Métodos modernos para diagnosticar a infecção pelo HIV. Diagnóstico ELISA: qual a essência, determinação de anticorpos, como é feito e para quais doenças é eficaz? Anti HIV 1 2 o que

Proprietários da patente RU 2283497:

A invenção refere-se ao campo da biotecnologia e da medicina. O sistema de teste imunoabsorvente ligado a enzima para identificar o espectro de anticorpos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) do primeiro e segundo tipos, o primeiro tipo do grupo O e identificar o antígeno para o vírus da imunodeficiência humana do primeiro tipo p24 inclui um imunoabsorvente baseado em antígenos do vírus da imunodeficiência humana representando gp41 (env HIV-1 e HIV-2 grupo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), anticorpos para antígeno 1 do HIV p24 e reagentes de detecção, os antígenos de HIV acima e anticorpos de HIV sorvidos em diferentes poços de placas para ensaio de imunoabsorção enzimática e placas dobráveis ​​ou não separáveis ​​de poliestireno de 96 poços são usados ​​para sorção. A invenção proporciona maior sensibilidade, simplificação e eliminação da subjetividade na avaliação de resultados. 1 salário arquivos, 10 tabelas, 1 doente.

A invenção refere-se ao campo da biotecnologia e da medicina. Uso: detecção diferenciada de todas as classes de anticorpos específicos para proteínas 1 e 2 do vírus da imunodeficiência humana, HIV 1 grupo O e antígeno p24 do HIV 1.

Essência: obtenção de um sistema de teste imunoabsorvente ligado a enzima para identificar o espectro de anticorpos de todas as classes para proteínas individuais e HIV 1 e 2, HIV 1 grupo O e antígeno p24 do HIV 1 em soro sanguíneo (plasma), imunoglobulinas e hemoderivados humanos em para identificar o espectro de anticorpos para HIV 1 e 2, HIV 1 grupo O, detecção do antígeno p24 do HIV 1 e confirmação de resultados de triagem positivos ou questionáveis ​​para anticorpos para HIV 1 e 2, HIV 1 grupo O e antígeno p24 do HIV 1.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

O diagnóstico laboratorial da infecção pelo VIH baseia-se em três áreas: a) indicação do VIH e seus componentes; b) detecção de anticorpos para HIV; c) determinação de alterações no sistema imunológico. Dentre os métodos de diagnóstico laboratorial existentes, os mais comuns são os sorológicos - detecção de anticorpos contra antígenos virais.

Para detectar anticorpos na infecção pelo HIV, são utilizados principalmente o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o imunotransferência (IB). O ELISA baseia-se na imobilização de antígenos virais em placas às quais os anticorpos do paciente se ligam, e o complexo antígeno-anticorpo é detectado usando anticorpos monoclonais de camundongo conjugados com peroxidase de rábano para imunoglobulinas humanas G e M. O método é bastante específico e sensível e permite a detecção de anticorpos específicos do vírus em 95% dos pacientes. Os restantes 5% dos casos ocorrem nas fases iniciais da infecção, quando ainda existem poucos anticorpos no soro sanguíneo, ou nas fases terminais da doença, quando o corpo já não é capaz de sintetizar anticorpos devido a um esgotamento acentuado de o sistema imunológico. Resultados falso-positivos de ELISA também são possíveis, principalmente em pacientes com doenças autoimunes e oncológicas, bem como em casos de infecção causada pelo vírus Eshptain-Barr. Neste caso, ocorre uma reação cruzada de anticorpos ao fator reumatóide, ao vírus Epstein-Barr ou a determinantes antigênicos semelhantes às proteínas do complexo principal de histocompatibilidade classe 1 e 2 (HLA-4 e DQW3) e com capacidade de se ligar aos antígenos do HIV. ocorre. Resultados falso-positivos são comuns em mulheres grávidas e idosos. Hemólise, lipemia e contaminação bacteriana do soro também podem causar resultados não confiáveis.

A este respeito, vários métodos foram propostos e utilizados para testar a especificidade dos resultados de detecção de anticorpos. Desses métodos, a reação mais comumente utilizada é o “imune blotting” na modificação “Western Blot”. A essência do método é a seguinte: na primeira etapa, as proteínas do HIV são separadas por peso molecular por eletroforese em gel de poliacrilamida. A transferência eletroforética é então realizada do gel de poliacrilamida para a superfície da membrana de nitrocelulose. Os antígenos transferidos desta forma são detectados na membrana por meio de análise indireta: a membrana é incubada com o material de teste; os anticorpos contidos ligam-se aos antígenos do HIV transferidos para uma membrana de nitrocelulose, então as tiras da membrana são incubadas com o conjugado; Quando um complexo antígeno-anticorpo é formado, o conjugado se liga a ele; após a lavagem do conjugado e incubação com o substrato, ocorre coloração nas áreas da nitrocelulose onde ocorreu a formação do complexo antígeno-anticorpo-conjugado. O desenho mostra exemplos de resultados de imunotransferência positivos, fracamente positivos e negativos.

Anticorpos para as seguintes proteínas (p) e glicoproteínas (gp) são detectados no soro de pessoas infectadas com HIV-1 e HIV-2: Tabela A.

A Tabela B apresenta os critérios para avaliação dos resultados do imunoblotting recomendados pela OMS e pelo Centro Russo para a Prevenção e Controle da AIDS.

