Metodat e hulumtimit virologjik— metodat për studimin e biologjisë së viruseve dhe identifikimin e tyre. Në virologji, metodat e biologjisë molekulare përdoren gjerësisht, me ndihmën e të cilave u bë e mundur të vendoset struktura molekulare e grimcave virale, metodat e depërtimit të tyre në qelizë dhe tiparet e riprodhimit viral, struktura primare e acideve nukleike virale dhe proteinave. Janë duke u zhvilluar metoda për të përcaktuar sekuencën e elementeve përbërës të acideve nukleike virale dhe aminoacideve proteinike. Bëhet e mundur lidhja e funksioneve të acideve nukleike dhe proteinave që ato kodojnë me sekuencën nukleotide dhe për të përcaktuar shkaqet e proceseve ndërqelizore që luajnë një rol të rëndësishëm në patogjenezën e infeksionit viral.

Metodat e hulumtimit virologjik bazohen gjithashtu në proceset imunologjike (ndërveprimi i antigjenit me antitrupat), vetitë biologjike të virusit (aftësia për hemaglutinim, hemolizë, aktiviteti enzimatik), tiparet e ndërveprimit të virusit me qelizën pritëse (natyra e efektit citopatik , formimi i inkluzioneve ndërqelizore etj.) .

Në diagnostikimin e infeksioneve virale, në kultivimin, izolimin dhe identifikimin e viruseve, si dhe në prodhimin e preparateve të vaksinës, përdoret gjerësisht metoda e kulturës së indeve dhe qelizave. Përdoren kultura qelizore primare, sekondare, të qëndrueshme të vazhdueshme dhe diploide. Kulturat primare fitohen duke shpërndarë indin me enzima proteolitike (tripsinë, kolagjenazë). Burimi i qelizave mund të jenë indet dhe organet (zakonisht veshkat) të embrioneve njerëzore dhe shtazore. Një suspension qelizash në një mjedis ushqyes vendoset në të ashtuquajturat dyshekë, shishe ose enë Petri, ku pas ngjitjes në sipërfaqen e enës, qelizat fillojnë të shumohen. Për infeksionin e virusit, zakonisht përdoret një shtresë e vetme qelizore. Lëngu ushqyes kullohet, suspensioni viral shtohet në hollime të caktuara dhe pas kontaktit me qelizat shtohet lëndë ushqyese e freskët, zakonisht pa serum.

Qelizat e shumicës së kulturave parësore mund të nënkulturohen; një kulturë e tillë quhet kulturë dytësore. Me kalimin e mëtejshëm të qelizave, formohet një popullatë qelizash të ngjashme me fibroblastet, të afta për riprodhim të shpejtë, shumica e të cilave ruajnë grupin origjinal të kromozomeve. Këto janë të ashtuquajturat qeliza diploide. Me kultivimin serial të qelizave, fitohen kultura qelizore të vazhdueshme të qëndrueshme. Gjatë kalimeve, shfaqen qeliza homogjene që ndahen me shpejtësi me një grup kromozomesh heteroploid. Linjat qelizore të qëndrueshme mund të jenë me një shtresë ose pezullim. Kulturat me një shtresë rriten në formën e një shtrese të vazhdueshme në sipërfaqen e qelqit, ndërsa kulturat e pezullimit rriten në formën e pezullimeve në enë të ndryshme duke përdorur pajisje përzierëse. Ekzistojnë më shumë se 400 linja qelizore që rrjedhin nga 40 lloje të ndryshme të kafshëve (përfshirë primatët, zogjtë, zvarranikët, amfibët, peshqit, insektet) dhe njerëzit.

Pjesët e organeve dhe indeve individuale (kulturat e organeve) mund të kultivohen në mjedise ushqyese artificiale. Këto lloj kulturash ruajnë strukturën e indeve, e cila është veçanërisht e rëndësishme për izolimin dhe kalimin e viruseve që nuk riprodhohen në kulturat indore të padiferencuara (për shembull, koronaviruset).

Në kulturat e qelizave të infektuara, viruset mund të zbulohen nga ndryshimet në morfologjinë e qelizave, efektet citopatike, të cilat mund të jenë specifike, shfaqja e inkluzioneve, duke përcaktuar antigjenet virale në qelizë dhe në lëngun e kulturës; vendosja e vetive biologjike të pasardhësve viralë në lëngun e kulturës dhe titrimi i viruseve në kulturën e indeve, embrionet e pulave ose kafshët e ndjeshme; duke identifikuar acidet nukleike virale individuale në qeliza me hibridizimin molekular ose akumulimet e acideve nukleike me metodën citokimike duke përdorur mikroskopin fluoreshente.

Izolimi i viruseve është një proces që kërkon punë dhe kërkon kohë. Ajo kryhet për të përcaktuar llojin ose variantin e virusit që qarkullon midis popullatës (për shembull, për të identifikuar një serovarian të virusit të gripit, një lloj të egër ose vaksinë të virusit të poliomielitit, etj.); në rastet kur është e nevojshme të kryhen masa urgjente epidemiologjike; kur shfaqen lloje ose variante të reja virusesh; nëse është e nevojshme, konfirmoni diagnozën paraprake; për tregues të viruseve në objektet mjedisore. Gjatë izolimit të viruseve, merret parasysh mundësia e qëndrueshmërisë së tyre në trupin e njeriut, si dhe shfaqja e një infeksioni të përzier të shkaktuar nga dy ose më shumë viruse. Një popullatë gjenetikisht homogjene e virusit e marrë nga një virion quhet klon viral dhe procesi i marrjes së tij quhet klonim.

