Reagimi i hemaglutinimit indirekt ose pasiv (RNHA ose RPHA) është më i ndjeshëm dhe specifik se reaksioni i aglutinimit. Ky reagim përdoret gjithashtu në dy drejtime.

1) Për zbulimin e antitrupave në serumin e gjakut të pacientit përdoren diagnostifikimet e eritrociteve, në të cilat antigjeni absorbohet në sipërfaqen e eritrociteve të trajtuara me taninë. Në lidhje me këtë reagim, termi RPGA përdoret më shpesh.

Serumi i provës hollohet në pusetat e pllakave plastike dhe shtohet diagnostikimi i eritrociteve. Me një reagim pozitiv, një film i hollë shfaqet në muret e pusit në formën e një "ombrellë dantelle", me një reagim negativ, shfaqet një sediment i dendur eritrocitesh në formën e një "butoni".

2) Për zbulimin e toksinave dhe antigjeneve bakteriale në materialin e provës, përdoren diagnostifikimet e eritrociteve të antitrupave, të marra nga adsorbimi i antitrupave në eritrocite. Në lidhje me këtë reagim, termi RNGA përdoret më shpesh. Për shembull, me ndihmën e diagnostikimit të antitrupave, zbulohet antigjeni i bacilit të murtajës, ekzotoksina e difterisë, ekzotoksina botulinum.

Reagimi i Coombs (testi i aptiglobulinës)

Reagimi përdoret për të zbuluar antitrupa jo të plotë, për shembull, antitrupa ndaj faktorit Rh. Serumi i testit u shtohet eritrociteve Rh +, në të cilat pritet prania e antitrupave jo të plotë ndaj faktorit Rh. Të bashkangjitur me eritrocitet, antitrupat jo të plotë nuk shkaktojnë aglutinim, pasi ato kanë vetëm një qendër aktive. Pastaj shtoni serum antiglobulin që përmban antitrupa në globulinat njerëzore. Kur kombinohet me antitrupa jo të plotë, serumi i antiglobulinës shkakton aglutinimin e eritrociteve.

reaksioni i reshjeve

Thelbi i reaksionit është precipitimi (precipitimi) i antigjenit nën veprimin e antitrupave specifikë. Prania e një elektroliti është e nevojshme për të marrë një reagim të dukshëm. Antigjeni në reaksionin e precipitimit janë substanca të shpërndara molekularisht.

Reaksioni i reshjeve të unazës të vendosura në tuba të ngushtë precipitues. Serumi imunitar derdhet në epruvetën dhe materiali i provës vendoset me kujdes mbi të. Në prani të një antigjeni në të, një unazë e errët precipitati formohet në kufirin e dy lëngjeve.

Reaksioni përdoret në mjekësinë ligjore për të përcaktuar llojin e proteinave në njollat ​​e gjakut, në spermë etj.; për të përcaktuar antigjenin në diagnostikimin e antraksit (reaksioni Ascoli), meningjitit dhe infeksioneve të tjera; në studimet sanitare dhe higjienike - për të vendosur falsifikimin e produkteve ushqimore. Serumet precipituese imune fitohen duke imunizuar kafshët me antigjenin e duhur. Për shembull, proteina njerëzore që precipiton në serum merret duke imunizuar një lepur me proteina njerëzore. Titri i serumit precipitues është hollimi më i lartë i antigjenit me të cilin ai reagon. Serumi zakonisht përdoret i paholluar ose i holluar 1:5.

Reagimi i precipitimit të xhelit të agarit kryhet në disa mënyra. Ky është një reaksion imunodifuzioni i dyfishtë, një reaksion imunodifuzioni radial, një reaksion imunoelektroforeze.

Reagimi i imunodifuzionit të dyfishtë(sipas Ouchterlony). Xheli i shkrirë i agarit derdhet në një enë Petri dhe, pas ngurtësimit, në të priten puse. Në disa puse vendoset antigjeni, në të tjera serumet imune, të cilat shpërndahen në agar, formojnë një precipitat në formën e vijave të bardha në pikën e takimit.

Reagimi i imunodifuzionit radial(sipas Mancinit). Serumi imunitar shtohet në xhelin e shkrirë të agarit, i derdhur në një pjatë. Pasi agari të ngurtësohet, në të priten puse dhe në to vendosen antigjene, të cilat, duke u shpërndarë në agar, formojnë zona unazor të reshjeve rreth puseve. Sa më i lartë të jetë përqendrimi i antigjenit, aq më i madh është diametri i unazës. Reagimi përdoret, për shembull, për të përcaktuar klasa të ndryshme të imunoglobulinave në gjak. Imunoglobulinat e klasave IgG, IgM, IgA veprojnë si antigjene në këtë reaksion, dhe antitrupat kundër tyre përmbahen në serumet specifike të monoreceptorëve.