Com base nos critérios da OMS, os soros nos quais são detectados anticorpos para quaisquer duas proteínas do envelope do VIH-1 pelo método IB são considerados positivos. Se houver reação com apenas uma das proteínas do envelope (gp160, gp120, gp41) em combinação com ou sem reação com outras proteínas, o resultado é considerado duvidoso. De acordo com o Centro Científico e Metodológico Federal do Ministério da Saúde da Federação Russa para a Prevenção e Controle da AIDS, é possível interpretar os soros como positivos mesmo na presença de anticorpos para apenas uma proteína de membrana.

A detecção de anticorpos contra o antígeno p24 pode indicar o período de início da soroconversão, uma vez que os anticorpos contra essa proteína aparecem primeiro. As reações positivas com proteínas gag e pol sem a presença de reação com proteínas env podem refletir o estágio de soroconversão precoce e também indicar a presença de infecção por HIV-2 ou uma reação inespecífica.

O uso da reação de imunotransferência como método especializado para diagnosticar o HIV tem uma série de desvantagens significativas:

1. A impossibilidade de confirmação da detecção do antígeno p24 1 do HIV no caso de utilização de testes que detectem simultaneamente antígeno e anticorpos para HIV, o que torna inadequada (sem sentido) a utilização de testes de triagem para detecção simultânea de antígeno e anticorpos para HIV ( Ordem do Ministério da Saúde da Federação Russa nº 292 de 30 de julho de 2001: “para examinar doadores em estações de transfusão de sangue, é necessário utilizar sistemas de teste que detectem simultaneamente antígenos e anticorpos para HIV”).

2. Detecção apenas de anticorpos da classe IgG. É impossível confirmar totalmente os resultados positivos obtidos com testes de 3ª e 4ª geração (detecção de anticorpos IgG e IgM).

3. Subjetividade na interpretação da avaliação do teste, especialmente nos casos de resultados “duvidosos” e “incertos” e nas fases iniciais da seroconversão (as bandas detectadas nas membranas de nitrocelulose nestes casos são pouco claras, pouco visíveis a olho nu, e muitas vezes há desacordo quando avaliado por pessoas diferentes).

4. Impossibilidade de avaliação quantitativa automatizada dos resultados da análise.

5. Menor sensibilidade em comparação com ELISA.

6. Prazo de validade curto (durante o armazenamento, as tiras de membrana de nitrocelulose desbotam e não podem ser uma confirmação objetiva da detecção ou não detecção do HIV em casos controversos).

7. Dificuldade na preparação da reação e armazenamento (as tiras da membrana de nitrocelulose são muito frágeis e quebram frequentemente).

8. Alto custo dos kits de segurança da informação.

Um reagente conhecido é um kit para determinação simultânea de antígenos e anticorpos para o mesmo patógeno, incluindo HIV (DE 4236189 F1, 28/04/1994). No entanto, não é divulgado um sistema de teste que permita diagnosticar a infecção pelo HIV em vários estágios.

O objetivo da presente invenção é obter um sistema de testes com o qual seja possível confirmar resultados positivos ou questionáveis ​​de testes de triagem para anticorpos contra HIV 1 e 2, HIV 1 grupo O e antígeno p24 do HIV 1 quando se utilizam testes para detecção simultânea de antígenos e anticorpos.

A solução técnica proposta é alcançada por um sistema de teste imunoabsorvente enzimático para identificar o espectro de anticorpos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) do primeiro e segundo tipos, o primeiro tipo do grupo O e identificar o antígeno p24 para o vírus da imunodeficiência humana vírus do primeiro tipo p24, caracterizado por incluir um imunoabsorvente baseado em antígenos do vírus da imunodeficiência humana, representando gp41 (env HIV-1 e HIV-2 grupo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), anticorpos para antígeno p24 de HIV 1 e reagentes de detecção, enquanto os antígenos de HIV e anticorpos de HIV mencionados acima são adsorvidos em diferentes poços de placas de ensaio imunoabsorvente enzimático.

Além disso, placas dobráveis ​​ou não desmontáveis ​​de poliestireno de 96 poços para imunoensaio enzimático são usadas para sorção.

O resultado técnico alcançado pela presente invenção é a possibilidade de confirmação de resultados positivos para anticorpos para HIV 1 e 2, HIV 1 grupo O e antígeno p24 do HIV 1, alta sensibilidade, possibilidade de interpretação automatizada dos resultados, o que elimina a subjetividade do avaliação, facilidade de realização do teste, menor do que com os conjuntos de segurança da informação de custo existentes.

Esta solução técnica difere das conhecidas:

1. Utilização de placa para reações imunológicas como carreador de fase sólida.

2. Uso simultâneo de anticorpos contra HIV p 24 e um conjunto de antígenos de HIV como sorvente.

A invenção é ilustrada pelo seguinte exemplo.

Os princípios ativos do sistema de teste desenvolvido "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" são:

Imunoabsorvente - antígenos recombinantes semelhantes às proteínas estruturais do HIV-1: gp41 (env HIV-1 e HIV 1 grupo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) e anticorpos monoclonais de camundongo para o antígeno HIV 1(p24), adsorvidos separadamente em tiras de uma placa dobrável de poliestireno.

