Вірусологічні методи дослідження- Методи вивчення біології вірусів та їх ідентифікації. У вірусології широко використовуються методи молекулярної біології, за допомогою яких вдалося встановити молекулярну структуру вірусних частинок, способи проникнення їх у клітину та особливості репродукції вірусів, первинної структури вірусних нуклеїнових кислот та білків. Розвиваються методи визначення послідовності складових елементів вірусних нуклеїнових кислот та амінокислот білка. З'являється можливість пов'язати функції нуклеїнових кислот і білків, що ними кодуються, з послідовністю нуклеотидів і встановити причини внутрішньоклітинних процесів, що відіграють важливу роль у патогенезі вірусної інфекції.

Вірусологічні методи дослідження засновані також на імунологічних процесах (взаємодія антигену з антитілами), біологічних властивостях вірусу (здатність до гемаглютинації, гемолізу, ферментативна активність), особливості взаємодії вірусу з клітиною-хазяїном (характер цитопатичного ефекту, утворення внутрішньоклітинних включень). .

У діагностиці вірусних інфекцій, при культивуванні, виділенні та ідентифікації вірусів, а також при отриманні вакцинних препаратів широко застосовують метод культури тканини та клітин. Використовують первинні, вторинні, стабільні перевиваються і диплоїдні клітинні культури. Первинні культури одержують при диспергуванні тканини протеолітичними ферментами (трипсином, колагеназою). Джерелом клітин можуть бути тканини та органи (частіше нирки) ембріонів людини та тварин. Суспензію клітин у живильному середовищі поміщають у так звані матраци, бутлі або чашки Петрі, де після прикріплення до поверхні судини клітини починають розмножуватися. Для зараження вірусами використовують зазвичай клітинний моношар. Поживну рідину зливають, вносять вірусну суспензію у певних розведеннях і після контакту з клітинами додають свіже живильне середовище, зазвичай без сироватки.

Клітини більшості первинних культур можуть бути пересіяні, така культура називається вторинною. При подальшому пасеруванні клітин формується популяція фібробластоподібних клітин, здатних до швидкого розмноження, більшість яких зберігає вихідний набір хромосом. Це так звані диплоїдні клітини. При серійному культивуванні клітин отримують стабільні клітини, що перевиваються клітини. При пасажах з'являються однорідні клітини, що швидко діляться, з гетероплоїдним набором хромосом. Стабільні лінії клітин можуть бути одношаровими та суспензійними. Одношарові культури ростуть у вигляді суцільного шару на поверхні скла, суспензійні - у вигляді суспензій у різних судинах з використанням пристроїв, що перемішують. Існує понад 400 ліній клітин, отриманих від 40 різних видів тварин (в т.ч. від приматів, птахів, рептилій, амфібій, риб, комах) та людини.

У штучних живильних середовищах можна культивувати шматочки окремих органів та тканин (органні культури). Ці типи культур зберігають структуру тканини, що особливо важливо для виділення та пасування вірусів, які не репродукуються у недиференційованих тканинних культурах (наприклад, коронавіруси).

У заражених клітинних культурах віруси можна виявити зі зміни морфології клітин, цитопатичної дії, яка може мати специфічний характер, появу включень, шляхом визначення вірусних антигенів у клітині та культуральної рідини; встановлення біологічних властивостей вірусного потомства в культуральній рідині та титрування вірусів у культурі тканини, курячих ембріонах або на чутливих тваринах; шляхом виявлення окремих вірусних нуклеїнових кислот у клітинах методом молекулярної гібридизації або скупчень нуклеїнових кислот цитохімічним методом за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Виділення вірусів є трудомістким та тривалим процесом. Його здійснюють з метою визначення циркулюючого серед населення типу чи варіанта вірусу (наприклад, для ідентифікації сероваріанту вірусу грипу, дикого чи вакцинного штаму вірусу поліомієліту тощо); у випадках, коли це необхідно щодо термінових епідеміологічних заходів; з появою нових типів чи варіантів вірусів; за необхідності підтвердження попереднього діагнозу; для індикації вірусів об'єктах довкілля. При виділенні вірусів враховують можливість їхнього персистування в організмі людини, а також виникнення змішаної інфекції, спричиненої двома та більше вірусами. Генетично однорідна популяція вірусу, отримана від віріону, називається вірусним клоном, а процес отримання його — клонуванням.

Для виділення вірусів застосовують зараження сприйнятливих лабораторних тварин, курячих ембріонів, але найчастіше використовують культуру тканини. Наявність вірусу зазвичай визначають за специфічною дегенерацією клітин (цитопатичний ефект), утворення симпластів і синцитіїв, виявлення внутрішньоклітинних включень, а також специфічного антигену, що виявляється за допомогою методів імунофлюоресценції, гемадсорбції, гемагглютинації (гемаглютинуючих вірусів). Ці ознаки можуть бути лише після 2—3 пасажів вірусу.