Për të izoluar viruset, përdoret infeksioni i kafshëve të ndjeshme laboratorike dhe embrioneve të pulave, por më së shpeshti përdoret kultura e indeve. Prania e një virusi përcaktohet zakonisht nga degjenerimi specifik i qelizave (efekti citopatik), formimi i simplasteve dhe sinciteve, zbulimi i përfshirjeve ndërqelizore, si dhe një antigjen specifik i zbuluar duke përdorur imunofluoreshencën, hemadsorbimin, hemaglutinimin (për viruset hemaglutinuese), etj. . Këto shenja mund të zbulohen vetëm pas 2-3 kalimeve të virusit.

Embrionet e pulave përdoren për të izoluar një sërë virusesh, si viruset e gripit, dhe minjtë e porsalindur përdoren për të izoluar disa viruse Coxsackie dhe një numër arbovirusesh. Identifikimi i viruseve të izoluar kryhet duke përdorur reaksione serologjike dhe metoda të tjera.

Kur punoni me viruse, përcaktohet titri i tyre. Titrimi i viruseve zakonisht kryhet në kulturën e indeve, duke përcaktuar hollimin më të lartë të lëngut që përmban virusin në të cilin ndodh degjenerimi i indeve, formohen përfshirje dhe antigjene specifike për virusin. Metoda e pllakës mund të përdoret për të titruar një numër virusesh. Pllakat, ose kolonitë negative të viruseve, janë vatra të qelizave të shkatërruara nga virusi në një kulturë indore me një shtresë nën një shtresë agar. Numërimi i kolonive lejon një analizë sasiore të aktivitetit infektiv të viruseve në bazë të faktit se një grimcë virusi infektiv formon një pllakë. Pllakat zbulohen duke ngjyrosur kulturën me ngjyra intravitale, zakonisht të kuqe neutrale; pllakat nuk e thithin bojën dhe për këtë arsye janë të dukshme si pika të lehta në sfondin e qelizave të gjalla të njollosura. Titri i virusit shprehet si numri i njësive që formojnë pllakëza për 1 ml.

Pastrimi dhe përqendrimi i viruseve zakonisht realizohet me ultracentrifugim diferencial i ndjekur nga centrifugimi i gradientit të përqendrimit ose densitetit. Për pastrimin e viruseve përdoren metoda imunologjike, kromatografia e shkëmbimit të joneve, imunosorbentët etj.

Diagnoza laboratorike e infeksioneve virale përfshin zbulimin e patogjenit ose përbërësve të tij në materialin klinik; izolimi i virusit nga ky material; serodiagnoza. Zgjedhja e metodës së diagnostikimit laboratorik në çdo rast individual varet nga natyra e sëmundjes, periudha e sëmundjes dhe aftësitë e laboratorit. Diagnostifikimi modern i infeksioneve virale bazohet në metoda të shprehura që bëjnë të mundur marrjen e përgjigjes disa orë pas marrjes së materialit klinik në fazat e hershme pas sëmundjes. Këtu përfshihet mikroskopi elektronik dhe elektronik imunitar, si dhe imunofluoreshenca, metoda e hibridizimit molekular. , zbulimi i antitrupave të klasës IgM etj.

Mikroskopi elektronik i viruseve të ngjyrosur negativisht bën të mundur diferencimin e viruseve dhe përcaktimin e përqendrimit të tyre. Përdorimi i mikroskopisë elektronike në diagnostikimin e infeksioneve virale është i kufizuar në ato raste kur përqendrimi i grimcave virale në materialin klinik është mjaft i lartë (10 5 në 1 ml dhe më lart). Disavantazhi i metodës është pamundësia për të dalluar viruset që i përkasin të njëjtit grup taksonomik. Kjo mangësi tejkalohet me përdorimin e mikroskopit elektronik imunitar. Metoda bazohet në formimin e komplekseve imune duke shtuar serum specifik në grimcat virale, duke përqendruar njëkohësisht grimcat virale, duke i lejuar ato të identifikohen. Metoda përdoret gjithashtu për të zbuluar antitrupat. Për qëllime të shprehura diagnostike, kryhet një ekzaminim mikroskopik elektronik i ekstrakteve të indeve, feçeve, lëngjeve nga vezikulat dhe sekrecioneve nga nazofaringu. Mikroskopi elektronik përdoret gjerësisht për të studiuar morfogjenezën e virusit; aftësitë e tij zgjerohen me përdorimin e antitrupave të etiketuar.

Metoda e hibridizimit molekular, e bazuar në zbulimin e acideve nukleike specifike për virusin, bën të mundur zbulimin e kopjeve të vetme të gjeneve dhe nuk ka të barabartë në ndjeshmëri. Reaksioni bazohet në hibridizimin e vargjeve plotësuese të ADN-së ose ARN-së (sonda) dhe në formimin e strukturave me dy fije. Sonda më e lirë është ADN-ja rekombinante e klonuar. Sonda është etiketuar me prekursorë radioaktivë (zakonisht fosfor radioaktiv). Përdorimi i reaksioneve kolorimetrike është premtues. Ekzistojnë disa opsione për hibridizimin molekular: hibridizimi spot, hibridizimi i blotit, hibridizimi me sanduiç, hibridizimi in situ, etj.

Antitrupat e klasës IgM shfaqen më herët se antitrupat e klasës G (në ditën 3-5 të sëmundjes) dhe zhduken pas disa javësh, kështu që zbulimi i tyre tregon një infeksion të fundit. Antitrupat e klasës lgM zbulohen me imunofluoreshencë ose me analizë imunosorbente të lidhur me enzimë duke përdorur anti-m antisera (seri kundër zinxhirëve të rëndë lgM).