Para preparar o uso de imunoabsorventes:

1. A gp41 do HIV-1 é uma proteína produzida pela cepa de E. Coli No. AHIV 103.

2. A gp120 do HIV-1 é uma proteína produzida pela cepa de E. Coli No. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 é uma proteína produzida pela cepa de E. Coli No. AHIV 105.

4. HIV-1 p31 é uma proteína produzida pela cepa de E. Coli No. AHIV 108.

5. HIV-2 p36 é uma proteína produzida pela cepa de E. Coli No. AHIV 106.

O conjugado 1, liofilizado ou líquido, é um anticorpo monoclonal de camundongo para o antígeno p24 do HIV1 conjugado com biotina.

1. O conjugado 2, liofilizado ou líquido, é uma mistura de antígenos recombinantes semelhantes às proteínas estruturais do HIV-1: gp41 (env HIV-1 e HIV 1 grupo O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), conjugado com biotina;

2. Conjugados 3, 4 - liofilizados ou líquidos - estreptavidina, marcados com peroxidase de raiz forte;

Durante os estudos preliminares, foi selecionado o desenho do sistema de teste, desenvolvida a tecnologia de preparação de seus componentes e otimizadas as condições para a realização da reação de imunoensaio enzimático.

Ao realizar ELISA no sistema de teste "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", 25 μl de conjugado-1 são adicionados aos poços da placa com anticorpos sorvidos para p24 e 25 μl de conjugado-1 é adicionado aos poços com antígenos sorvidos. 25 µl de conjugado-2. O esquema de reação é mostrado abaixo. Em seguida, 25 μl da amostra de teste são adicionados a cada poço. Ao mesmo tempo, nos poços com antígenos a cor muda de laranja para rosa, e nos poços com anticorpos - de verde para cinza. A mistura é incubada durante 45 minutos a 37°C num agitador (ou 1 hora a 37°C num termóstato). Em seguida, sem lavar, adicione 50 μl de conjugado-3 nos poços da placa para determinação do antígeno p24 e 50 μl de conjugado-4 nos poços para determinação de anticorpos. Após incubação durante 20 minutos a 37°C num agitador (ou 30 minutos a 37°C num termóstato), a placa é lavada e revelada com uma mistura de substrato. Tempo total de reação 1 hora e 25 minutos (ou 1 hora e 50 minutos). O antígeno p24 presente na amostra de teste liga-se a anticorpos monoclonais para p24, e os anticorpos específicos formam um complexo com antígenos recombinantes na placa. O complexo imune resultante de anti-p24 com p24 é detectado com conjugados anti-p24-biotina, depois com estreptavidina-peroxidase, e os complexos imunes Ag-HIV com At-HIV são detectados com um conjugado Ag-biotina, depois com estreptavidina- peroxidase.

Esquema para configurar a reação.

Os resultados são considerados espectrofotometricamente em dois comprimentos de onda: 450/620-680 nm com o dispositivo configurado “por via aérea”. Vamos levar em consideração os resultados em um comprimento de onda de 450 nm.

Os resultados da análise são levados em consideração se os valores médios de densidade óptica (DO) em poços com K- não forem superiores a 0,2, em poços com K+ - não inferiores a 1,0. OP crítico. calculado pela fórmula:

OP crítico. gp41 = média. significado OP K-(gp41)+0,15

OP crítico. gp120 = média. significado OP K-(gp120)+0,15

OP crítico. p24 = média. significado OP K-(р24)+0,15

OP crítico. p31 = média. significado OP K-(р31)+0,15

OP crítico. gp36 = média. significado OP K-(gp36)+0,15

OP crítico. Ag p24 = média. significado OP k- (Ag p24)+0,04

onde 0,15 e 0,04 são coeficientes estabelecidos por processamento estatístico no fabricante. Durante o desenvolvimento do sistema de teste foram utilizados:

1. Amostras de soro sanguíneo de doadores saudáveis ​​(n=610).

2. Amostras de soro sanguíneo de pacientes com diversas doenças infecciosas não relacionadas ao HIV (infecções respiratórias agudas, pneumonia, amigdalite, infecções herpéticas e por citomegalovírus, sífilis, clamídia, hepatites virais A, B e C (n=224)).

3. Amostras de soro sanguíneo de pacientes com diversas doenças não infecciosas - trauma, doenças do sistema cardiovascular, oncologia (n=35).

4. Amostras de soro sanguíneo de gestantes (n=40).

5. Amostras de soro sanguíneo soropositivas em ELISA e confirmadas em imunoblot (n=428).

6. Amostras de soro com resultado positivo obtido em sistemas de teste de imunoensaio enzimático para determinação simultânea de anticorpos HIV 1.2 e antígeno p24, e resultado indeterminado por imunoblot (n=123).

7. Painel interno de soros contendo e não contendo anticorpos para HIV 1,2, testados em sistemas de teste de imunoensaio enzimático e imunotransferência registrados pelo Ministério da Saúde da Federação Russa (n=21).

8. Padrão "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", França, cat. Nº 72217, que é um antígeno obtido a partir de lisado viral.

9. Padrão interno da empresa. Uma amostra contendo antígeno p 24 na concentração de 200 pg/ml, obtida do lisado viral e titulada de acordo com o "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" empresa "BIO RAD", França, cat. Nº 72217.

10. Painel padrão de soros contendo anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

11. Painel padrão de soros contendo anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 2 (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

12. Painel padrão de soros que não contêm anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 e 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, "União Médica e Biológica", Novosibirsk.