Для виділення ряду вірусів, наприклад вірусів грипу, використовують курячі ембріони, для виділення деяких вірусів Коксакі та ряду арбовірусів – новонароджених мишей. Ідентифікацію виділених вірусів проводять за допомогою серологічних реакцій та інших методів.

Працюючи з вірусами визначають їх титр. Титрування вірусів проводять зазвичай у культурі тканини, визначаючи найбільше розведення вірусомісткої рідини, при якому відбувається дегенерація тканини, утворюються включення та вірусоспецифічні антигени. Для титрування низки вірусів можна використовувати метод бляшок. Бляшки, або негативні колонії вірусів, є осередками зруйнованих під дією вірусу клітин одношарової культури тканини під агаровим покриттям. Підрахунок колоній дозволяє провести кількісний аналіз інфекційної активності вірусів із розрахунку, що одна інфекційна частка вірусу утворює одну бляшку. Бляшки виявляють шляхом фарбування культури прижиттєвими барвниками, зазвичай нейтральним червоним; бляшки не адсорбують барвник і тому видно як світлі плями на тлі забарвлених живих клітин. Титр вірусу виражають числом бляшкоутворюючих одиниць мл.

Очищення та концентрацію вірусів зазвичай здійснюють шляхом диференціального ультрацентрифугування з подальшим центрифугуванням у градієнтах концентрацій або густини. Для очищення вірусів застосовують імунологічні методи, іонно-обмінну хроматографію, імуносорбенти та ін.

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій включає виявлення збудника чи його компонентів у клінічному матеріалі; виділення вірусу із цього матеріалу; серодіагностику. Вибір методу лабораторної діагностики у кожному окремому випадку залежить від характеру захворювання, періоду хвороби та можливостей лабораторії. Сучасна діагностика вірусних інфекцій заснована на експрес-методах, що дозволяють отримувати відповідь через кілька годин після взяття клінічного матеріалу в ранні терміни після захворювання. До них відносяться електронна та імунна електронна мікроскопія, а також імунофлюоресценція, метод молекулярної гібридизації, виявлення антитіл класу lgM та ін.

Електронна мікроскопія вірусів, пофарбованих методом негативного контрастування, дозволяє диференціювати віруси та визначати їхню концентрацію. Застосування електронної мікроскопії в діагностиці вірусних інфекцій обмежується тими випадками, коли концентрація вірусних частинок у клінічному матеріалі досить висока (10 5 1 млі вище). Недоліком методу є неможливість вирізняти віруси, що належать до однієї таксономічної групи. Цей недолік усувається за допомогою імунної електронної мікроскопії. Метод ґрунтується на утворенні імунних комплексів при додаванні специфічної сироватки до вірусних частинок, при цьому відбувається одночасна концентрація вірусних частинок, що дозволяє їх ідентифікувати. Метод застосовують також виявлення антитіл. З метою експрес-діагностики проводять електронно-мікроскопічне дослідження екстрактів тканин, фекалій, рідини із везикул, секретів із носоглотки. Електронну мікроскопію широко використовують із вивчення морфогенезу вірусу, її можливості розширюються при застосуванні мічених антитіл.

Метод молекулярної гібридизації, заснований на виявленні вірусоспецифічних нуклеїнових кислот, дозволяє виявити поодинокі копії генів і за рівнем чутливості не має рівних. Реакція заснована на гібридизації комплементарних ниток ДНК або РНК (зондів) та формуванні двонитчастих структур. Найбільш дешевим зондом є клонована рекомбінантна ДНК. Зонд мітять радіоактивними попередниками (зазвичай радіоактивним фосфором). Перспективне використання колориметричних реакцій. Існує кілька варіантів молекулярної гібридизації: точкова, блот-гібридизація, сендвіч-гібридизація, гібридизація in situ та ін.

Антитіла класу lgM з'являються раніше, ніж антитіла класу G (на 3-5-й день хвороби) і зникають через кілька тижнів, тому їх виявлення свідчить про щойно перенесену інфекцію. Антитіла класу lgM виявляють методом імунофлюоресценції або за допомогою імуноферментного аналізу, використовуючи антиm - антисироватки (сироватки проти важких ланцюгів lgM).

