Реакція непрямої чи пасивної гемаглютинації (РНГА чи РПГА) більш чутлива та специфічна, ніж реакція аглютинації. Цю реакцію також використовують у двох напрямках.

1) Для виявлення антитіл у сироватці крові хворого застосовуються еритроцитарні діагностикуми, у яких антиген адсорбований на поверхні оброблених таніном еритроцитів. Щодо цієї реакції найчастіше вживають термін РПГА.

Досліджувану сироватку розводять у лунках пластмасових планшетів та додають еритроцитарний діагностикум. При позитивній реакції з'являється тонка плівка по стінках лунки у вигляді "мереживного парасольки", при негативній реакції - щільний осад еритроцитів у вигляді "гудзика".

2) Для виявлення токсинів та бактеріальних антигенів у досліджуваному матеріалі застосовують антильні еритроцитарні діагностикуми, отримані шляхом адсорбції антитіл на еритроцитах. Щодо цієї реакції найчастіше вживається термін РНГА. Наприклад, за допомогою антільних діагностикумів виявляють антиген палички чуми, дифтерійний екзотоксин, ботулінічний екзотоксин.

Реакція Кумбса (аптіглобуліновий тест)

Реакцію застосовують для виявлення неповних антитіл, наприклад антитіл до резус-фактору. До Rh + еритроцитів додають сироватку, що досліджується, в якій передбачається присутність неповних антитіл до резус-фактору. Приєднавшись до еритроцитів, неповні антитіла не викликають аглютинації, оскільки мають лише один активний центр. Потім додають антиглобулінову сироватку, що містить антитіла до глобулінів людини. Поєднавшись з неповними антитілами, антиглобулінова сироватка викликає аглютинацію еритроцитів.

Реакція преципітації

Сутність реакції полягає в осадженні (преципітації) антигену під дією специфічних антитіл. Для отримання видимої реакції потрібна присутність електроліту. Антигеном реакції преципітації є молекулярно-дисперсні речовини.

Реакція кільцепреципітаціїставиться у вузьких преципітаційних пробірках. У пробірку наливають імунну сироватку, її обережно нашаровують досліджуваний матеріал. За наявності в ньому антигену на межі двох рідин утворюється непрозоре кільце преципітату.

Реакцію застосовують у судовій медицині для визначення видової приналежності білків у кров'яних плямах, спермі і т.д.; для визначення антигену при діагностиці сибірки (реакція Асколі), менінгіту та інших інфекцій; у санітарно-гігієнічних дослідженнях – для встановлення фальсифікації харчових продуктів. Імунні преципітуючі сироватки одержують шляхом імунізації тварин відповідним антигеном. Наприклад, сироватка, преципітуюча білок людини, отримана шляхом імунізації кролика білком людини. Титр преципітуючої сироватки – це найбільше розведення антигену, з яким вона дає реакцію. Сироватку зазвичай застосовують нерозведеною або у розведенні 1:5.

Реакція преципітації в агаровому геліпроводиться декількома методами. Це реакція подвійної імунодифузії, реакція радіальної імунодифузії, реакція імуноелектрофорезу.

Реакція подвійної імунодифузії(По Оухтерлоні). Розтоплений агаровий гель виливають у чашку Петрі і після затвердіння у ньому вирізують лунки. В одні лунки поміщають антиген, в інші - імунні сироватки, які дифундують в агар, утворюють у місці зустрічі преципітату у вигляді білих смуг.

Реакція радіальної імунодифузії(По Манчіні). У розтоплений агаровий гель вносять імунну сироватку, виливають у чашку. Після застигання агару у ньому вирізують лунки і поміщають у яких антигени, які, дифузуючи в агар, утворюють кільцеві зони преципітації навколо лунок. Чим вище концентрація антигену, тим більший діаметр кільця. Реакцію застосовують, наприклад, визначення в крові імуноглобулінів різних класів. Імуноглобуліни класів IgG, IgM, IgA діють у цій реакції як антигени, а антитіла проти них містяться в специфічних монорецепторних сироватках.

Імуноелектрофорез.В агаровому гелі проводять електрофорез білкових антигенів. У канавку, яка йде паралельно напрямку руху білків, вносять сироватку, що преципітує. Антигени та антитіла дифундують в агар, і в місці їх зустрічі утворюються лінії преципітації.