Metodat serologjike në virologji bazohen në reaksionet imunologjike klasike (shih. Metodat e kërkimit imunologjik ): reaksionet e fiksimit të komplementit, frenimi i hemaglutinimit, neutralizimi biologjik, imunodifuzioni, hemagglutinimi indirekt, hemoliza radiale, imunofluoreshenca, imunoassay enzimë, radioimmunoassay. Janë zhvilluar mikrometoda për shumë reaksione dhe teknikat e tyre janë duke u përmirësuar vazhdimisht. Këto metoda përdoren për të identifikuar viruset duke përdorur një grup serumesh të njohura dhe për serodiagnozën për të përcaktuar rritjen e antitrupave në serumin e dytë në krahasim me të parën (serumi i parë merret në ditët e para pas sëmundjes, i dyti - pas 2- 3 jave). Një vlerë diagnostike është jo më pak se një rritje katërfish e antitrupave në serumin e dytë. Nëse zbulimi i antitrupave të klasës IgM tregon një infeksion të kohëve të fundit, atëherë antitrupat e klasës IgC vazhdojnë për disa vjet, dhe nganjëherë për jetën.

Për të identifikuar antigjenet individuale të viruseve dhe antitrupat ndaj tyre në përzierje komplekse pa pastrim paraprak të proteinave, përdoret imunoblotting. Metoda kombinon fraksionimin e proteinave duke përdorur elektroforezën e xhelit të poliakrilamidit me imunoindikacionin pasues të proteinave duke përdorur metodën e imuno-analizimit enzimë. Ndarja e proteinave zvogëlon kërkesat për pastërtinë kimike të antigjenit dhe bën të mundur identifikimin e çifteve individuale antigjen-antitrup. Kjo detyrë është e rëndësishme, për shembull, në serodiagnozën e infeksionit HIV, ku reaksionet e analizës imunosorbente të lidhura me enzimën false-pozitive shkaktohen nga prania e antitrupave ndaj antigjeneve qelizore, të cilat janë të pranishme si rezultat i pastrimit të pamjaftueshëm të proteinave virale. Identifikimi i antitrupave në serumet e pacientit ndaj antigjeneve virale të brendshme dhe të jashtme bën të mundur përcaktimin e fazës së sëmundjes dhe kur analizohen popullatat, ndryshueshmëria e proteinave virale. Imunoblotimi për infeksionin HIV përdoret si një test konfirmues për të identifikuar antigjenet individuale virale dhe antitrupat ndaj tyre. Kur analizohen popullatat, metoda përdoret për të përcaktuar ndryshueshmërinë e proteinave virale. Vlera e madhe e metodës qëndron në mundësinë e analizimit të antigjeneve të sintetizuara duke përdorur teknologjinë rekombinante të ADN-së, duke përcaktuar madhësitë e tyre dhe praninë e përcaktuesve antigjenikë.

Metoda virologjike përfshin dy faza kryesore: izolimin e viruseve dhe identifikimin e tyre. Materialet mund të jenë gjaku, lëngje të tjera biologjike dhe patologjike, biopsi të organeve dhe indeve.

Testet virologjike të gjakut kryhen shpesh për të diagnostikuar infeksionet arbovirale. Viruset e tërbimit, shytave dhe herpes simplex mund të zbulohen në pështymë. Tamponët nazofaringeal përdoren për të izoluar patogjenët e gripit dhe infeksioneve të tjera virale respiratore akute dhe fruthit. Adenoviruset gjenden në tamponët e konjuktivës. Nga feçet izolohen entero-, adeno-, reo- dhe rotaviruse të ndryshëm.

Për të izoluar viruset, përdoren kulturat qelizore, embrionet e pulave dhe ndonjëherë edhe kafshët laboratorike. Shumica e viruseve patogjene dallohen nga prania e specifikave të indeve dhe tipit", për shembull, poliovirusi riprodhohet vetëm në qelizat e primatëve, prandaj, për të izoluar një virus specifik, përdoret një kulturë e përshtatshme e indeve. Për të izoluar një patogjen të panjohur, këshillohet që të infektojnë njëkohësisht 3-4 kultura qelizore, duke supozuar se njëra prej tyre mund të rezultojë e ndjeshme.Prania e virusit në kulturat e infektuara përcaktohet nga zhvillimi i degjenerimit specifik qelizor, pra nga veprimi citopatogjen, zbulimi i inkluzioneve ndërqelizore, si dhe bazuar në zbulimin e një antigjeni specifik me anë të imunofluoreshencës, hemadsorbimit pozitiv dhe reaksioneve të hemaglutinimit. Embrionet e shpendëve me indet e tyre të diferencuara dobët janë të përshtatshme për kultivimin e shumë viruseve. Më shpesh përdoren embrionet e pulës. Kur shumohen në embrione, viruset mund të shkaktojnë vdekjen e tyre (arboviruset), shfaqja e ndryshimeve në membranën korion-alantoike (viruset e lisë) ose në trupin e embrionit, akumulimi i hemagglutininave në lëngjet embrionale (viruset e influencës, shytat) dhe antigjeni viral fiksues i komplementit.

Viruset identifikohen duke përdorur metoda imunologjike: reaksioni i frenimit të hemaglutinimit, fiksimi i komplementit, neutralizimi, precipitimi i xhelit, imunofluoreshenca.

3.4 Metoda biologjike

Metoda biologjike konsiston në infektimin e kafshëve laboratorike me materiale të ndryshme (klinike, laboratorike) për të treguar patogjenin, si dhe për të përcaktuar disa veti të mikroorganizmave që karakterizojnë patogjenitetin e tyre (toksigjeniteti, toksiciteti, virulenca). Si kafshë laboratori përdoren minjtë e bardhë, minjtë e bardhë, derrat gini, lepujt etj.