Imunoelektroforeza. Elektroforeza e antigjeneve proteinike kryhet në xhel agar. Serumi precipitues futet në brazdë, e cila shkon paralelisht me drejtimin e lëvizjes së proteinave. Antigjenet dhe antitrupat shpërndahen në agar dhe linjat e reshjeve formohen në pikën e takimit të tyre.

Reaksionet e lizës imune

Një antigjen (eritrocitet ose bakteret), duke u kombinuar me antitrupa specifikë, formon një kompleks imunitar, të cilit i bashkohet komplementi (C1) dhe aktivizimi i komplementit ndodh përgjatë rrugës klasike. Komplementi i aktivizuar lizon qelizat e kuqe të gjakut (hemoliza) ose bakteret (bakteroliza). Reaksioni i bakterolizës përdoret për të identifikuar Vibrio cholerae.

reaksioni i hemolizës. Antigjeni në reaksion janë eritrocitet, antitrupat (hemolizinat) përmbahen në serumin hemolitik. Hemolizinat ngjiten me eritrocitet, ndodh aktivizimi i komplementit, i cili lizon eritrocitet. Një pezullim i turbullt i eritrociteve shndërrohet në një lëng transparent të kuq të ndezur - "gjak llak". Meqenëse reaksioni i hemolizës ndodh vetëm në prani të komplementit, ai përdoret si një tregues për zbulimin e komplementit.

Reagimi lokal i hemolizës në xhel(Reagimi Jerne) - një variant i reaksionit të hemolizës. Shërben për të përcaktuar numrin e qelizave që formojnë antitrupa (AFC) në shpretkë dhe nyjet limfatike.

Xheli i shkrirë i agarit përzihet me një pezullim të qelizave të shpretkës dhe eritrociteve dhe pasi agari të jetë ngurtësuar, shtohet komplementi. Rreth çdo qelize që prodhon hemolizina, formohet një zonë hemolize. Numri i zonave të tilla përcakton numrin e qelizave që prodhojnë hemolizina.

Reagimi i hemaglutinimit indirekt (RIHA)

Përdorimi i preparateve diagnostikuese të adsorbuara bazohet në parimin e njohjes imunologjike të strukturave sipërfaqësore që zbatohet vazhdimisht në natyrë. Nga ky këndvështrim, nuk ka dallime thelbësore midis përdorimit, për shembull, të një qelize mikrobiale ose të një transportuesi artificial të ngarkuar me antigjen (antitrupa). Si bazë e preparateve të sorbuara përdoren bartës të ndryshëm - qelizat mikrobike, eritrocitet, lateksi, bentonina, kolesteroli, sefadeksi, dermatoli, karboni i aktivizuar, spore mykotike etj.

Pas punës së A.T. Kravchenko (1945), eritrocitet e privuar nga qëndrueshmëria dhe të fiksuara me reagentë të ndryshëm kimikë u përdorën më gjerësisht si bartës të antigjenit ose antitrupave. Në parimin e përdorimit të eritrociteve (të dyja amtare dhe fikse) si bartës të antigjenit, reagimi i hemaglutinimit indirekt (pasiv) është bërë i përhapur.

Sugjerimi për të përdorur reaksionin indirekt të hemaglutinimit (IHA) për qëllime diagnostikuese u ngrit në bazë të njohurive të zhvilluara më parë për aktivitetin e lartë të absorbimit të eritrociteve. Në krahasim me shumë bartës të tjerë të antigjeneve dhe antitrupave, eritrocitet kanë disa avantazhe në reagimin e hemaglutinimit indirekt. Së pari, në tretësirat e kripura izotonike, ato formojnë një kohezion mjaft të qëndrueshëm dhe nuk vendosen në një kohë të shkurtër. Së dyti, qelizat e kuqe të gjakut të të njëjtës specie të kafshëve janë të njëjta në madhësi. Dhe, së fundi, eritrocitet relativisht lehtësisht drejtpërdrejt ose si rezultat i përpunimit të veçantë bashkojnë përbërës të ndryshëm serologjikisht aktivë.