Серологічні методи вірусології засновані на класичних імунологічних реакціях (див. Імунологічні методи дослідження ): реакції зв'язування комплементу, гальмування гемаглютинації, біологічної нейтралізації, імунодифузії, непрямої гемаглютинації, радіального гемолізу, імунофлюоресценції, імуноферментного, радіоімунного аналізу Розроблено мікрометоди багатьох реакцій, техніка їх безперервно вдосконалюється. Ці методи використовують для ідентифікації вірусів за допомогою набору відомих сироваток та для серодиагностики з метою визначення наростання антитіл у другій сироватці порівняно з першою (першу сироватку беруть у перші дні після захворювання, другу – через 2-3 тижні). Діагностичне значення має щонайменше чотириразове наростання антитіл у другій сироватці. Якщо виявлення антитіл класу lgM свідчить про нещодавно перенесену інфекцію, то антитіла класу lgC зберігаються протягом кількох років, а іноді й довічно.

Для ідентифікації індивідуальних антигенів вірусів та антитіл до них у складних сумішах без попереднього очищення білків використовують імуноблот. Метод поєднує фракціонування білків за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з подальшою імуноіндикацією білків імуноферментним методом. Поділ білків знижує вимоги до хімічної чистоти антигену та дозволяє виявляти індивідуальні пари антиген – антитіло. Таке завдання актуальне, наприклад, при серодіагностиці ВІЛ-інфекції, де хибнопозитивні реакції імуноферментного аналізу обумовлені наявністю антитіл до клітинних антигенів, які присутні внаслідок недостатнього очищення вірусних білків. Ідентифікація антитіл у сироватках хворих до внутрішніх та зовнішніх вірусних антигенів дозволяє визначати стадію захворювання, а при аналізі популяцій – мінливість вірусних білків. Імуноблот при ВІЛ-інфекції застосовують як підтверджуючий тест для виявлення індивідуальних вірусних антигенів та антитіл до них. При аналізі популяцій метод використовують визначення мінливості вірусних білків. Велика цінність методу полягає у можливості аналізу антигенів, що синтезуються за допомогою технології рекомбінантних ДНК, встановлення їх розмірів та наявності антигенних детермінант.

Вірусологічний методвключає два основні етапи: виділення вірусів та їх ідентифікацію. Матеріалами можуть бути кров, інші біологічні та патологічні рідини, біоптати органів та тканин.

Вірусологічне дослідження крові часто проводять із метою діагностики арбовірусних інфекцій. У слині можуть бути виявлені віруси сказу, епідемічного паротиту, простого герпесу. Носоглоточные змиви служать виділення збудників грипу та інших ГРВІ, кору. У змивах з кон'юнктиви виявляють аденовіруси. З фекалій виділяють різні ентеро-, адено-, рео-і ротавіруси.

Для виділення вірусів використовують культури клітин, курячі ембріони, іноді лабораторні тварини. Більшість патогенних вірусів відрізняє наявність тканинної та типової специфічності", наприклад, поліовірус репродукується тільки в клітинах приматів, тому для виділення певного вірусу використовують відповідну культуру тканини. Для виділення невідомого збудника доцільно одномоментно заражати 3-4 культури клітин, припускаючи, що одна з Наявність вірусу в заражених культурах визначають з розвитку специфічної дегенерації клітин, тобто цитопатогенної дії, виявлення внутрішньоклітинних включень, а також на основі виявлення специфічного антигену методом імунофлюоресценції, позитивних реакцій гемадсорбції та гемггдитин. для культивування дуже багатьох вірусів Найчастіше використовують ембріони курей При розмноженні в ембріонах віруси можуть викликати їх загибель (арбовіруси), поява змін на хоріон-алантоїсній оболонці (оспенні віруси) або в тілі ембріона, накопичення в ембріональних рідинах гемагглітіну ) та комплементзв'язуючого вірусного антигену.

Віруси ідентифікують за допомогою імунологічних методів: реакції гальмування гемаглютинації, зв'язування комплементу, нейтралізації, преципітації гелю, імунофлюоресценції.

3.4 Біологічний метод

Біологічний методполягає у зараженні різним матеріалом (клінічним, лабораторним) лабораторних тварин для індикації збудника, а також для визначення деяких властивостей мікроорганізмів, що характеризують їхню патогенність (токсігенність, токсичність, вірулентність). Як лабораторні тварини використовують білих мишей, білих щурів, морських свинок, кроликів та ін.

Відтворення захворювання у тварини - абсолютний доказ патогенності виділеного мікроорганізму (у разі сказу, правця та ін.). Тому біологічна проба на тваринах є цінним і достовірним діагностичним методом, особливо при тих інфекціях, збудники яких у досліджуваних біологічних середовищах організму людини містяться в малих концентраціях і погано або повільно ростуть на штучних середовищах.