A sensibilidade do sistema de teste para detecção do antígeno p24 foi avaliada usando o “HIV I ANTIGEN STANDARD”, “BIO RAD” e o Padrão Interno da empresa. Utilizando o padrão interno, foram preparadas 4 diluições seriadas de 2 vezes, de 40 pg/ml a 5 pg/ml, com plasma de doador normal, livre de anticorpos de HIV 1, 2, como diluente. A menor quantidade de antígeno detectável foi tomada como critério de sensibilidade. Os dados obtidos são apresentados na Tabela 1.

Para avaliar a sensibilidade do sistema de teste na detecção de anticorpos específicos, foram utilizados painéis padrão de amostras contendo anticorpos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42- 28-216-02P (HIV 2) p.003).

Os dados obtidos são apresentados nas tabelas 3, 4.

A eficiência diagnóstica do sistema de teste "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" foi comparada com os sistemas de teste "Jenskrin-HIV-Ag/At" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard ) , "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicena" (Avicena). Para este efeito, as amostras de soro do painel interno foram testadas em todos os testes especificados. Os resultados apresentados na Tabela 5 indicam a alta eficiência diagnóstica do "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1".

Estudos de sensibilidade do sistema de teste "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" também foram realizados com soros sanguíneos de pacientes confirmados por imunotransferência como HIV positivos. Um total de 428 amostras desses soros foram testadas. Várias opções foram obtidas para detectar anticorpos para diferentes proteínas do HIV e para o antígeno p24. Os resultados são apresentados na Tabela 6.

Ao testar amostras positivas para HIV 1, 3% dos soros apresentaram uma reação positiva com gp36 (env HIV 2). OP/OPcrit. nestas amostras não excedeu 2,0. Nossos dados sobre a reatividade cruzada das proteínas da camada externa do HIV 1 (gp41) e do HIV 2 (gp36) coincidem com os dados da literatura.

interpretação de resultados

A análise dos testes de soros HIV positivos e amostras de painéis padrão e internos em "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" permitiu-nos desenvolver critérios de interpretação dos resultados deste teste. Os critérios recomendados são apresentados na Tabela 7.

Com base nestes critérios, todas as amostras de soros HIV positivos (n=428) foram determinadas como positivas no “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1”. Das 16 amostras do painel padrão contendo anticorpos para HIV 1, 14 foram determinadas como positivas e 2 foram determinadas como indeterminadas. Todas as 8 amostras do painel padrão contendo anticorpos para HIV 2 foram determinadas como positivas. Das 10 amostras do painel interno contendo anticorpos para HIV 1, 7 foram determinadas como positivas e 3 foram determinadas como indeterminadas.

Estudos de sensibilidade do sistema de teste "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" também foram realizados com soros sanguíneos de pacientes que tiveram resultado positivo em sistemas de teste imunoabsorventes ligados a enzimas que detectam simultaneamente anticorpos e Antígeno p24 e indeterminado em imunotransferência. Um total de 123 dessas amostras foram testadas. Os dados são apresentados na Tabela 8.

Ao testar soros com resultado de imunoblot indeterminado (n=123) em “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”, 72 amostras (58,5%) apresentaram resultado positivo. Destes, 26 soros (21,1%) foram positivos apenas para p24, 20 (16,3%) - apenas para anticorpos, 16 (13%) - para p24 com anticorpos para uma das proteínas, 10 (8,1%) - para p24 com anticorpos para duas ou mais proteínas. Assim, testar apenas anticorpos (sem detectar p24) identificaria 30 amostras (24,4%) como positivas. A detecção do antígeno p24 no teste permitiu que mais 42 amostras (34,1%) fossem identificadas como positivas.

Para avaliar a especificidade do sistema de teste, foi utilizado um painel padrão de soros que não continha anticorpos para HIV 1, 2 (n=20); amostras de soro sanguíneo de doadores saudáveis ​​(n=610), amostras de soro sanguíneo de pacientes com diversas doenças infecciosas (n=224) não relacionadas ao HIV; amostras de soro sanguíneo de pacientes com diversas doenças não infecciosas - trauma, doenças do aparelho cardiovascular, oncologia (n=35); amostras de soro sanguíneo de gestantes (n=40). Um total de 929 amostras foram testadas. Uma amostra do soro sanguíneo de doadores saudáveis ​​apresentou um resultado falso positivo - foram detectados anticorpos para gp41 e p24. 7 amostras de soro sanguíneo de doadores saudáveis ​​e 2 amostras de soro sanguíneo de pacientes com doenças infecciosas não relacionadas ao HIV apresentaram resultado falso positivo para p24.

Para avaliar a especificidade do sistema de teste, foi utilizado um painel padrão de amostras negativas (OSO 42-28-214-94-02p, p. 009). A especificidade foi de 100%.

Assim, os estudos demonstraram que a especificidade do sistema de teste “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” é de 99% ao examinar amostras de soro sanguíneo de doadores normais e pacientes com diversas doenças infecciosas e somáticas .