Krijimi i diagnozave të eritrociteve nga eritrocitet e stabilizuara bën të mundur tejkalimin e vështirësive që dalin gjatë përdorimit të eritrociteve amtare.

Në studimin e eritrociteve të trajtuara me fiksues të ndryshëm, u vërtetuan disa nga vetitë e tyre të përbashkëta:

Në morfologji, ato praktikisht nuk ndryshojnë nga ato të freskëta;

Nuk hemolizohet në tretësirat hipotonike, në ujë dhe pas ngrirje-shkrirjes;

Mund të thahet në ngrirje;

Strukturat e tyre sipërfaqësore ruajnë aftësinë për t'u modifikuar kimikisht (p.sh. tanina, komponimet diazo) dhe të reagojnë me antigjenet dhe antitrupat.

Kriteri kryesor për cilësinë e eritrociteve fikse është mundësia e përdorimit të tyre për marrjen e preparateve të sensibilizuara në mungesë të aglutinimit jospecifik në lëngjet stabilizuese.

Përgatitja e sipërfaqes së eritrociteve në mënyrë që të rritet kapaciteti absorbues për antigjenet është i rëndësishëm në hartimin e preparateve diagnostikuese. Veçanërisht i përhapur është trajtimi i eritrociteve me taninë.

Nën ndikimin e tij, ndryshojnë vetitë antigjenike të eritrociteve (përshkueshmëria, shkalla e sedimentimit), rritet rezistenca e tyre ndaj efekteve hemolitike të disa acideve yndyrore. Sidoqoftë, gjëja kryesore është arritur - eritrocitet e tanizuara kanë një kapacitet absorbues dukshëm më të lartë të proteinave, i cili aktualisht përdoret gjerësisht në prodhimin e diagnozave antigjenike dhe antitrupave me cilësi të lartë.

Së bashku me tanizimin e eritrociteve, për prodhimin e diagnostifikimit të eritrociteve dhe përgatitjen e një bartësi të antigjenit, përdoren reagentë kimikë si bromelaina, triopsina dhe periodati i kaliumit, të cilët gjithashtu modifikojnë membranat e eritrociteve.

Pas përgatitjes së sipërfaqes së eritrociteve, zhvillohet procesi më i rëndësishëm - procesi i hemosensitizimit - faza përfundimtare në prodhimin e diagnostifikimit të eritrociteve.

Për të forcuar lidhjen midis bartësit dhe antigjenit, përdoren substanca të ndryshme konjuguese - bisdiazobenzidine, difluorodinitrobenzine, klorur cianidi, klorur kadmiumi dhe acid acetik, klorur bromi, formaldehid, glutaraldehid, bromid cianogjen, rivanol, etj.

Përdorimi i substancave konjuguese ndihmon në eliminimin e mangësive që kanë eritrocitet e tanizuara të përdorura për sensibilizimin pa substanca konjuguese.

Substancat konjuguese më të përdorura janë kloruri i kromit, glutaraldehidi, diazoli i zi C dhe amidol. Procesi i sensibilizimit me ndihmën e klorurit të kromit ndodh shumë shpejt - nga 4 deri në 10 minuta, gjë që tërheq vëmendjen e studiuesve. Në këtë rast përdoren përqendrimet e klorurit të kromit nga 0,05 në 2%, pH nuk është më i ulët se 5,0 në një temperaturë të përzierjes së reaksionit 20-250 C. Në procesin e sensibilizimit me klorurin e kromit, grupet karboksil të proteinave të membranës së eritrociteve janë aktivizuar. Si rezultat, formohet një lidhje kovalente midis membranës së eritrociteve dhe sensitinës.

Reagimi i hemaglutinimit indirekt ka një specifikë të lartë, pasi aglutinimi i eritrociteve ndodh si rezultat i ndërveprimit të antigjenit me antitrupat e përthithur në eritrocite. Karakteristika e tij dalluese është ndjeshmëria e lartë: në të zbulohen 0,02-0,05 μg proteinë antitrupash. Përsa i përket ndjeshmërisë, ai tejkalon ndjeshëm reaksionet e imunodifuzionit, imunofluoreshencës, imunodifuzionit radial, fiksimit të komplementit dhe neutralizimit. RNGA është më pak e ndjeshme se metodat e radioimunoelektroforezës, përcaktimi i sasisë së proteinave të antitrupave radioaktivë në analizën imunosorbente, enzimë.