Riprodhimi i sëmundjes në një kafshë është provë absolute e patogjenitetit të mikroorganizmit të izoluar (në rastin e tërbimit, tetanozit, etj.). Prandaj, një test biologjik mbi kafshët është një metodë diagnostike e vlefshme dhe e besueshme, veçanërisht për ato infeksione, patogjenët e të cilëve përmbahen në përqendrime të ulëta në mjediset biologjike të studiuara të trupit të njeriut dhe rriten dobët ose ngadalë në media artificiale.

3.5 Metoda imunologjike

Metoda imunologjike(serologjike) përfshin studime të serumit të gjakut, si dhe të substrateve të tjera biologjike për të identifikuar antitrupa dhe antigjenë specifikë. Serodiagnoza klasike bazohet në përcaktimin e antitrupave ndaj një patogjeni të identifikuar ose të dyshuar. Një rezultat pozitiv i reagimit tregon praninë e antitrupave ndaj antigjeneve patogjene në serumin e gjakut që testohet; një rezultat negativ tregon mungesën e tyre. Zbulimi i antitrupave ndaj agjentit shkaktar të një numri sëmundjesh infektive në serumin e gjakut në studim nuk është i mjaftueshëm për të bërë një diagnozë, pasi mund të pasqyrojë praninë e imunitetit pas infektimit ose pas vaksinimit, pra, gjak "të çiftuar". serumet ekzaminohen, i pari merret në ditët e para të sëmundjes dhe i dyti merret me një interval prej 7-10 ditësh. Në këtë rast vlerësohet dinamika e rritjes së nivelit të antitrupave.

Një rritje në titrin e antitrupave në serumin e gjakut të testuar me të paktën 4 herë në krahasim me nivelin fillestar është diagnostikisht i rëndësishëm. Ky fenomen quhet serokonversion. Në sëmundjet e rralla infektive, si dhe hepatiti viral, infeksioni HIV dhe disa të tjera, prania e antitrupave tregon se pacienti është i infektuar dhe ka vlerë diagnostikuese.

Përveç përcaktimit të titrit të antitrupave, gjatë studimeve serologjike është e mundur të përcaktohet izotipi i antitrupave. Dihet se në takimin e parë të trupit të njeriut me një patogjen në periudhën akute të sëmundjes, zbulohet një rritje më e shpejtë e antitrupave që i përkasin IgM, niveli i të cilave, duke arritur një vlerë maksimale, më pas zvogëlohet. Në fazat e mëvonshme të sëmundjes rritet numri i antitrupave IgG, të cilat vazhdojnë më gjatë dhe përcaktohen gjatë periudhës së rikonvaleshencës. Kur ndeshemi sërish me patogjenin, falë kujtesës imunologjike, reaksionet e imunitetit humoral manifestohen me prodhim më të shpejtë të antitrupave IgG dhe antitrupat e klasës M prodhohen në sasi të vogla. Zbulimi i antitrupave IgM tregon praninë e një procesi infektiv aktual, dhe prania e antitrupave IgG tregon një infeksion të kaluar ose imunitet pas vaksinimit.

Duke marrë parasysh karakteristikat e përgjigjes imune parësore dhe dytësore, analiza e raportit të antitrupave IgM dhe IgG lejon në disa raste të diferencojë fazën e procesit infektiv (lartësia e sëmundjes, konvaleshenca, rikthimi). Për shembull, në rastin e hepatitit viral A (HA), një metodë e besueshme diagnostike është përcaktimi i antitrupave anti-HAV IgM në serumin e gjakut. Zbulimi i tyre tregon një infeksion aktual ose të fundit HAV.

Testimi serologjik për zbulimin e antitrupave në sëmundjet infektive është një metodë më e arritshme e diagnostikimit laboratorik sesa izolimi i patogjenit. Ndonjëherë një reagim pozitiv serologjik shërben si e vetmja dëshmi e takimit dhe ndërveprimit të organizmit me agjentin shkaktar të sëmundjes infektive përkatëse. Për më tepër, një numër sëmundjesh me një pamje të ngjashme klinike (për shembull, rikecioza, infeksionet enteroviruse) mund të diferencohen vetëm serologjikisht, gjë që pasqyron rëndësinë e metodave serologjike në diagnostikimin e sëmundjeve infektive.

Puna e kursit

"Metodat e virologjisë klinike"

Prezantimi

Diagnoza laboratorike e infeksioneve virale kryhet kryesisht duke përdorur mikroskop elektronik, kultura qelizore të ndjeshme dhe metoda imunologjike. Si rregull, zgjidhet një metodë për të bërë një diagnozë në varësi të fazës së infeksionit viral. Për shembull, të treja qasjet mund të jenë të dobishme në diagnostikimin e varicelës, por përdorimi i suksesshëm i teknikave të mikroskopisë dhe kulturës së qelizave varet nga aftësia për të mbledhur mostra të kënaqshme relativisht herët në sëmundje.

Në një masë të madhe, suksesi i diagnostikimit viral varet nga cilësia e mostrave të marra. Për këtë arsye, vetë stafi i laboratorit duhet të përfshihet drejtpërdrejt në mbledhjen e mostrave të nevojshme. Karakteristikat e mostrave, si dhe metodat për dërgimin e tyre në laborator, përshkruhen nga Lennett, Schmidt, Christ, et al.