3.5 Імунологічний метод

Імунологічний метод(Серологічний) включає дослідження сироватки крові, а також інших біологічних субстратів для виявлення специфічних антитіл та антигенів. Класична серодіагностика заснована на визначенні антитіл до виявленого або передбачуваного збудника. Позитивний результат реакції свідчить про наявність у сироватці крові, що досліджується, антитіл до антигенів збудника, негативний результат вказує на відсутність таких. Виявлення в досліджуваній сироватці крові антитіл до збудника ряду інфекційних хвороб недостатньо для встановлення діагнозу, оскільки воно може відображати наявність постінфекційного або поствакцинального імунітету, тому досліджують «парні» сироватки крові, першу, взяту в перші дні хвороби, і другу, взяту з інтер 10 днів. І тут оцінюють динаміку наростання рівня антитіл.

Діагностично значуще збільшення титру антитіл у досліджуваній сироватці крові не менше ніж у 4 рази щодо початкового рівня. Цей феномен називають сіркоконверсією. При рідкісних інфекційних хворобах, а також вірусних гепатитах, ВІЛ-інфекції та деяких інших факт наявності антитіл свідчить про інфікованість пацієнта та має діагностичне значення.

Крім визначення титру антитіл, під час проведення серологічних досліджень можна встановити ізотип антитіл. Відомо, що при першій зустрічі організму людини з збудником в гострому періоді хвороби виявляють більш швидке наростання антитіл, що належать до IgM, рівень яких досягаючи максимального значення потім знижується. У пізніші терміни хвороби підвищується кількість IgG-антитіл, які довше зберігаються та визначаються в періоді реконвалесценції. При повторній зустрічі з збудником завдяки імунологічній пам'яті реакції гуморального імунітету виявляються швидшою продукцією IgG-анти-тіл, а антитіла класу М виробляються в незначній кількості. Виявлення IgM-антитіл свідчить про наявність поточного інфекційного процесу, а наявність IgG-антитіл - про перенесену в минулому інфекцію або поствакцинальний імунітет.

Враховуючи особливості первинної та вторинної імунної відповіді, аналіз співвідношення IgM- та IgG-антитіл дозволяє в деяких випадках диференціювати стадію інфекційного процесу (розпал захворювання, реконвалесценція, рецидив). Наприклад, у разі вірусного гепатиту А (ГА) надійним методом діагностики є визначення анти-HAV IgM-антитіл у сироватці крові. Їх виявлення свідчить про поточну або нещодавно HAV-інфекцію.

Серологічне дослідження виявлення антитіл при інфекційних захворюваннях є більш доступним методом лабораторної діагностики, ніж виділення збудника. Іноді позитивна серологічна реакція є єдиним доказом зустрічі та взаємодії організму із збудником відповідного інфекційного захворювання. Крім того, ряд захворювань із подібною клінічною картиною (наприклад, рикетсіози, ентеровірусні інфекції) можуть бути диференційовані лише серологічно, що відображає значення серологічних методів у діагностиці інфекційних хвороб.

Курсова робота

"Методи клінічної вірусології"

Вступ

Лабораторну діагностику вірусних інфекцій проводять переважно за допомогою електронної мікроскопії, чутливих культур клітин та імунологічними методами. Як правило, для встановлення діагнозу вибирають якийсь один метод залежно від стадії вірусної інфекції. Так, наприклад, усі три підходи можуть виявитися корисними при діагностиці вітряної віспи, проте успішне застосування мікроскопії та методу культури клітин залежить від можливості збирання задовільних зразків на відносно ранньому етапі захворювання.

Великою мірою успіх вірусної діагностики залежить і від якості отриманих зразків. З цієї причини самі співробітники лабораторії мають брати безпосередню участь у збиранні необхідних зразків. Характеристики зразків, а також способи їх доставки до лабораторії описані Леннетом, Шмідтом, Крістом та ін.

Більшість реактивів та інструментів, що використовуються у лабораторній діагностиці, можна придбати у різних фірм. Найчастіше той самий реактив випускається одночасно кількома фірмами. Тому ми не вказували окремі фірми, крім тих випадків, коли реактив поставляється тільки однією фірмою. В інших випадках слід звернутися до загального переліку постачальників, зазначених у табл. 1.

Ми не ставили собі за мету всебічний опис усіх наявних в даний час методів діагностики вірусних інфекцій людини. Насамперед ми охарактеризували основні методи. У міру накопичення досвіду самостійної роботи ці основні методи можна буде використовувати для більш складних завдань.