Përparësitë e RNGA përfshijnë riprodhueshmëri mjaft të lartë, lehtësinë e zbatimit dhe nevojën për sasi minimale përbërësish, veçanërisht kur përdoret mikrometoda.

Vitet e fundit, RNHA ka gjetur aplikim të gjerë në diagnostikimin e rinotrakeitit infektiv, diarresë, infeksionit adenovirus, infeksionit rota dhe koronavirus, parainfluenza-3 dhe infeksionit respirator sincicial.

Ne japim një shembull të prodhimit dhe përdorimit të një diagnostifikimi të eritrociteve për zbulimin e antitrupave ndaj infeksioneve rota dhe koronavirus.

Metoda e përgatitjes së diagnostifikimit të antitrupave për zbulimin e antigjeneve rota- dhe koronavirus në RNGA është si më poshtë: marrja e një pezullimi të eritrociteve; fiksimi i akroleinave të tyre; tanizimi, i cili lejon marrjen e thithjes së qëndrueshme të proteinës së kërkuar në eritrocite; sensibilizimi i eritrociteve të tanizuara me imunoglobulina; përcaktimi i specifikës së diagnozës së përgatitur. Përgatitja e një pezullimi të eritrociteve kryhet duke marrë gjakun e një dash klinikisht të shëndetshëm në një balonë me rruaza qelqi. Pas defibrimit të gjakut, eritrocitet duhet të lahen 3-5 herë me tretësirë ​​izotonike (0,9%) klorur natriumi me centrifugim për 15-20 minuta në 400g.

Për të stabilizuar qelizat e kuqe të gjakut, ato trajtohen me akroleinë. Siç e dini, veprimi i tij është disi më i butë se formaldehidi dhe siguron stabilitet dhe aktivitet më të lartë të eritrociteve. Për këtë, vëllime të barabarta të një suspensioni 10% të eritrociteve përzihen me një solucion 0.2% të akroleinës të përgatitur në tretësirë ​​tampon fosfati (PBS) me një pH prej 7.2. Suspensioni që rezulton mbahet për 30 minuta në 37°C, duke u përzier plotësisht, i ndjekur nga çlirimi i akroleinës me centrifugim të përsëritur për 5 minuta në 600-800 g derisa aroma specifike të zhduket plotësisht. Avantazhi i eritrociteve të përgatitura në këtë mënyrë është se ato mblidhen për të ardhmen, mund të ruhen për një kohë të gjatë pa iu nënshtruar hemolizës.

Më pas, eritrocitet e stabilizuara në një përqendrim 10% mbahen në 2-4 °C në PBS me një pH prej 7.2 për dy muaj.

Për të rritur kapacitetin absorbues dhe sedimentimin e eritrociteve, është e nevojshme që ato të tanizohen duke përzier pjesë të barabarta të një suspensioni 10% të eritrociteve të lara dhe një tretësirë ​​tanine në PBS dhe pH 7.2 në një hollim 1:30,000. Përzierja përzihet mirë dhe mbahet në 370 C për 15 minuta, pas së cilës eritrocitet lahen mirë nga tanina dy herë në PBS me pH 7,2 dhe tre herë me tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit me pH 7,2-7,4.

Koha optimale për të garantuar marrjen e diagnozave të eritrociteve cilësore është sensibilizimi i tyre brenda 24-48 orëve pas trajtimit të tyre me taninë.

Në procesin e bërjes së diagnostifikimit, si tretës dhe ruajtës përdoret 0,3% solucion izotonik i klorur natriumi i fenolizuar me 0,1% serum normal lepuri ose kali, i inaktivuar më parë në 56°C për 30 minuta dhe i përthithur nga eritrocitet normale të deleve.37°C. për 30 min.

Sensibilizimi i eritrociteve të tanizuar duhet të kryhet me serum hiperimun, përkatësisht, kundër rota- dhe koronaviruseve të gjedhit (prodhuar në Institutin Kërkimor Gjith-Rus të Mjekësisë Veterinare Eksperimentale Ya.R. Kovalenko). Në të njëjtën kohë, doza sensibilizuese (përqendrimi i proteinave) të serumit imunitar anti-rotavirus është 280 μg/ml dhe ajo e serumit imunitar ndaj koronavirusit është 260 μg/ml.