Os dados obtidos mostram a alta eficiência diagnóstica do sistema de teste desenvolvido "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1". O sistema de teste pode ser usado para detectar anticorpos contra proteínas individuais dos tipos 1 e 2 do HIV e o antígeno p24 do HIV1, a fim de confirmar um resultado de triagem positivo com sistemas de teste que detectam anticorpos ou sistemas de teste que detectam simultaneamente anticorpos e antígeno p24 do HIV1. O sistema de teste pode ser utilizado como alternativa ao teste de imunotransferência para confirmar resultados positivos, bem como para estudar a dinâmica dos anticorpos HIV e do antígeno p24 em diferentes estágios da infecção.

VANTAGENS DO TESTE

1. Teste imunoenzimático confirmatório em formato de comprimido

2. Teste confirmatório combinando determinação do espectro de anticorpos HIV 1, 2 e antígeno p24 do HIV 1

3. Detecção de anticorpos de todas as classes Ig

4. A sensibilidade para detectar p24 é de pelo menos 5 pg/ml

5. Reduz resultados indeterminados em comparação com imunoblotting

6. Tempo de análise - 1 hora e 25 minutos (immunoblot - de 3 a 20 horas)

7. Avaliação visual da adição de todos os componentes e amostras.

1. Um sistema de teste imunoabsorvente ligado a enzima para identificar o espectro de anticorpos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) do primeiro e segundo tipos, o primeiro tipo do grupo O e identificar o antígeno p24 para o vírus da imunodeficiência humana do primeiro tipo p24, caracterizado por incluir um imunoabsorvente baseado em antígenos do vírus da imunodeficiência humana, representando gp41 (env HIV-1 e HIV-2 grupo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV -2), anticorpos contra o antígeno p24 do HIV 1 e reagentes de detecção, enquanto os antígenos e anticorpos contra o HIV mencionados acima são sorvidos em diferentes poços de placas para ensaio de imunoabsorção enzimática.

2. Sistema de teste de imunoensaio enzimático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para sorção são utilizadas placas de poliestireno dobráveis ​​ou indissociáveis ​​de 96 poços para imunoensaio enzimático.

O vírus mais difundido no mundo hoje é o da AIDS, um vírus da subfamília dos retrovírus; também são chamados de lentivírus, ou “lentos”. Na verdade, no corpo humano eles começam a apresentar atividade após um tempo relativamente longo, aproximadamente 10 anos.

Existem imunodeficiências do primeiro e do segundo tipo. Mas podemos falar com segurança sobre a expansão do primeiro tipo de vírus. Uma vez no sangue e ingressando na célula responsável pela imunidade, o vírus começa a se multiplicar rapidamente. Enquanto a molécula CD4, responsável pelo seu reconhecimento, identifica o inimigo insidioso, ela consegue infectar todo o corpo. Portanto, quanto mais cedo for diagnosticado, maiores serão as chances do paciente receber tratamento oportuno e viver mais.

Se uma pessoa tiver um motivo para fazer o teste de AIDS, isso deve ser feito imediatamente. Na maioria das vezes, a base desse diagnóstico é a determinação de anticorpos para imunodeficiência no sangue - proteínas que surgem em reação à presença do vírus e começam a se formar no período de 1,5 a 6 meses a partir do momento do possível infecção. Dessa forma, é mais aconselhável fazer diagnósticos após esse período.

A quantidade de anticorpos é determinada usando uma análise chamada ensaio imunoenzimático (ELISA). Este método é confiável, é relativamente preciso e altamente sensível, esses números são superiores a 99,5%. O mercado farmacêutico oferece vários kits de testes de diagnóstico para ELISA: CombiBest HIV, Anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV, CombiBest anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV 1 2 d 0172. Esses sistemas de teste pertencem ao terceiro geração. A desvantagem desses reagentes é que nem sempre detectam a doença precocemente. A pessoa já é portadora do vírus, é potencialmente perigosa para os parceiros, mas os anticorpos ainda não estão presentes no sangue.

Os kits são equipados principalmente com uma série de testes para realizar 12*8 ou 192 testes anti-HIV. Não é recomendado usá-los sozinho. A descrição dos medicamentos indica que seu objetivo principal é detectar a quantidade de anticorpos contra os dois tipos de AIDS. E também determinar anticorpos de todas as classes para AIDS. Se não houver anticorpos, a doença não foi diagnosticada.

A quarta geração de testes “vê”, além dos anticorpos, antígenos da AIDS; eles são capazes de detectar a infecção mais cedo do que os métodos de terceira geração. Para efeito de comparação: o antígeno do HIV está no sangue a partir do 5º dia e os primeiros anticorpos aparecem não antes de um mês depois. CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (conjunto 1) e CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (conjunto 2) pertencem aos testes de 4ª geração. Usando um conjunto desses reagentes, os anticorpos para o antígeno tipo 1, 2 e p24 são detectados pelo exame de soro ou plasma sanguíneo humano. Muitos países utilizam o teste ELISA de 4ª geração, também denominado Antígeno/Anticorpo, abreviado como AGAT.

Os testes são realizados anonimamente.

O ELISA (ensaio imunoenzimático, ELISA) entrou na vida da medicina prática em algum lugar na década de 60 do século passado. Sua tarefa inicial era a pesquisa histológica para fins científicos, que se resumia à busca e identificação da estrutura antigênica das células de um organismo vivo.