1. Електронна мікроскопія

Для електронно-мікроскопічної діагностики вірусних інфекцій можна використовувати тонкі зрізи ураженої тканини. Найчастіше матеріалом для електронної мікроскопії є фекалії або рідина

Таблиця 1. Список фірм, що постачають реактиви та обладнання

везикул, що характеризують деякі хвороби, наприклад, вітряну віспу. При аналізі такого матеріалу віруси можна виявити за допомогою негативного фарбування, що веде до окреслення компонентів віріона електронно-щільним матеріалом. Метод ефективний при високій концентрації вірусу в досліджуваних зразках, як, наприклад, у фекаліях чи везикулярній рідині. У тих випадках, коли вміст вірусних частинок у зразках невеликий, ймовірність виявлення вірусу можна збільшити, концентруючи вірус ультрацентрифугуванням або агрегуючи його специфічними антитілами. Останній метод зручний ідентифікації вірусів. Тут ми опишемо електронно-мікроскопічний метод діагностики ротавірусної інфекції та метод імуноелектронної мікроскопії на прикладі виявлення специфічних антитіл до парвовірусів. Докладніше методи електронної мікроскопії викладені Філдом.

2.1 Пряме електронно-мікроскопічне дослідження фекалій

1. Кінець пастерівської піпетки занурюють у фекалії та набирають достатню кількість матеріалу для отримання мазка розміром 1 см.

2. Ресуспендують фекальний мазок у електронно-мікроскопічній фарбі для негативного контрастування до отримання напівпрозорої суспензії. Фарба для негативного контрастування являє собою 2% розчин фосфорно-вольфрамової кислоти в дистильованій воді.

3. Для отримання електронно-мікроскопічного препарату крапельку суспензії поміщають на сітку для електронного мікроскопування, покриту вуглецевою плівкою. Під час цієї операції сітку тримають кількома тонкими пінцетами.

4. Препарат залишають повітря на 30 з.

5. Надлишки рідини видаляють, торкаючись краю скла фільтрувальним папером.

6. Препарат висушують на повітрі.

7. У разі необхідності життєздатний вірус інактивують, опромінюючи обидві сторони сітки ультрафіолетом з інтенсивністю 440 000 мкВт-с/см 2 . При цьому використовують короткохвильову ультрафіолетову лампу з фільтром. Лампа повинна бути на відстані 15 см від сітки; час опромінення кожної сторони – 5 хв.

8. Віріони ротавірусів можна охарактеризувати під трансмісійним електронним мікроскопом зі збільшенням від 30000 до 50000.

2.2 Імуноелектронна мікроскопія

Описаний нижче метод імуноелектронної мікроскопії є лише одним із безлічі подібних імунологічних методів. Для дослідження вірусоспецифічних антитіл, крім того, використовують метод, що передбачає зв'язування з мікроскопічною сіткою білка А. Робочу концентрацію антивірусних антитіл визначають методом спроб та помилок в діапазоні від 1/10 до 1/1000. Зазначена нами концентрація зазвичай використовується в рутинній роботі. Для отримання оптимальних результатів взаємодії антитіл з вірусом так само титрують сироватку, що містить парвовірус.

1. 10 мкл антисироватки до парвовірусу людини у 100 разів розводять PBS. Розчин нагрівають у водяній бані до 56°С.

2. Звичайним способом розплавляють 10 мл 2% агарози в PBS і охолоджують до 56 °С у водяній бані.

3. При 56 °С змішують 1 мл розведеної антисироватки з 1 мл 2% агарози.

4. Переносять по 200 мкл отриманої суміші дві лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агароз дають застигнути при кімнатній температурі. Планшет можна зберігати при 4°С протягом кількох тижнів, якщо заклеїти його клейкою стрічкою.

6. У лунку, що містить суміш агарози з антисироваткою, вносять 10 мкл сироватки, що містить парвовірус.

7. Сітку для електронної мікроскопії із заздалегідь приготованим вуглецево-формваровим покриттям кладуть менш блискучою стороною на краплю сироватки.

8. Сітку витримують 2 години при 37 °С у вологій камері.

9. Тонким пінцетом дістають сітку і наносять краплю 2% фосфорно-вольфрамової кислоти на ту поверхню сітки, яка знаходилася в контакті з сироваткою.

10. Через 30 с відмивають надлишок фарби, висушують препарат та інактивують вірус.

Агреговані вірусні частинки досліджують під трансмісійним електронним мікроскопом зі збільшенням від 30000 до 50000.