Shumica e reagentëve dhe instrumenteve të përdorura në diagnostikimin laboratorik mund të blihen nga kompani të ndryshme. Në shumicën e rasteve, i njëjti reagent prodhohet njëkohësisht nga disa kompani. Për këtë arsye, ne nuk kemi treguar kompani individuale, përveç nëse reagenti furnizohet vetëm nga një kompani. Në të gjitha rastet e tjera, duhet t'i referoheni listës së përgjithshme të furnitorëve të treguar në tabelë. 1.

Ne nuk synuam të ofrojmë një përshkrim të plotë të të gjitha metodave të disponueshme aktualisht për diagnostikimin e infeksioneve virale njerëzore. Para së gjithash, ne karakterizuam metodat kryesore. Ndërsa fitoni përvojë duke punuar në mënyrë të pavarur, këto teknika bazë mund të përdoren për të zgjidhur probleme më komplekse.

1. Mikroskopi elektronik

Për diagnozën mikroskopike elektronike të infeksioneve virale, mund të përdoren seksione të holla të indit të prekur. Materiali më i zakonshëm që përdoret për mikroskopin elektronik është feces ose lëng.

Tabela 1. Lista e kompanive që furnizojnë reagentë dhe pajisje

vezikulat që karakterizojnë disa sëmundje, si lia e dhenve. Kur analizohet një material i tillë, viruset mund të zbulohen duke përdorur ngjyrosje negative, e cila rezulton në një material të dendur elektronik që përcakton përbërësit e virionit. Metoda është efektive kur përqendrimi i virusit është i lartë në mostrat e testimit, si në feces ose lëngun vezikular. Në rastet kur përmbajtja e grimcave virale në mostra është e ulët, probabiliteti i zbulimit të virusit mund të rritet duke e përqendruar virusin me ultracentrifugim ose duke e grumbulluar atë me antitrupa specifikë. Metoda e fundit është gjithashtu e përshtatshme për identifikimin e viruseve. Këtu do të përshkruajmë metodën mikroskopike elektronike për diagnostikimin e infeksionit rotavirus dhe metodën e mikroskopisë imunoelektronike duke përdorur shembullin e zbulimit të antitrupave specifikë ndaj parvoviruseve. Metodat e mikroskopisë elektronike janë përshkruar më në detaje nga Field.

2.1 Ekzaminimi elektronik mikroskopik i drejtpërdrejtë i feces

1. Zhytni majën e një pipete Pasteur në feces dhe nxirrni material të mjaftueshëm për të marrë një njollë 1 cm.

2. Risuspendoni njollën fekale në bojë me kontrast negativ mikroskopik elektronik derisa të merret një suspension i tejdukshëm. Bojë me kontrast negativ është një zgjidhje 2% e acidit fosfotungstik në ujë të distiluar.

3. Për të marrë një ekzemplar mikroskopik elektronik, një pikë e suspensionit vendoset në një rrjetë mikroskopi elektronik të veshur me një film karboni-formvar. Gjatë këtij operacioni, rrjeta mbahet me një palë piskatore të hollë.

4. Ilaçi lihet në ajër për 30 s.

5. Lëngu i tepërt hiqet duke prekur buzën e xhamit me letër filtri.

6. Ilaçi thahet në ajër.

7. Nëse është e nevojshme, virusi i qëndrueshëm inaktivizohet duke rrezatuar të dyja anët e rrjetit me dritë ultravjollcë me një intensitet 440,000 μW-s/cm2. Në këtë rast, përdoret një llambë ultravjollcë me valë të shkurtër me një filtër. Llamba duhet të jetë në një distancë prej 15 cm nga rrjeti; Koha e rrezatimit për secilën anë është 5 minuta.

8. Virionet e Rotavirusit mund të karakterizohen nën një mikroskop elektronik transmetues me një zmadhim prej 30,000 deri në 50,000.

2.2 Mikroskopi imunoelektronike

Metoda e mikroskopisë imunoelektronike e përshkruar më poshtë është vetëm një nga shumë metoda imunologjike të ngjashme. Për të studiuar antitrupat specifikë për virusin, përveç kësaj, përdoret një metodë që përfshin lidhjen me rrjetin mikroskopik të proteinës A. Përqendrimi i punës i antitrupave antivirale përcaktohet me provë dhe gabim në rangun nga 1/10 deri në 1/1000. Përqendrimi që tregojmë zakonisht përdoret në punën rutinë. Për të marrë rezultate optimale për ndërveprimin e antitrupave me virusin, serumi që përmban parvovirus titrohet në të njëjtën mënyrë.

1. 10 µl antiserum ndaj parvovirusit njerëzor hollohet 100 herë me PBS. Tretësira nxehet në një banjë uji deri në 56°C.

2. Shkrini 10 ml agarozë 2% në PBS në mënyrën e zakonshme dhe ftohni në 56 °C në një banjë uji.

3. Në 56 °C, përzieni 1 ml antiserum të holluar me 1 ml agarozë 2%.

4. Transferoni 200 µl të përzierjes që rezulton në dy puse të një pllake mikrotitri me 96 pus.

5. Agaroza lihet të vendoset në temperaturën e dhomës. Tableta mund të ruhet në 4°C për disa javë nëse është e mbyllur me shirit ngjitës.

6. Shtoni 10 µl serum që përmban parvovirus në një pus që përmban një përzierje agaroze dhe antiserum.

7. Një rrjet mikroskopi elektronik me një shtresë karboni-formvar të përgatitur paraprakisht vendoset në anën më pak të shndritshme në një pikë serumi.

8. Rrjeta mbahet për 2 orë në 37 °C në një dhomë të lagësht.

9. Duke përdorur piskatore të hollë, hiqni rrjetën dhe aplikoni një pikë acid fosfotungstik 2% në sipërfaqen e rrjetës që ishte në kontakt me serumin.