Реакції імунного лізису

Антиген (еритроцити або бактерії), з'єднавшись зі специфічними антитілами, утворює імунний комплекс, до якого приєднується комплемент (С1), і відбувається активація комплементу класичним шляхом. Активований комплемент лізує еритроцити (гемоліз) чи бактерії (бактеріоліз). Реакція бактеріолізу застосовується для ідентифікації холерного вібріона.

Реакція гемолізу.Антигеном у реакції служать еритроцити, антитіла (гемолізини) містяться в гемолітичній сироватці. Гемолізини приєднуються до еритроцитів, відбувається активація комплементу, що лізує еритроцити. Мутна завись еритроцитів перетворюється на прозору яскраво-червону рідину – «лакову кров». Оскільки реакція гемолізу відбувається лише у присутності комплементу, її застосовують як індикаторну виявлення комплементу.

Реакція локального гемолізу у гелі(реакція Ерне) – варіант реакції гемолізу. Служить для визначення кількості антитілоутворюючих клітин (АОК) у селезінці та лімфатичних вузлах.

Розтоплений агаровий гель змішують із суспензією клітин селезінки та еритроцитами і після застигання агару додають комплемент. Навколо кожної клітини, що продукує гемолізину, утворюється зона гемолізу. За кількістю таких зон визначають кількість клітин, які продукують гемолізини.

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)

Використання сорбованих діагностичних препаратів засноване на принципі імунологічного розпізнавання поверхневих структур, що постійно реалізується в природі. З цієї точки зору немає принципових відмінностей між використанням, наприклад мікробної клітини або штучного носія, навантажених антигеном (антитілами). Як основа сорбованих препаратів застосовуються різні носії - мікробні клітини, еритроцити, латекс, бентонін, холестерин, сефадекс, дерматол, активоване вугілля, суперечки грибів тощо.

Після робіт А.Т.Кравченко (1945) найбільшого поширення як носій антигену або антитіл набули позбавлені життєздатності та фіксовані різними хімічними реагентами еритроцити. На принципі використання як носій антигену еритроцитів (як нативних, так і фіксованих) широкого поширення набула реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації.

Пропозиція про використання реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) у діагностичних цілях виникла на базі попередньо розвинених знань про високу сорбційну активність еритроцитів. Порівняно з багатьма іншими носіями антигенів та антитіл у реакції непрямої гемаглютинації еритроцити мають певні переваги. По-перше, в ізотонічних сольових розчинах вони утворюють досить стійке зчеплення і осідають за короткий час. По-друге, еритроцити одного й того ж виду тварин однакові за розміром. І, нарешті, еритроцити порівняно легко безпосередньо або внаслідок спеціальної обробки приєднують різні серологічно активні компоненти.

Створення еритроцитарних діагностикумів із стабілізованих еритроцитів дозволяє подолати ті труднощі, які виникають під час використання нативних еритроцитів.

При дослідженні еритроцитів, оброблених різними фіксуючими речовинами, встановлені деякі їх загальні властивості:

За морфологією вони практично не відрізняються від свіжих;

Не гемолізуються в гіпотонічних розчинах, у воді та після заморожування-відтавання;

Можуть бути ліофільно висушені;

Їхні поверхневі структури зберігають здатність хімічно модифікуватися (наприклад, таніном, діазосполуками) і вступати в реакцію з антигенами та антитілами.

Головний критерій якості фіксованих еритроцитів – можливість їх використання для отримання сенсибілізованих препаратів за відсутності неспецифічного склеювання у рідинах, що стабілізують.

Підготовка поверхні еритроцитів для підвищення сорбційної здатності до антигенів має важливе значення при конструюванні діагностичних препаратів. Особливо широкого поширення набула обробка еритроцитів таніном.

Під його впливом змінюються антигенні властивості еритроцитів (проникність, швидкість осідання), підвищується їхня стійкість до гемолітичного впливу деяких жирних кислот. Досягається, проте, головне - танізовані еритроцити мають значно більшу сорбційну ємність білків, що широко використовується в даний час при виготовленні високоякісних антигенних і антитільних діагностикумів.

Поряд із танізацією еритроцитів, для виготовлення еритроцитарних діагностикумів та підготовки носія антигену застосовуються такі хімічні реагенти, як бромелін, тріопсин, перйодат калію, які також модифікують мембрани еритроцитів.