3. Ідентифікація вірусних антигенів

Віруси, що знаходяться в тканинах або тканинних рідинах, можна ідентифікувати вірусоспецифічними білками за допомогою реакції антиген - антитіло. Продукт реакції антиген - антитіло тестують за міткою, яку вводять або безпосередньо в антивірусні антитіла, або антитіла, спрямовані проти вірусоспецифічних антитіл. Антитіла можна позначити флуоресцеїном, радіоактивним йодом або ферментом, що розщеплює субстрат із зміною забарвлення. Крім того, для ідентифікації вірусу використовують реакцію гемаглютинації. У повсякденній практиці описані методи застосовують головним чином виявлення в крові антигенів вірусу гепатиту В і пошуку антигенів різних вірусів, що викликають різні респіраторні захворювання.

В даний час багатьма фірмами випускаються еритроцитарні, радіоактивні та ферментативні діагностикуми, у тому числі для виявлення вірусу гепатиту В. Ми не вважаємо за доцільне викладати методи роботи із зазначеними діагностикумами: цілком достатньо слідувати інструкціям, що додаються. Нижче ми зупинимося на імунофлуоресцентному методі ідентифікації респіраторно-синцитіального вірусу носоглоткових виділеннях.

3.1 Ідентифікація респіраторно-синцитіального вірусу у носоглоткових виділеннях методом імунофлуоресценції

Метод одержання препаратів носоглоткових виділень описаний Гарднером та Мак-Квіліном. У лабораторних умовах ця операція виконується у два етапи. Спочатку готують мазок із носоглоткового слизу на предметному склі. Отримані мазки можна зберігати у фіксованому стані при -20 ° С протягом багатьох місяців. На другому етапі фарбують мазки для виявлення антигену респіраторно-синцитіального вірусу. З цією метою використовують метод непрямої імунофлуоресценції.

3.1.1 Приготування препаратів носоглоткових виділень

1. Слиз зі спеціальних щипців змивають 1-2 мл PBS і переносять у центрифужну пробірку.

2. Центрифугують 10 хв при 1500 об/хв у настільній центрифузі.

3. Надосадову рідину зливають.

4. Осад клітин обережно ресуспендують у 2-3 мл PBS до отримання гомогенної суспензії. Для цього використовують широкогорлу пастерівську піпетку.

5. Отриману суспензію переносять у пробірку.

6. До суспензії додають 2-4 мл PBS і перемішують піпетуванням. Великі згустки слизу видаляють.

7. Центрифугують 10 хв при 1500 об/хв у настільній центрифузі.

8. Супернатант зливають, осад ресуспендують у такому обсязі PBS, щоб одержана суспензія легко відокремлювалася від стінок пробірки.

9. Отриману суспензію завдають на розмічене предметне скло.

10. Скло підсушують на повітрі.

Фіксують в ацетоні 10 хв. при 4°С.

12. Після фіксації скло підсушують знову на повітрі.

13. Отримані препарати забарвлюють негайно або зберігають при -20 °С.

3.1.2. Методика фарбування

1. Роздруковують та розводять у PBS комерційну антисироватку проти РСВ до рекомендованої робочої концентрації.

2. Пастерівської піпетки наносять одну краплю антисироватки на приготовлений препарат.

3. Препарат поміщають у вологу камеру.

4. Препарат інкубують 30 хв. при 37 °С.

5. Зразки обережно відмивають PBS від надлишку антитіл у спеціальному резервуарі.

6. Відмивання зразків проводять у трьох змінах PBS по 10 хв у кожній.

7. Зразки висушують, видаляють надлишок PBS фільтрувальним папером та висушують на повітрі.

Етіологічна діагностика вірусних захворювань проводиться вірусологічним, вірусоскопічним, серологічним та молекулярно-генетичним методами. Три останні методи можуть бути використані як експрес-діагностичні.

Вірусологічний метод діагностики.

Кінцевою метою методу є ідентифікація вірусів до виду чи серологічного варіанта.Вірусологічний метод включає кілька етапів:

1) відбір матеріалу на дослідження;

2) обробку вірусомісткого матеріалу;

3) зараження матеріалом чутливих живих систем;

4) індикацію вірусів у живих системах;

5) титрування виділених вірусів;

6) ідентифікацію вірусів у імунних реакціях.

1. Відбір матеріалу для дослідження .

Проводиться в ранні терміни захворювання при дотриманні правил, що запобігають контамінації матеріалу сторонньою мікрофлорою та інфікуванням медичного персоналу. Для попередження інактивації вірусів при транспортуванні матеріалу, він поміщається у вірусне середовище транспортування (ВТС), що складається з збалансованого сольового розчину, антибіотиків і сироваткового альбуміну. Транспортується матеріал у спеціальному контейнері з термоізоляцією та закритими пластиковими пакетами, що містять лід. При необхідності матеріал зберігають при -20С. Кожен зразок матеріалу для дослідження повинен мати маркування та етикетку із зазначенням прізвища хворого, типу матеріалу, дати його забору, розгорнутий клінічний діагноз та інші відомості.