10. Pas 30 s, boja e tepërt lahet, preparati thahet dhe virusi inaktivizohet.

Grimcat e grumbulluara virale ekzaminohen nën një mikroskop elektronik transmetues në një zmadhim prej 30,000 deri në 50,000.

3. Identifikimi i antigjeneve virale

Viruset që gjenden në inde ose lëngje indore mund të identifikohen nga proteinat specifike për virusin duke përdorur reaksionin antigjen-antitrup. Produkti i reaksionit antigjen-antitrup testohet kundër një etikete që futet ose drejtpërdrejt në antitrupat antiviralë ose në antitrupat e drejtuar kundër antitrupave specifikë për virusin. Antitrupat mund të etiketohen me fluoresceinë, jod radioaktiv ose një enzimë që copëton substratin duke shkaktuar një ndryshim të ngjyrës. Përveç kësaj, reaksioni i hemaglutinimit përdoret për të identifikuar virusin. Në praktikën e përditshme, metodat e përshkruara përdoren kryesisht për zbulimin e antigjeneve të virusit të hepatitit B në gjak dhe kërkimin e antigjeneve të viruseve të ndryshme që shkaktojnë sëmundje të ndryshme të frymëmarrjes.

Aktualisht, shumë kompani prodhojnë diagnostifikime eritrocitare, radioaktive dhe enzimatike, përfshirë ato për zbulimin e virusit të hepatitit B. Nuk e konsiderojmë të këshillueshme të përvijojmë metodat e punës me këto diagnostifikime: mjafton të ndiqni udhëzimet e bashkangjitura. Më poshtë do të fokusohemi në metodën e imunofluoreshencës për identifikimin e virusit sincicial respirator në sekrecionet nazofaringeale.

3.1 Identifikimi i virusit sincicial respirator në sekrecionet nazofaringeale me anë të imunofluoreshencës

Metoda për marrjen e preparateve të sekrecioneve nazofaringeale është përshkruar nga Gardner dhe McQuillin. Në kushte laboratorike, ky operacion kryhet në dy faza. Së pari, një njollë e mukusit nazofaringeal përgatitet në një rrëshqitje xhami. Njollat ​​që rezultojnë mund të ruhen të fiksuara në -20°C për shumë muaj. Në fazën e dytë, njollat ​​bëhen për të zbuluar antigjenin e virusit sincicial të frymëmarrjes. Për këtë qëllim përdoret metoda e imunofluoreshencës indirekte.

3.1.1 Përgatitja e preparateve të sekrecioneve nazofaringeale

1. Mukusi nga pinca speciale lahet me 1-2 ml PBS dhe transferohet në një tub centrifuge.

2. Centrifugoni për 10 minuta me 1500 rpm në një centrifugë tavoline.

3. Supernatanti kullohet.

4. Peleti i qelizave risuspendohet me kujdes në 2-3 ml PBS derisa të merret një suspension homogjen. Për ta bërë këtë, përdorni një pipetë Pasteur me qafë të gjerë.

5. Pezullimi që rezulton transferohet në një provëz.

6. Shtoni 2-4 ml të tjera PBS në suspension dhe përzieni me tubacion. Mpiksjet e mëdha të mukusit hiqen.

7. Centrifugoni për 10 minuta me 1500 rpm në një centrifugë tavoline.

8. Supernatanti hidhet, sedimenti risuspendohet në një vëllim të tillë PBS që pezullimi që rezulton ndahet lehtësisht nga muret e tubit.

9. Pezullimi që rezulton aplikohet në një rrëshqitje xhami të shënuar.

10. Xhami thahet në ajër.

Vendoseni në aceton për 10 minuta në 4°C.

12. Pas fiksimit, xhami thahet përsëri me ajër.

13. Preparatet që rezultojnë njollosen menjëherë ose ruhen në -20 °C.

3.1.2. Teknika e ngjyrosjes

1. Printoni dhe holloni antiserumin komercial RSV në PBS në përqendrimin e rekomanduar të punës.

2. Duke përdorur një pipetë Pasteur, aplikoni një pikë antiserum në preparatin e përgatitur.

3. Ilaçi vendoset në një dhomë të lagësht.

4. Ilaçi inkubohet për 30 minuta në 37 °C.

5. Mostrat lahen me kujdes me PBS për të hequr antitrupat e tepërt në një rezervuar të veçantë.

6. Mostrat lahen në tri ndërrime të PBS, nga 10 minuta secila.

7. Thani mostrat, hiqni PBS të tepërt me letër filtri dhe thajeni në ajër.

Diagnoza etiologjike e sëmundjeve virale kryhet duke përdorur metoda gjenetike virologjike, virusoskopike, serologjike dhe molekulare. Tre metodat e fundit mund të përdoren si metoda të shprehura diagnostikuese.

Metoda e diagnostikimit virologjik.

Qëllimi përfundimtar i metodës është identifikimi i viruseve për specie ose variant serologjik. Metoda virologjike përfshin disa faza:

1) përzgjedhja e materialit për hulumtim;

2) përpunimi i materialit që përmban viruse;

3) ndotja e sistemeve të ndjeshme të jetesës me material;

4) treguesi i viruseve në sistemet e gjalla;

5) titrimi i viruseve të izoluar;

6) identifikimi i viruseve në reaksionet imune.

