CDC americano - há duas ou três linhas gp41, p24, gp120/gp160 na tira;
• de acordo com os critérios da FDA americana, a tira possui duas linhas p24, p31 e uma linha gp41 ou gp120/gp160.

Em 99,9% dos casos, um resultado de IB positivo indica infecção pelo HIV.

Se não houver linhas, o IB é negativo.

Ao identificar linhas com gr160, gr120 e gr41, IB fica em dúvida. Este resultado pode ocorrer quando:

• doenças oncológicas;
• gravidez;
• transfusões de sangue frequentes.

Nesses casos, recomenda-se repetir o estudo com kit de outra empresa. Se após IB adicional o resultado permanecer duvidoso, é necessária observação por seis meses (IB é realizado a cada 3 meses).

Reação em cadeia da polimerase

Um teste PCR pode detectar o RNA do vírus. A sua sensibilidade é bastante elevada e permite detectar a infecção pelo VIH até 10 dias após a infecção. Em alguns casos, a PCR pode dar resultados falso-positivos, uma vez que a sua elevada sensibilidade também pode responder a anticorpos para outras infecções.

Esta técnica diagnóstica é cara e requer equipamentos especiais e especialistas altamente qualificados. Estas razões não permitem a realização de testes em massa à população.

PCR é usado nos seguintes casos:

• detectar o VIH em recém-nascidos de mães infectadas pelo VIH;
• detectar o HIV no “período de janela” ou em caso de BI duvidoso;
• controlar a concentração de HIV no sangue;
• para o estudo do sangue do doador.

O teste PCR por si só não faz o diagnóstico do HIV, mas é realizado como método diagnóstico adicional para resolver situações polêmicas.

Métodos expressos

Uma das inovações no diagnóstico do HIV são os testes rápidos, cujos resultados podem ser avaliados em 10 a 15 minutos. Os resultados mais eficazes e precisos são obtidos por meio de testes imunocromatográficos baseados no princípio do fluxo capilar. São tiras especiais nas quais são aplicados sangue ou outros fluidos de teste (saliva, urina). Se houver anticorpos contra o HIV, após 10-15 minutos uma tira colorida e de controle aparecerá no teste - um resultado positivo. Se o resultado for negativo, aparece apenas a tira de controle.

Tal como acontece com os testes ELISA, os resultados dos testes rápidos devem ser confirmados pela análise IB. Somente depois disso poderá ser feito o diagnóstico de infecção pelo HIV.

Existem kits de teste rápido em casa disponíveis. O teste OraSure Technologies1 (EUA) é aprovado pela FDA, está disponível sem receita e pode ser usado para detectar o HIV. Após o teste, se o resultado for positivo, é recomendado que o paciente faça exame em centro especializado para confirmar o diagnóstico.

Outros testes para uso doméstico ainda não foram aprovados pela FDA e os seus resultados podem ser muito questionáveis.

Apesar de os testes rápidos terem precisão inferior aos testes ELISA de geração IV, eles são amplamente utilizados para testes adicionais da população.

Você pode fazer testes para detectar a infecção pelo HIV em qualquer clínica, hospital distrital central ou centros especializados em AIDS. No território da Rússia, eles são realizados de forma absolutamente confidencial ou anônima. Cada paciente pode esperar receber consulta médica ou psicológica antes ou depois do teste. Você só terá que pagar pelos testes de HIV em instituições médicas comerciais, enquanto em clínicas e hospitais públicos eles são realizados gratuitamente.

Leia sobre as maneiras pelas quais você pode ser infectado pelo HIV e quais mitos existem sobre as possibilidades de ser infectado.

O nome dele é AIDS Vyacheslav Zalmanovich Tarantul

Immunoblotting - um método indireto adicional

Além do ELISA, em certos casos, um procedimento chamado “immunoblotting” ou “immunoblotting” (às vezes chamado de “Western blot”) é usado para testar a infecção pelo HIV. De acordo com as recomendações da OMS, o imunoblotting é utilizado no diagnóstico da infecção pelo HIV como um método especializado adicional, que deve confirmar os resultados do ELISA. Normalmente, este método verifica novamente um resultado ELISA positivo, uma vez que é considerado mais sensível e específico, embora mais complexo e caro. Mas antes de assinar o veredicto final sobre o paciente, o médico deve ter plena certeza da correção do diagnóstico. Portanto, a questão da complexidade e do alto custo não pode ser decisiva aqui.

Tanto em termos de finalidade quanto de método de execução, a conhecida expressão “colocar em um mata-borrão” é adequada para imunotransferência. Immunoblotting combina um ensaio imunoenzimático (ELISA) com separação eletroforética preliminar de proteínas virais em um gel e sua transferência para uma membrana de nitrocelulose (“blotter”). O procedimento de imunotransferência consiste em várias etapas (Fig. 27). Primeiramente, o HIV, previamente purificado e destruído em seus componentes constituintes, é submetido à eletroforese, e todos os antígenos incluídos no vírus são separados por peso molecular. Em seguida, usando o método de blotting (análogo a espremer o excesso de tinta em um absorvente), os antígenos são transferidos do gel para uma tira de nitrocelulose ou filtro de náilon, que agora contém um espectro de proteínas características do HIV, invisíveis aos olhos. . Em seguida, o material de teste (soro, plasma sanguíneo do paciente, etc.) é aplicado na tira e, se a amostra contiver anticorpos específicos, eles se ligam às tiras de proteína antígeno que lhes correspondem estritamente. Como resultado de manipulações subsequentes (semelhantes ao ELISA), o resultado dessa interação é visualizado - tornado visível. Em última análise, a presença de bandas em certas áreas da tira confirma a presença no soro testado de anticorpos para antígenos de HIV estritamente definidos.

O imunoblotting é mais frequentemente usado para confirmar o diagnóstico de infecção pelo HIV. A OMS considera soros positivos nos quais anticorpos para quaisquer duas proteínas do envelope do HIV são detectados por imunotransferência. De acordo com estas recomendações, se houver reação com apenas uma das proteínas do envelope (gp160, gp120, gp41) em combinação ou sem reação com outras proteínas, o resultado é considerado duvidoso e recomenda-se um novo teste usando um kit de um série diferente ou de uma empresa diferente. Para estar do lado seguro, se

Arroz. 27. Para a realização do imunoblotting, na primeira etapa, as proteínas contidas no soro sanguíneo são separadas em um gel de acordo com seu peso molecular e carregadas por meio de um campo elétrico (por eletroforese em gel). Em seguida, uma membrana de nitrocelulose ou náilon é colocada sobre o gel e “borrada” (isso é borrão). Isto é realizado em uma câmara especial, que permite a transferência completa do material do gel para a membrana. Como resultado, o padrão de arranjo proteico que estava no gel é reproduzido na membrana (blot), que pode então ser facilmente manipulado. Inicialmente, a membrana é tratada com anticorpos para o antígeno desejado e, após a lavagem do material não ligado, é adicionado um conjugado marcado radioativamente que se liga especificamente aos anticorpos (como no ELISA). A localização do complexo conjugado marcado com antígeno-anticorpo resultante é determinada usando autorradiografia usando filme de raios X. Após sua manifestação, fica claro se há antígenos no sangue ou não, e depois disso o resultado permanece duvidoso, recomenda-se o acompanhamento por seis meses (a pesquisa continua a cada três meses).

Atualmente, na Federação Russa, recomenda-se a utilização de cinco sistemas de teste para diagnóstico da infecção pelo HIV, entre os quais existem russos e estrangeiros.