O método ELISA baseia-se na interação de antígenos específicos (AT) e relacionados (AG) com a formação de um complexo “antígeno-anticorpo”, que é detectado por meio de uma enzima. Este fato levou os cientistas a pensar que o método pode ser usado para fins diagnósticos para identificar imunoglobulinas específicas de várias classes envolvidas na resposta imune a uma determinada infecção. E foi um avanço no diagnóstico laboratorial clínico!

O método começou a ser utilizado ativamente apenas no início dos anos 80, e principalmente em instituições especializadas. Os primeiros analisadores de imunoenzimas foram equipados com centros e estações de transfusão de sangue, hospitais de doenças infecciosas e de venereologia, pois a formidável SIDA, nascida no continente africano, surgiu no nosso horizonte e juntou-se imediatamente às “velhas” infecções, exigiu medidas imediatas de diagnóstico e a procura para medicamentos terapêuticos que o afetam.

Âmbito de aplicação do método ELISA

As possibilidades do imunoensaio enzimático são verdadeiramente extensas. Agora é difícil imaginar como podemos prescindir dessas pesquisas, que são utilizadas literalmente em todos os ramos da medicina. Ao que parece, o que o ELISA pode fazer em oncologia? Acontece que pode. E muito. A capacidade da análise de encontrar marcadores característicos de determinados tipos de neoplasias malignas fundamenta a detecção precoce de um tumor, quando este ainda não é determinado por nenhum outro método devido ao seu pequeno tamanho.

O moderno diagnóstico clínico laboratorial (CDL), além dos marcadores tumorais, possui um significativo arsenal de painéis ELISA e os utiliza para diagnosticar diversas condições patológicas (processos infecciosos, distúrbios hormonais) e monitorar medicamentos farmacêuticos, a fim de identificar seu efeito no corpo do paciente e, aliás, não apenas humano. Atualmente, o imunoensaio enzimático é muito utilizado nos serviços veterinários, pois os “nossos irmãos mais novos” também são suscetíveis a muitas doenças, das quais às vezes sofrem muito.

Por isso, O ELISA, devido à sua sensibilidade e especificidade, pode determinar a partir de uma amostra de sangue retirada de uma veia:

• Estado hormonal (hormônios tireoidianos e adrenais, hormônios sexuais);
• A presença de infecções virais e bacterianas (HIV, B e C, clamídia, sífilis e, e, assim como muitas outras doenças causadas por microrganismos patogênicos);
• Vestígios da atividade vital dos microrganismos que iniciaram o processo infeccioso, que terminou com sucesso e passou para a fase de formação de uma resposta imune a esse patógeno. Tais vestígios, isto é, anticorpos, em muitos casos permanecem circulando no sangue por toda a vida, protegendo assim a pessoa da reinfecção.

Qual é a essência do ELISA?

O método de imunoensaio enzimático permite determinar não apenas a presença do próprio patógeno (análise qualitativa), mas também seu conteúdo quantitativo no soro sanguíneo do paciente.

A dose viral ou bacteriana influencia significativamente o curso do processo infeccioso e seu desfecho, portanto a análise quantitativa desempenha um papel importante no diagnóstico e tratamento de doenças nas diversas formas e estágios.

Porém, conhecendo os estudos de imunoensaios enzimáticos como o método ELISA, nem sequer pensamos em como consegue abranger uma gama tão ampla de microrganismos que habitam o nosso planeta, muitos dos quais representam uma ameaça direta à saúde e à vida de humanos e animais. Mas o facto é que o ELISA tem muitas opções (não competitivas e competitivas - directas e indirectas), cada uma das quais resolve o seu problema e, assim, permite uma pesquisa direccionada.

Para identificar imunoglobulinas de uma classe ou de outra, utiliza-se um tradicional painel (placa) de poliestireno de 96 poços, em cujos poços se concentram na fase sólida as proteínas recombinantes sorvidas. Anticorpos ou antígenos que entram no poço com o soro sanguíneo encontram um objeto “familiar” e formam com ele um complexo (AG - AT), que, fixado por um conjugado enzimático, se manifestará por uma mudança na cor do poço quando lendo os resultados.

O imunoensaio enzimático é realizado utilizando sistemas de teste de certa especificidade, fabricados em laboratórios especiais e equipados com todos os componentes reagentes necessários. As pesquisas podem ser realizadas por meio de máquinas de lavar (“lavadoras”) e espectrofotômetros de leitura, que envolvem, em sua maioria, trabalho manual. Em máquinas totalmente automáticas, que libertam o auxiliar de laboratório da monótona instilação, lavagem e outras tarefas rotineiras, é claro, é mais rápido e conveniente trabalhar, mas nem todos os laboratórios podem se dar ao luxo de tal luxo e continuar a trabalhar à moda antiga - em máquinas semiautomáticas.

A interpretação dos resultados do ELISA é da competência do médico de diagnóstico laboratorial, e a propriedade inerente de quase todas as reações imunoquímicas de dar respostas falso-positivas ou falso-negativas também deve ser levada em consideração.

Vídeo: imunoensaio enzimático moderno

Resultados de ELISA usando o exemplo da sífilis

O imunoensaio enzimático é adequado para detectar todas as formas e, além disso, é utilizado em estudos de triagem. Para realizar a análise, utiliza-se o sangue venoso do paciente colhido com o estômago vazio. O trabalho utiliza comprimidos com certa especificidade (classes AB A, M, G) ou anticorpos totais.