1. Përzgjedhja e materialit për hulumtim .

Ajo kryhet në fazat e hershme të sëmundjes, duke iu nënshtruar rregullave që parandalojnë kontaminimin e materialit me mikroflora të huaj dhe infeksionin e personelit mjekësor. Për të parandaluar inaktivizimin e viruseve gjatë transportit, materiali vendoset në një medium transporti viral (VTS) i përbërë nga një zgjidhje kripe e ekuilibruar, antibiotikë dhe albuminë serike. Materiali transportohet në një enë të veçantë me termoizolim dhe qese plastike të mbyllura që përmbajnë akull. Nëse është e nevojshme, materiali ruhet në -20˚C. Çdo mostër e materialit për hulumtim duhet të jetë e shënuar dhe etiketuar duke treguar emrin e pacientit, llojin e materialit, datën e mbledhjes, diagnozën e detajuar klinike dhe informacione të tjera.

Në varësi të natyrës së sëmundjes, materiali për hulumtim mund të jetë:

1) shtupë nga pjesa e hundës së faringut dhe një shtupë nga faringu;

2) lëngu cerebrospinal;

3) feces dhe tamponët rektal;

6) lëngu nga zgavrat seroze;

7) njollosje nga konjuktiva;

8) përmbajtja e vezikulave;

8) material seksional.

Për të marrë një larje nga orofaringu, përdoren 15-20 ml VTS. Pacienti bën gargarë me kujdes VTS për 1 minutë dhe mbledh shpëlarjen në një shishe sterile.

Një njollë merret nga pjesa e pasme e fytit me një shtupë pambuku steril, duke shtypur rrënjën e gjuhës me një shpatull. Tamponi vendoset në 2-3 ml VTS, shpëlahet dhe shtrydhet.

Lëngu cerebrospinal merret përmes një trokitjeje kurrizore. 1-2 ml lëng cerebrospinal vendoset në një enë sterile dhe dërgohet në laborator.

Mostrat e jashtëqitjes mblidhen brenda 2-3 ditësh në shishe sterile. Një suspension 10% përgatitet nga materiali që rezulton duke përdorur tretësirën Hanks. Pezullimi centrifugohet në 3000 rpm, mblidhet supernatanti, i shtohen antibiotikë dhe vendosen në një enë sterile.

Gjaku i marrë me venipunkturë në vëllim 5-10 ml defibrinohet duke shtuar heparinë. Gjaku i plotë nuk ngrihet dhe antibiotikët nuk shtohen. Për të marrë serum, mostrat e gjakut mbahen në një termostat në 37˚C për 60 minuta.

Lëngu nga zgavrat seroze merret me shpim në një sasi prej 1-2 ml. Lëngu përdoret menjëherë ose ruhet i ngrirë.

Një njollë nga konjuktiva merret me një shtupë sterile dhe vendoset në një VTS, pas së cilës materiali i mbledhur centrifugohet dhe ngrihet.

Përmbajtja e vezikulave aspirohet me një shiringë me një gjilpërë të hollë dhe vendoset në VTS. Materiali dërgohet në laborator në formën e njollave të thara në rrëshqitës xhami ose në kapilarë ose ampula sterile të mbyllura.

Materiali seksional zgjidhet sa më shpejt që të jetë e mundur, duke respektuar rregullat aseptike. Komplete të veçanta instrumentesh sterile përdoren për të mbledhur çdo mostër. Sasia e indit të marrë është 1-3 g, i cili vendoset në shishe sterile. Së pari, mostrat merren nga organet ekstrakavitare (truri, nyjet limfatike, etj.). Indet nga zgavra e kraharorit mblidhen para hapjes së zgavrës së barkut. Mostrat e indeve që rezultojnë bluhen në një llaç me shtimin e rërës sterile dhe solucionit steril të klorurit të natriumit, pas së cilës materiali centrifugohet. Supernatanti mblidhet në shishe dhe shtohen antibiotikë. Materiali për kërkime virologjike përdoret menjëherë ose ruhet në -20˚C.

2. Përpunimi i materialit që përmban viruse.

Ajo kryhet me qëllim të çlirimit të materialit nga mikroflora bakteriale shoqëruese. Për këtë qëllim përdoren metoda fizike dhe kimike.

Metodat fizike:

1) filtrimi përmes filtrave të ndryshëm bakterialë;

2) centrifugimi.

Metodat kimike:

1) trajtimi i materialit me eter në rastet e izolimit të viruseve që nuk kanë superkapsid;

2) shtimi i një përzierjeje heptani dhe freoni në material;

3) administrimi i antibiotikëve (penicilinë - 200-300 U/ml; streptomicinë - 200-500 mcg/ml; nistatin - 100-1000 U/ml).

3. Ndotja e sistemeve të gjalla të ndjeshme nga materiali.

1) kafshët laboratorike;

2) embrionet e pulës;

3) kultura e organeve;

4) kultura e indeve.

Kafshët laboratorike. Përdoren minjtë e bardhë, derrat gini, lloj brejtësi, lepujt etj.. Minjtë e bardhë janë më të ndjeshëm ndaj një numri të madh të llojeve të viruseve. Metoda e infektimit të kafshëve përcaktohet nga tropizmi i virusit ndaj indeve. Infeksioni në tru përdoret kur izolohen viruset neurotropike (viruset e tërbimit, polioviruset, etj.). Infeksioni intranazal kryhet kur izolohen patogjenët e infeksioneve të frymëmarrjes. Përdoren gjerësisht metodat intramuskulare, intravenoze, intraperitoneale, nënlëkurore dhe të tjera të infeksionit. Kafshët e sëmura eutanizohen me eter, hapen dhe materiali mblidhet nga organet dhe indet.