Залежно від характеру захворювання, матеріалом для дослідження можуть бути:

1) змив з носової частини глотки і мазок з глотки;

2) спинномозкова рідина;

3) кал та ректальні мазки;

6) рідина із серозних порожнин;

7) мазок із кон'юнктиви;

8) вміст везикул;

8) секційний матеріал.

Для отримання змиву із ротоглотки використовують 15-20 мл ВТС. Хворий ретельно протягом 1 хвилини полоще горло ВТС і збирає змив у стерильний флакон.

Мазок із задньої стінки глотки беруть стерильним ватним тампоном, натискаючи на корінь язика шпателем. Тампон поміщають у 2-3 мл ВТС, обполіскують та віджимають.

Спинномозкову рідину одержують при спинномозковій пункції. 1-2 мл спинномозкової рідини поміщають у стерильний посуд і доставляють у лабораторію.

Проби калу відбирають протягом 2-3 днів у стерильні флакони. З отриманого матеріалу готують 10% суспензію із використанням розчину Хенкса. Суспензію центрифугують при 3000 об/хв, збирають надосадову рідину, вносять до неї антибіотики та поміщають у стерильний посуд.

Кров, отриману при венепункції обсягом 5-10 мл, дефібринують шляхом додавання гепарину. Цілісну кров не заморожують, антибіотики не додають. Для отримання сироватки проби крові витримують у термостаті при 37 С протягом 60 хвилин.

Рідина із серозних порожнин отримують при їх пункції у кількості 1-2 мл. Рідина використовується одразу або зберігається в замороженому стані.

Мазок із кон'юнктиви беруть стерильним тампоном і поміщають у ВТС, після чого проводять центрифугування взятого матеріалу та його заморожування.

Вміст везикул відсмоктують шприцом з тонкою голкою та поміщають у ВТС. Матеріал надсилається до лабораторії у вигляді висушених мазків на предметних стеклах або в запаяних стерильних капілярах або ампулах.

Секційний матеріал відбирають у можливо ранні терміни, дотримуючись правил асептики. Для вибору кожної проби використовують окремі набори стерильних інструментів. Кількість тканин, що відбираються, становить 1-3 г, які поміщають у стерильні флакони. Спочатку беруть проби позапорожнинних органів (мозок, лімфатичні вузли та ін.). Тканини грудної порожнини беруть до розтину черевної порожнини. Отримані зразки тканин розтирають у ступці з додаванням стерильного піску та стерильного розчину натрію хлорид, після чого центрифугують матеріал. Надосадову рідину збирають у флакони, додають антибіотики. Матеріал для вірусологічного дослідження використовується відразу або зберігається при -20?

2. Обробка вірусомісткого матеріалу.

Проводиться з метою визволення матеріалу від супутньої бактеріальної мікрофлори. Для цього використовуються фізичні та хімічні методи.

Фізичні методи:

1) фільтрування через різні бактеріальні фільтри;

2) центрифугування.

Хімічні методи:

1) обробка матеріалу ефіром у випадках виділення вірусів, які не мають суперкапсиду;

2) додавання до матеріалу суміші гептану та фреону;

3) внесення антибіотиків (пеніцилін – 200-300 ОД/мл; стрептоміцин – 200-500 мкг/мл; ністатин – 100-1000 ОД/мл).

3. Зараження матеріалом чутливих живих систем.

1) лабораторні тварини;

2) курячі ембріони;

3) культури органів;

4) культури тканин.

Лабораторні тварини. Використовуються білі миші, морські свинки, хом'яки, кролики та ін. Білі миші найбільш чутливі до великої кількості видів вірусів. Спосіб зараження тварин визначається тропізмом вірусу до тканин. Зараження у мозок застосовується при виділенні нейротропних вірусів (віруси сказу, поліовіруси та ін.). Інтраназальне зараження проводять виділення збудників респіраторних інфекцій. Широко використовуються внутрішньом'язовий, внутрішньовенний, внутрішньочеревний, підшкірний та інші методи зараження. Захворілих тварин присипляють ефіром, розкривають та виробляють забір матеріалу з органів та тканин.

Курячі ембріони. Широко доступні та прості в роботі. Застосовують курячі ембріони віком від 5 до 14 днів. Перед зараженням курячі ембріони овоскопують: визначають їхню життєздатність, відзначають на шкаралупі кордон повітряного мішка та місце розташування ембріона («темне око» ембріона). Робота з курячими ембріонами проводиться у стерильному боксі стерильними інструментами (пінцети, шприци, ножиці, спис та ін.). Після виконання фрагмента роботи інструменти занурюють у 70% етиловий спирт і перед наступною маніпуляцією пропалюють. Перед зараженням шкаралупу курячого ембріона протирають запаленим спиртовим тампоном та спиртовим розчином йоду. Об'єм досліджуваного матеріалу, що вводиться в ембріон становить 0,1-0,2 мл. Для виділення вірусів із одного матеріалу використовують не менше 4 курячих ембріонів.