Considerando que os anticorpos na sífilis são produzidos em uma sequência específica, o ELISA pode facilmente responder à questão de quando ocorreu a infecção e em que estágio se encontra o processo, e a interpretação dos resultados obtidos pode ser apresentada da seguinte forma:

• IgM indica a duração do processo infeccioso (pode aparecer durante a exacerbação de doenças inflamatórias crônicas);
• IgA afirma que a infecção ocorreu há mais de um mês;
• IgG indica que a infecção está em pleno andamento ou que o tratamento foi realizado recentemente, o que é facilmente determinado pela anamnese.

Ao testar a sífilis, os poços negativos (e o controle negativo) permanecerão incolores, enquanto os poços positivos (e o controle positivo) apresentarão uma cor amarela brilhante devido à mudança de cor do cromogênio adicionado durante o teste. Porém, nem sempre a intensidade da cor coincide com a do controle, ou seja, pode ser um pouco mais pálida ou levemente amarelada. São resultados duvidosos, que, via de regra, são passíveis de reexame com obrigatoriedade de consideração dos indicadores quantitativos obtidos no espectrofotômetro, mas em geral a cor é diretamente proporcional ao número de imunocomplexos (Ags e ATs associados) .

O mais interessante dos imunoensaios enzimáticos é o HIV ELISA

A análise sobre é talvez mais interessante do que outras para uma ampla gama da população, porque ainda é impossível dizer com segurança que muitos problemas sociais desapareceram (prostituição, toxicodependência, etc.). Infelizmente, o VIH não afecta apenas estas camadas da sociedade humana; você pode ser infectado em várias circunstâncias não relacionadas com a imoralidade sexual ou o uso de drogas. Mas se houver necessidade de fazer um teste de HIV, você não deve ter medo de que todos ao seu redor saibam de sua visita a esse laboratório. Agora as pessoas infectadas pelo VIH estão protegidas por lei e aqueles que têm dúvidas podem recorrer a gabinetes anónimos onde podem resolver o problema sem receio de publicidade e condenação.

O método de imunoensaio enzimático utilizado para diagnosticar a infecção pelo HIV é um dos estudos padrão mais importantes, mas requer condições especiais, pois o tema é muito delicado.

Faz sentido realizar o HIV ELISA após contato sexual, transfusão de sangue, outros procedimentos médicos sugestivos de infecção e no final do período de incubação (“janela soronegativa”), mas deve-se ter em mente que este período de tempo não é permanente. Pode terminar em 14 a 30 dias, ou pode durar até seis meses, portanto o valor médio é considerado um intervalo de 45 a 90 dias. O sangue é doado para o HIV da mesma forma que para outras infecções - de uma veia com o estômago vazio. Os resultados ficarão prontos dependendo do acúmulo de material no laboratório e da sua carga de trabalho (de 2 a 10 dias), embora na maioria das vezes os laboratórios respondam no mesmo dia ou no seguinte.

O que você pode esperar dos seus resultados de HIV?

O ELISA para infecção pelo HIV detecta anticorpos para dois tipos de vírus: HIV-1 (mais comum na Rússia e em outros países da Europa e Ásia) e HIV-2 (mais comum na África Ocidental).

A tarefa do ELISA HIV é procurar anticorpos da classe G, que são detectados em todos os sistemas de teste, mas posteriormente, e anticorpos das classes A e M, detectados em kits de teste recombinantes de nova geração, que permitem encontrar anticorpos nos estágios iniciais (período de incubação - “janela soronegativa”). Você pode esperar as seguintes respostas do ELISA:

1. Resultado primário positivo: o sangue deve ser retestado com sistema de teste do mesmo tipo, mas se possível de série diferente e por outra pessoa (auxiliar de laboratório);
2. Repetido (+) envolve uma nova coleta de sangue do paciente com exame semelhante à análise primária;
3. Outro resultado positivo está sujeito a análise de referência, que utiliza kits de teste altamente específicos (2-3 unidades);
4. Um resultado positivo em ambos (ou três) sistemas é enviado para imunotransferência (o mesmo ELISA, mas realizado individualmente utilizando kits de teste de especificidade particularmente elevada).

A conclusão sobre a infecção pelo HIV é feita apenas com base no imunoblotting. A conversa é conduzida com a pessoa infectada em total sigilo. A divulgação de segredos médicos na Rússia, assim como em outros países, está sujeita a punição criminal.

Os testes para clamídia e citomegalovírus pelo método de imunoensaio enzimático também ganharam particular popularidade, por permitirem determinar o momento da infecção, o estágio da doença e a eficácia das medidas de tratamento.

Durante a implementação, pode-se observar também o aparecimento de anticorpos de diversas classes. nas diferentes fases do quadro patológico causado por um agente infeccioso:

• A IgM pode ser detectada sete dias após a infecção;
• IgA indica que a infecção vive no corpo há mais de um mês;
• IgG confirma o diagnóstico de clamídia e ajuda a monitorar o tratamento e determinar sua eficácia. Ressalta-se que os anticorpos da classe G permanecem e circulam no organismo independente da duração da doença, portanto, para interpretar corretamente a análise, é preciso levar em consideração os valores de referência (normas), que, aliás , são diferentes para cada CDL: tendo em conta a marca do sistema de teste e a especificidade dos reagentes incluídos no conjunto. Os valores normais são inseridos no formulário ao lado do resultado do ELISA.