Sensibilizimi kryhet duke përzier vëllime të barabarta të eritrociteve të tanizuara dhe serumit imunitar të parangrohur për 30 minuta në 560C në përqendrim optimal. Përveç kësaj, shtohen 3 pjesë të një solucioni izotonik të klorurit të natriumit me një pH prej 7.2 dhe 5 pjesë të një zgjidhjeje 0.1% të klorurit të kromit. Përzierja, duke e përzier herë pas here, mbahet në temperaturën e dhomës për 5 minuta. Pas kohës së specifikuar, përzierja lahet tërësisht duke përdorur PBS me një pH 7.2 dhe më pas diagnostifikimi i eritrociteve të përgatitura risuspendohet në një konservues në një përqendrim 1%. Diagnostifikimi i përgatitur ruan cilësitë e tij bazë për 8 muaj, nëse ruhet në 4°C.

Në të gjitha fazat e prodhimit të diagnozës, monitorohet vetë-aglutinimi. Specifikimi i diagnozës së përgatitur përcaktohet nga stadifikimi i RNGA, ku si antigjenë janë përdorur diagnozat standarde të viruseve RTI, PG-3, adenoviruseve, diarresë virale, si dhe antigjeneve rota dhe koronavirus.

Gjatë vendosjes së RNHA, përgatiten hollime të dyfishta serike të materialit që përmban virusin e studiuar (20-50% pezullim i mostrave fekale) dhe më pas çdo pus shtohet një vëllim i barabartë i eritrociteve diagnosticum. Pllakat duhet të tunden mirë disa herë, të lihen në temperaturën e dhomës derisa eritrocitet të vendosen plotësisht në kontroll. Një tregues i një reaksioni pozitiv është aglutinimi i diagnozës së eritrociteve me një intensitet aglutinimi 2+ në një titër 1:4 dhe më lart.

Reagimi i hemaglutinimit indirekt ose pasiv (IPHA)

Ky reaksion është më i ndjeshëm se reaksioni i aglutinimit dhe përdoret në diagnostikimin e infeksioneve të shkaktuara nga bakteret, rikecitë, protozoarët dhe mikroorganizmat e tjerë.

RPGA ju lejon të zbuloni një përqendrim të vogël të antitrupave.

Ky reagim përfshin eritrocite dele të tannizuara ose eritrocite të njeriut me gjak të grupit I, të sensibilizuar me antigjene ose antitrupa.

Nëse në serumin e testimit zbulohen antitrupa, atëherë përdoren eritrocite të sensibilizuara me antigjene (erythrocyte diagnosticum).

Në disa raste, nëse është e nevojshme të përcaktohen antigjene të ndryshme në materialin e testimit, përdoren eritrocite të sensibilizuara me imunoglobulina.

Rezultatet e RPHA merren parasysh nga natyra e sedimentit të eritrociteve.

Rezultati i reagimit konsiderohet pozitiv, në të cilin eritrocitet mbulojnë në mënyrë të barabartë të gjithë pjesën e poshtme të epruvetës (një ombrellë e përmbysur).

Me një reagim negativ, eritrocitet në formën e një disku (butoni) të vogël ndodhen në qendër të pjesës së poshtme të epruvetës.

Reaksioni i aglutinimit (RA)

Për shkak të specifikës, lehtësisë së vendosjes dhe demonstrueshmërisë, reaksioni i aglutinimit është bërë i përhapur në praktikën mikrobiologjike për diagnostikimin e shumë sëmundjeve infektive: ethe tifoide dhe paratifoide (reaksioni Vidal), tifoja (reaksioni Weigl), etj.

Reaksioni i aglutinimit bazohet në specifikën e ndërveprimit të antitrupave (aglutininave) me qeliza të plota mikrobike ose të tjera (aglutinogens). Si rezultat i këtij ndërveprimi, formohen grimca - aglomerate që precipitojnë (aglutinojnë).

Në reaksionin e aglutinimit mund të marrin pjesë si bakteret e gjalla ashtu edhe ato të vdekura, spiroketat, kërpudhat, protozoarët, rikecia, si dhe eritrocitet dhe qelizat e tjera.

Reagimi zhvillohet në dy faza: e para (e padukshme) është specifike, lidhja e antigjenit dhe antitrupave, e dyta (e dukshme) është jospecifike, lidhja e antigjeneve, d.m.th. formimi i aglutinimit.

Aglutinati formohet kur një qendër aktive e një antitrupi bivalent kombinohet me grupin përcaktues të antigjenit.

Reaksioni i aglutinimit, si çdo reaksion serologjik, zhvillohet në prani të elektroliteve.