заняття № 2 7

ТЕМА: ВЗАЄМОДІЯ ВІРУСІВ З ЧУДОВИМИ КЛІТКАМИ. КУЛЬТИВУВАННЯ. СПОСОБИ ІНДИКАЦІЇта ідентифікації.ПРОТИВІРУСНИЙ ІМУНІТЕТ.

ПЕРЕЛІК КОНТРОЛЬНИХ ПИТАНЬ

1. Віруси, природа та походження. Історія відкриття. Етапи розвитку вірусології. Поняття про віріон, його структура. Хімічний склад та властивості вірусів.

2. Принципи класифікації вірусів – критерії. Сімейства РНК і ДНК-вірусів (контрольна).

3. Тропізм вірусів. Взаємодія вірусів із чутливими клітинами – фази.

4. Культивування вірусів. Індикація та ідентифікація вірусів при культивуванні їх на клітинних культурах та курячому ембріоні. Клітинні культури, лінії клітин, одержання, умови культивування.

5. Класифікація вірусних інфекцій: а) лише на рівні клітини; б) лише на рівні організму.

6. Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Прямі методи дослідження клінічного матеріалу (виявлення вірусів, вірусних антигенів чи вірусних ПК). Вірусологічний метод діагностики. Серодіагностика вірусних інфекцій.

7. Противірусний імунітет – фактори. Видова резистентність. Неспецифічні фактори антивірусного захисту (інгібітори, інтерферон, комплемент, фагоцитоз). Набутий імунітет (гуморальні та клітинні механізми).

8. Принципи специфічної профілактики та терапії вірусних інфекцій: вакцини, імунні сироватки (імуноглобуліни), інтерферони, етіотропна хіміотерапія.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ

1. Для експрес-діагностики використовують:

а) визначення вірусного антигенуу досліджуваному матеріалі за допомогою діагностичних противірусних сироваток у реакціях: РІФ, ІФА, РІА, зустрічного імуноелектрофорезу (ВІЕФ), реакції пасивної гемаглютинації (РПГА), реакції гальмування гемаглютинації (РТГА) та ін;

в) виявлення віріоніву патологічному матеріалі за допомогою електронної мікроскопії або ІЕМ.

г) виявлення геномів вірусумолекулярно-генетичними методами: ПЛР; молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот за допомогою мічених зондів

2. Вірусологічний метод

Основні етапи:

1. Забір досліджуваного матеріалу.

2.Вибір за принципом цитотропізму та отримання чутливої ​​тест-системи, визначення її життєздатності.

3. Зараження обраної системи.

4.Індикація вірусу на підставі виявлення його нуклеїнової кислоти, антигенів, гемаглютиніну, ЦПД, включень.

5. Ідентифікація та титрування вірусу проводиться на підставі:

а) визначення антигенів вірусу за допомогою імунологічних реакцій (РІФ, ІФА, РПГА, РСК, РН, ВІЕФ та ін.); б) патогістологічного дослідження органів та тканин; в) ЦПД; г) клінічних симптомів, біологічних проб (кератоконьюнктивальна та ін.).

Вірусологічний метод (схема)

Досліджуваний матеріал (фекалії, носоглоткові змиви, секційний матеріал та ін.)

Обробка антибіотиками для придушення бактеріальної та грибкової

мікрофлори, центрифугування, фільтрація

Зараження серії

Курячих ембріонів

Культур клітин

Тварин

Індикація вірусів за такими феноменами

Відставання у розвитку,

загибель, зміна

оболонок ембріона, РДА

ЦПД, освіта бляшок, РІФ, РГадс, інтерференція

Захворювання, загибель,

гістологічні зміни

у тканинах, включення

Титрування виділеного вірусу; вибір робочої дози.

Титр вірусу- максимальне розведення вірусомісткого матеріалу, в якому ще спостерігається очікуваний ефект (ЦПД, РДА, загибель тварини).

Ідентифікація виділеного вірусуу реакціях нейтралізації, РТГадс, РСК, пригнічення бляшкоутворення та ін. з діагностичними сироватками. Вид (тип) вірусувизначається по нейтралізації специфічного ефекту вірусу відповідною імунною сироваткою.

Примітка: титрування та ідентифікація вірусу проводиться з використанням того самого феномену.

Культивування вірусів