Embrionet e pulës. Gjerësisht i disponueshëm dhe i lehtë për t'u përdorur. Përdoren embrionet e pulave të moshës nga 5 deri në 14 ditë. Para infektimit, embrionet e pulës janë ovoskopike: përcaktohet qëndrueshmëria e tyre, kufiri i qeses së ajrit dhe vendndodhja e embrionit shënohen në guaskë ("syri i errët" i embrionit). Puna me embrionet e pulës kryhet në një kuti sterile me instrumente sterile (piskatore, shiringa, gërshërë, shtizë, etj.). Pas përfundimit të një fragmenti të punës, mjetet zhyten në alkool etilik 70% dhe digjen para manipulimit të radhës. Para infektimit, guaska e embrionit të pulës fshihet me një shtupë alkooli të djegur dhe një zgjidhje alkoolike të jodit. Vëllimi i materialit testues të injektuar në embrion është 0,1-0,2 ml. Për të izoluar viruset nga një material, përdoren të paktën 4 embrione pule.

mësimi nr. 2 7

TEMA: NDËRVEPRIMI I VIRUSËVE ME QELIZA TË NDJESHME. KULTIVIMI. METODAT E TREGIMITdhe identifikimi.IMUNITET ANTI-VIRAL.

LISTA KONTROLLUESE

1. Viruset, natyra dhe origjina. Historia e zbulimit. Fazat e zhvillimit të virologjisë. Koncepti i virionit, struktura e tij. Përbërja kimike dhe vetitë e viruseve.

2. Parimet e klasifikimit të viruseve – kriteret. Familjet e viruseve ARN dhe ADN (kontrolli).

3. Tropizmi i viruseve. Ndërveprimi i viruseve me qelizat e ndjeshme - faza.

4. Kultivimi i viruseve. Tregimi dhe identifikimi i viruseve kur kultivohen në kulturat qelizore dhe embrionet e pulës. Kulturat qelizore, linjat qelizore, përgatitja, kushtet e kultivimit.

5. Klasifikimi i infeksioneve virale: a) në nivel qelizor; b) në nivel organizmi.

6. Metodat e diagnostikimit laboratorik të infeksioneve virale. Metodat e drejtpërdrejta për studimin e materialit klinik (zbulimi i viruseve, antigjeneve virale ose NK virale). Metoda e diagnostikimit virologjik. Serodiagnoza e infeksioneve virale.

7. Imuniteti antiviral – faktorët. Rezistenca e specieve. Faktorët jospecifik të mbrojtjes antivirale (frenuesit, interferoni, komplementi, fagocitoza). Imuniteti i fituar (mekanizmat humoral dhe qelizor).

8. Parimet e parandalimit dhe trajtimit specifik të infeksioneve virale: vaksinat, serumet imune (imunoglobulinat), interferonet, kimioterapia etiotropike.

PUNË LABORATORIKE

DIAGNOSTIKA LABORATORIKE E INFEKSIONIVE VIRALE

1. Për diagnostikim ekspres përdorni:

A) përcaktimi i antigjenit viral në materialin e studiuar duke përdorur serume antivirale diagnostike në reaksionet e mëposhtme: RIF, ELISA, RIA, kundër imunoelektroforezës (CIEF), reaksioni i hemaglutinimit pasiv (RPHA), reaksioni i frenimit të hemaglutinimit (HAI), etj.;

V) zbulimi i virioneve në materialin patologjik duke përdorur mikroskop elektronik ose IEM.

d) zbulimin e gjenomave të virusit metodat gjenetike molekulare: PCR; hibridizimi molekular i acideve nukleike duke përdorur sonda të etiketuara.

2. Metoda virologjike

Fazat kryesore:

1. Mbledhja e materialit testues.

2. Përzgjedhja e bazuar në parimin e citotropizmit dhe marrja e një sistemi testues të ndjeshëm, duke përcaktuar qëndrueshmërinë e tij.

3. Infeksioni i sistemit të përzgjedhur.

4.Tregimi i virusit bazuar në zbulimin e acidit nukleik, antigjeneve, hemaglutininës, CPD, përfshirjeve të tij.

5. Identifikimi dhe titrimi i virusit kryhet në bazë të:

a) përcaktimi i antigjeneve të virusit duke përdorur reaksione imunologjike (RIF, ELISA, RPGA, RSK, RN, VIEF, etj.); b) ekzaminimi patohistologjik i organeve dhe indeve; c) CPP; d) simptomat klinike, analizat biologjike (keratokonjuktivale etj.).

Metoda virologjike (skema)

Materiali i testimit (feçet, tamponët nazofaringeale, materiali seksional, etj.)

Trajtim antibiotik për të shtypur infeksionet bakteriale dhe kërpudhore

mikroflora, centrifugimi, filtrimi

Seria e infeksioneve

Embrionet e pulës

Kulturat e qelizave

Kafshët

Tregimi i viruseve bazuar në fenomenet e mëposhtme

Vonesa në zhvillim

vdekje, ndryshim

membranat e embrionit, RGA

CPP, formimi i pllakave, RIF, RGads, interferenca

Sëmundje, vdekje,

ndryshimet histologjike

në inde, përfshirje

Titrimi i virusit të izoluar; përzgjedhja e dozës së punës.

Titri i virusit- hollimi maksimal i materialit që përmban virusin, në të cilin ende vërehet efekti i pritur (CPE, RGA, vdekja e kafshës).

Identifikimi i virusit të izoluar ne reaksionet e neutralizimit, RTGads, RSC, shtypja e formimit te pllakave etj me serume diagnostike. Lloji (lloji) i virusit përcaktohet nga neutralizimi i efektit specifik të virusit nga serumi i duhur imunitar.

Shënim: Titrimi dhe identifikimi i virusit kryhen duke përdorur të njëjtin fenomen.

Kultivimi i virusit