Nga jashtë, manifestimi i një reaksioni pozitiv të aglutinimit është i dyfishtë. Në mikrobet pa flagjelë, të cilët kanë vetëm O-antigjen somatik, vetë qelizat mikrobike ngjiten së bashku drejtpërdrejt. Një aglutinim i tillë quhet i imët. Ndodh brenda 18-22 orëve.

Mikrobet flagelare kanë dy antigjene - antigjenin O somatik dhe antigjenin H flagjelar. Nëse qelizat ngjiten së bashku me flagjelat, formohen thekon të mëdha të lirshme dhe një reaksion i tillë aglutinimi quhet i trashë. Vjen brenda 2-4 orësh.

Reaksioni i aglutinimit mund të vendoset si për qëllimin e përcaktimit cilësor dhe sasior të antitrupave specifikë në serumin e gjakut të pacientit, ashtu edhe për qëllimin e përcaktimit të llojit të patogjenit të izoluar. hemaglutinimi mikrobiologjik infektiv

Reaksioni i aglutinimit mund të vendoset si në një version të detajuar, i cili lejon punën me serum të holluar në një titër diagnostikues, ashtu edhe në variantin e vendosjes së një reaksioni orientues, i cili lejon, në parim, zbulimin e antitrupave specifikë ose përcaktimin e specieve të patogjen.

Reagimi kryhet për të zbuluar antigjenet e patogjenëve në materialin e provës duke shtuar serum imunitar në të. Në prani të një antigjeni homolog ndodh lidhja e antitrupave, prandaj pas shtimit të eritrociteve të sensibilizuara nga antigjeni nuk ndodh aglutinimi i tyre, gjë që vlerësohet si rezultat pozitiv. Për ndjeshmëri më të madhe të reaksionit, materialit testues i shtohet serum specifik imunitar në një sasi minimale (2 njësi hemaglutinimi). Titri i serumit imunitar përcaktohet më parë duke përdorur RNGA. Për një njësi hemaglutinuese, merret hollimi kufizues i serumit, i cili shkakton aglutinimin e eritrociteve.

Metodologjia. 0,025 ml tretësirë ​​1% të serumit normal të lepurit shtohet në pusetat e pllakave të polistirenit ose tubave të aglutinimit dhe bëhen hollime serike 2-fish të materialit të provës. Më pas, në të gjitha pusetat shtohen 0,025 ml serum imunitar, pjata tundet dhe lihet për 30 minuta në temperaturën 37ºС ose për 1 orë në temperaturën e dhomës. Më tej, në të gjitha pusetat shtohet 0,025 ml diagnostik antigjenik, tundet dhe lihet për 2 orë, pas së cilës merren parasysh rezultatet.

Gjatë kryerjes së këtij reaksioni, një kontroll i specifikës së serumit imunitar i shtohet kontrollit për RNGA, i përbërë nga një antigjen specifik, serumi imunitar (2, 1, 0.5 njësi hemaglutinuese) dhe një pezullim i eritrociteve të sensibilizuara.

RTNGA përdoret gjithashtu për të zbuluar antitrupa specifikë (të plotë dhe bllokues), për të cilët një sasi e dozuar e antigjenit shtohet në serumin e testimit. Nëse përmban antitrupa, atëherë ato lidhen nga një antigjen, prandaj, pas shtimit të eritrociteve të sensibilizuara me antitrupa (faza e dytë e RTNHA), eritrocitet nuk ngjiten së bashku.

Për shkak të përdorimit të një sasie minimale të antigjenit (2 doza neutralizuese), reagimi është shumë i ndjeshëm. Numri i dozave neutralizuese në preparatin antigjenik përcaktohet duke përdorur RNGA, ndërsa hollimet serike 2-fish të antigjenit bëhen në një tretësirë ​​1% të serumit normal të lepurit dhe në puset shtohet një diagnostifikim i eritrociteve me antitrupa. Doza neutralizuese e antigjenit është hollimi maksimal i tij, i cili jep ngjitje të plotë të eritrociteve të sensibilizuara.

Para reaksionit, serumet e testimit hollohen 1:5-1:10 dhe inaktivizohen në temperaturën 56°C për 30 minuta. Për adsorbimin e hemagglutininave, një suspension 50% i eritrociteve të deleve të formalizuara ose të sapo lara i shtohet serumit në masën 0.1 ml suspension për 1 ml serum të holluar. Përzierja tundet dhe inkubohet për 30 minuta në 37°C ose 1 orë në temperaturën e dhomës, pas së cilës eritrocitet precipitohen me centrifugim. Serumin mund ta lini në frigorifer deri të nesërmen për precipitimin e eritrociteve.