Quanto a , é um pouco diferente aqui: os anticorpos da classe M aparecem após cerca de um mês a um mês e meio, ou seja, o resultado positivo (IgM+) passa a ser na fase de infecção primária ou durante a reativação de uma infecção latente e assim permanece de 4 meses a seis meses.

A presença de anticorpos da classe G é característica do início de uma infecção aguda primária ou reinfecção. A análise afirma que o vírus está presente, mas não informa em que estágio se encontra o processo infeccioso. Entretanto, a determinação do título normal de IgG também causa dificuldades, pois depende inteiramente do estado imunológico de uma determinada pessoa, que, no entanto, é estabelecido pela identificação de imunoglobulinas da classe G. Dado este comportamento dos anticorpos, no diagnóstico do CMV, há necessidade avaliar a capacidade dos anticorpos da classe G interagirem com o CMV, para posteriormente “neutralizá-lo” (avidez de AT). No estágio inicial da doença, o IgG se liga muito mal aos antígenos virais (baixa avidez) e só então começa a apresentar atividade, portanto, podemos falar de um aumento na avidez dos anticorpos.

Podemos falar muito sobre as vantagens do imunoensaio enzimático, pois esse método tem conseguido resolver muitos problemas de diagnóstico utilizando apenas sangue venoso. Não há necessidade de longas esperas, preocupações e problemas na coleta de material para pesquisa. Além disso, os sistemas de teste para ELISA continuam a ser melhorados e não está longe o dia em que o teste dará um resultado 100% confiável.

Vídeo: filme educacional da Universidade Médica Estadual de Moscou que leva seu nome. Sechenov sobre os fundamentos do ELISA

Este relatório apresenta os resultados da determinação de anticorpos contra o HIV no soro sanguíneo de 40.823 pessoas, que incluíram pacientes de clínicas pré-natais, clínicas, hospitais municipais, bem como centros médicos especializados no exame e tratamento de pacientes de risco (viciados em drogas, pacientes com hepatites virais B, C e doenças sexualmente transmissíveis). Os estudos foram realizados em 2005 no laboratório de imunologia do Instituto de Pesquisas em Obstetrícia e Ginecologia. ANTES. Ott RAMS, que tem mais de 15 anos de experiência no uso de métodos ELISA para diagnóstico de diversas doenças infecciosas.

Para o exame inicial das amostras de soro sanguíneo, utilizamos o sistema de teste “CombiBest anti-HIV-1+2” (ZAO “Vector-Best”, Novosibirsk), que detecta anticorpos específicos totais para HIV-1 e HIV-1 no examinaram amostras de soro ou plasma humano 2 (imunoglobulinas classes A, G e M). Neste kit de diagnóstico, proteínas recombinantes do HIV são utilizadas tanto para imobilização em poços de placas quanto na forma de conjugado com peroxidase de rábano. Os resultados da análise sérica foram avaliados de acordo com as recomendações das instruções do sistema de teste: as amostras testadas foram consideradas negativas (não contendo anticorpos para HIV-1 e HIV-2), cuja densidade óptica (DO) no ELISA não excedeu o valor OPcrit.

Na triagem laboratorial, foi obtido resultado ELISA negativo para 40.222 (98,5%) das 40.823 amostras de soro, e 601 (1,5%) das amostras testadas foram consideradas inicialmente positivas. Como resultado da análise repetida de cada um dos 601 soros em duplicatas (dois poços da placa) no dia seguinte, 440 (73,2%) amostras foram determinadas como positivas e 161 (26,8%) foram determinadas como negativas. De acordo com as recomendações do Ministério da Saúde e Desenvolvimento Social, 440 soros positivos para triagem foram congelados e transferidos para estudos confirmatórios adicionais ao consultório e diagnóstico do laboratório de referência do hospital nº 30. SP. Botquina. Esses estudos foram realizados utilizando sistemas de teste de imunoensaio enzimático “EKOlab-Vironostika HIV 1,2 Ag/Ab” (“EKOlab”, Elektrogorsk), “Genscreen Plus” HIV Ag-Ab” (“BioRad”, EUA), bem como kits para imunoblotting. Os resultados da análise de 440 soros em testes confirmatórios levaram à conclusão de que 323 (73,4%) amostras foram positivas e 102 (23,2%) negativas. Para 15 amostras testadas (3,4%), obteve-se resultado analítico indeterminado.

Deve-se notar que os valores de DO obtidos em nosso laboratório durante seus testes iniciais usando o sistema de teste CombiBest anti-HIV-1+2 para 314 (97,2%) destes 323 soros positivos variaram de 0,900 a 1,780, e para 9 (2,8%) amostras – 0,500–0,900. Os valores de DO obtidos na triagem de 102 soros negativos para 52 amostras (51%) variaram de 0,195 a 0,400; para 40 (39,2%) amostras – 0,401–0,800; 10 (9,8%) amostras – mais de 0,800.

Assim, como resultado do trabalho realizado, foi demonstrado que o exame inicial do soro sanguíneo para a presença de marcadores sorológicos de infecção pelo HIV utilizando o sistema de teste CombiBest anti-HIV-1+2 é altamente eficaz. Os resultados positivos da triagem foram confirmados por testes adicionais no laboratório de referência em 73% dos casos, e resultados falso-positivos foram registrados apenas para 0,25% dos 40.823 soros analisados.