Gjatë eksperimentit, materiali i provës hollohet në solucion 1% të serumit normal të lepurit në një vëllim prej 0,025 ml në pusetat e panelit të mikrotitrit. Më pas, në çdo pus shtohen 2 doza neutralizuese të antigjenit në një vëllim prej 0,025 ml. Pllakat tunden dhe lihen 30 minuta në 37°C ose 1 orë në temperaturën e dhomës. Më pas, në të gjitha puset shtohen 0,025 ml antitrupa eritrocite diagnosticum. Pllakat tunden dhe inkubohen për 1,5-2 orë në temperaturën e dhomës, pas së cilës merren parasysh rezultatet e reagimit. Kontabiliteti mund të bëhet edhe të nesërmen. Titri i serumit të studiuar konsiderohet të jetë hollimi maksimal i tij, në të cilin eritrocitet nuk ngjiten së bashku.

Përvoja shoqërohet nga llojet e mëposhtme të kontrollit:

1) stabiliteti i eritrociteve të sensibilizuar (eritrocitet + 1% zgjidhje e serumit normal të lepurit);

2) plotësia e pakësimit të hemaglutininave në çdo serum testues (serumi i testimit në hollimin më të vogël + eritrocite të formalizuara);

3) korrektësia e përcaktimit të dozës minimale neutralizuese të antigjenit (2, 1 dhe 0.5 e dozës neutralizuese të antigjenit + antitrupa eritrocite diagnosticum).

Hemaglutinimi indirekt i kundërt (rong) përdoret për të treguar antigjenet bakteriale dhe virale në materialet e testimit, si dhe për diagnostikimin e shprehur të një numri infeksionesh.

Në ndryshim nga RNHA, në këtë reaksion, eritrocitet nuk sensibilizohen nga një antigjen, por nga antitrupat, aglutinimi i të cilave ndodh kur shtohet antigjeni.

Eritrocitet fiksohen paraprakisht me formalinë ose glutaraldehid dhe më pas lidhen me gama globulinën, e cila izolohet nga serumet imune dhe pastrohet nga proteinat e tjera të serumit. Lidhja e gama globulinës në sipërfaqen e eritrociteve ndodh me ndihmën e klorurit të kromit. Për ta bërë këtë, 1 vëllim imunoglobulinash të izoluara nga serumi imunitar, 1 vëllim suspension 50% të eritrociteve të formalizuara dhe 1 vëllim 0.1-0.2% tretësirë ​​të klorurit të kromit shtohen në 8 vëllime ujë të distiluar. Përzierja lihet 10-15 minuta në temperaturë ambienti, më pas eritrocitet trajtohen si në reaksion hemaglutinimi pasiv.

Specifikimi i diagnostifikimit të antitrupave kontrollohet në reagimin e frenimit të hemaglutinimit pasiv me një antigjen homolog. Reaksioni duhet të frenohet nga një antigjen homolog të paktën 16 herë dhe jo të frenohet nga një heterolog. Përdorni kontrollin për mungesën e hemaglutinimit spontan.

Me ndihmën e këtij reagimi, patogjenët tregohen në materialin e marrë nga organet e njerëzve dhe kafshëve të vdekura, për shembull, nga truri, shpretka, mëlçia e mushkërive. Përgatitni një suspension prej 10% të këtyre organeve në tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit, centrifugojini për 30-60 minuta në 10,000 rpm dhe përdorni supernatantin si antigjen.

Metodologjia. Përgatitni hollime 2-fish të materialit testues (antigjenit) në një tretësirë ​​stabilizuese. Bëni 1 pikë të çdo hollimi të antigjenit në 3 puse ngjitur të mikrogrumbullës (reaksioni merr 3 rreshta paralele të puseve). 1 pikë tretësirë ​​stabilizuese i shtohet çdo pusi të rreshtit të parë, 1 pikë serum imun homolog në një hollim 1:10 shtohet në puset e rreshtit të dytë, 1 pikë serum imunitar heterolog shtohet në puset e rreshtin e tretë. Rreshtat e dytë dhe të tretë shërbejnë si kontrolle për specifikën e reaksionit. Përzierja lihet për 20 minuta në temperaturën e dhomës.

Shtoni 1 pikë suspensioni 1% të eritrociteve të sensibilizuara (diagnosticum antitrupash eritrocitare) në të gjitha pusetat dhe shkundni plotësisht pllakat. Rezultatet e reagimit merren parasysh pas 30-40 minutash. Në prani të një antigjeni specifik, hemaglutinimi vihet re në rreshtin e parë dhe të tretë (me serum heterolog) dhe mungon në rreshtin e dytë, ku antigjeni është neutralizuar më parë me serum homolog.

Reagimi shoqërohet me kontrolle të eritrociteve të sensibilizuara për aglutinim spontan.

Reaksioni i kundërt i frenimit të hemaglutinimit indirekt (RTONGA) ju lejon të përcaktoni praninë e antitrupave në serumet e njerëzve dhe kafshëve.

Metodologjia. Serumet hollohen 10 herë me solucion izotonik të klorurit të natriumit, nxehen për 20 minuta në një temperaturë prej 65 ° C për të shkatërruar frenuesit jospecifik, dhe më pas përgatiten hollime 2-fish të serumeve në një tretësirë ​​stabilizuese dhe një dozë pune të antigjenit që përmban 4 njësi aglutinuese. Bëni 1 pikë nga çdo hollim serumi në pusetat e mikropanelit dhe shtoni 1 pikë antigjen në to, hollimi i të cilit korrespondon me dozën e punës. Pasi përbërësit e përzierjes kanë qenë në kontakt për 20 minuta në temperaturën e dhomës, 1 pikë antitrupi eritrocitor diagnosticum shtohet në të gjitha pusetat dhe tundet tërësisht. Pas 1,5-2 orësh inkubimi në temperaturën e dhomës, rezultatet e reaksionit merren parasysh me hemaglutinim. Titri i serumit është hollimi më i lartë i tij, i cili frenon plotësisht reaksionin e hemaglutinimit me katër njësi aglutinuese të antigjenit.

Reaksioni shoqërohet me kontrolle të eritrociteve të sensibilizuara për aglutinim spontan në prani të: a) një solucioni stabilizues; b) antigjen normal (nga një material që nuk përmban virus); c) serumin e testimit. Avantazhi i reaksionit qëndron në shkathtësinë e tij dhe mundësinë e përdorimit të tij për të zbuluar antigjene të ndryshme.

Vlerësimi i rezultateve të hemaglutinimit. Rezultatet e RNGA, RONGA dhe RTONGA merren parasysh sipas shkallës së aglutinimit të eritrociteve: (++++) - aglutinim i plotë; (+++) - aglutinim më pak i plotë; (++) - aglutinim i pjesshëm; (+) - gjurmët e aglutinimit; (–) – mungesa e aglutinimit.

Reagimi konsiderohet pozitiv nëse aglutinimi është i plotë (++++) ose pothuajse i plotë (+++), diagnoza nuk aglutinohet spontanisht në prani të secilit komponent të reaksionit dhe kontrolli i specifikës së antigjenit ose antitrupave është pozitiv. .

Këto reagimet thirrur indirekte (pasive), meqenëse përdorin Ag (ose AT) të sorbuar artificialisht në sipërfaqen e grimcave të ndryshme korpuskulare.

Reagimi i hemaglutinimit indirekt ose pasiv (RNGA, RPGA) është një nga reaksionet serologjike më të ndjeshme. Ai bazohet në aftësinë e AT për të bashkëvepruar me Ag të fiksuar në eritrocite të ndryshme, të cilat në të njëjtën kohë aglutinohen. Për stabilitet më të madh të diagnozës, eritrocitet formalizohen.

RNGA e kundërt përdoret për të zbuluar antigjenin në serumin e gjakut; per kete ne eritrocite fiksohen jo Ag, por AT. Reaksionet e këtij lloji përdoren gjerësisht për diagnostikimin e sëmundjeve infektive, vendosjen e shtatzënisë, zbulimin e mbindjeshmërisë ndaj barnave, etj.

Reaksioni pasiv i frenimit të hemaglutinimit (RTPGA) - zhvillimi i mëtejshëm RNGA; në një farë kuptimi kontrollon specifikën e tij. Ndryshe nga RNGA, përfshin tre komponentë; Ag, AT dhe Ag (AT) të absorbuara në eritrocite. Fillimisht Ag reagon me AT (antiserum standard), më pas përzierjes i shtohen eritrocitet e sensibilizuara me të njëjtin Ag (ose AT). Nëse, gjatë ndërveprimit të Ag me AT, AT (ose Ag) e lirë nuk mbetet në sistem, atëherë aglutinimi i diagnostikimit të eritrociteve nuk vërehet.