Після підготовки поверхні еритроцитів йде найбільш важливий процес – процес гемосенсибілізації – остаточний етап виготовлення еритроцитарних діагностикумів.

Для зміцнення зв'язку між носієм та антигеном застосовуються різні кон'югуючі речовини - бісдіазобензидин, дифлуородінітробензин, хлористий ціан, хлористий і оцтовокислий кадмій, хлорид брому, формальдегід, глютаровий альдегід, бромціан, бромціан.

Використання кон'югуючих речовин сприяє усуненню недоліків, які мають танізовані еритроцити, що застосовуються для сенсибілізації без кон'югуючих речовин.

Найбільш широке застосування знайшли такі кон'югуючі речовини як хлорид хрому, глутаровий альдегід, діазоль чорний С, амідол. Процес сенсибілізації за допомогою хлориду хрому відбувається дуже швидко – від 4 до 10 хв., що привертає увагу дослідників. При цьому використовуються концентрації хлориду хрому від 0,05 до 2%, pH - не нижче 5,0 при температурі реакційної суміші 20-250 С. У процесі сенсибілізації хлоридом хрому активізуються карбоксильні групи білків мембрани еритроцитів. В результаті цього утворюється ковалентний зв'язок між мембраною еритроцитів та сенситином.

Реакція непрямої гемаглютинації має високу специфічність, оскільки склеювання еритроцитів настає в результаті взаємодії антигену з антитілами, адсорбованими на еритроцитах. Відмінною її особливістю є висока чутливість: у ній виявляється 0,02-0,05 мкг антитіл білка. За чутливістю вона значно перевершує реакції імунодифузії, імунофлуоресценції, радіальної імунодифузії, зв'язування комплементу, нейтралізації. РНГА менш чутлива, ніж методи радіоімуноелектрофорезу, визначення кількості білка радіоактивних антитіл в імуносорбенті, імуноферментного аналізу.

До переваг РНГА слід віднести досить високу відтворюваність, простоту виконання, потребу в мінімальних кількостях інгредієнтів, особливо при використанні мікрометоду.

РНГА в останні роки знайшла широке застосування при діагностиці інфекційного ринотрахеїту, діареї, аденовірусної інфекції, рота- та коронавірусної інфекції, парагрипу – 3 та респіраторно – синцитіальної інфекції.

Наводимо приклад виготовлення та застосування еритроцитарного діагностикуму для виявлення антитіл до рота- та коронавірусної інфекції.

Методика приготування античних діагностикумів для виявлення рота- та коронавірусних антигенів у РНГА полягає в наступному: одержання суспензії еритроцитів; фіксація їх акролеїнів; тонізація, що дозволяє отримати стабільну сорбцію необхідного білка на еритроцитах; сенсибілізація танізованих еритроцитів імуноглобулінами; визначення специфічності підготовленого діагностикуму. Приготування суспензії еритроцитів здійснюється шляхом відбору крові клінічно здорового барана у колбу зі скляними намистами. Після дефібринування крові еритроцити повинні бути відмиті 3-5 разів ізотонічним (0,9%-ним) розчином хлориду натрію шляхом центрифугування протягом 15-20 хв при 400g.

З метою стабілізації еритроцитів проводиться їхня обробка акролеїном. Як відомо, його дія трохи м'якша, ніж формальдегіду, і забезпечує стабільність і більш високу активність еритроцитів. Для цього рівні об'єми 10% суспензії еритроцитів змішують з 0,2%-ним розчином акролеїну, приготованого на фосфатному буферному розчині (ФБР) з рН 7,2. Отриману суспензію витримують протягом 30 хв при 37°З ретельно перемішуючи, з подальшим звільненням від акролеїну багаторазовим центрифугуванням протягом 5 хв при 600-800g до повного зникнення специфічного запаху. Перевага приготованих таким чином еритроцитів полягає в тому, що вони заготовляються про запас, можуть тривалий час зберігатися, не піддаючись гемолізу.

Надалі стабілізовані еритроцити в 10% концентрації витримують при 2-4 °С у ФБР з рН 7,2 протягом двох місяців.

Для підвищення сорбційної здатності та осадження еритроцитів необхідно провести їх тонізацію шляхом змішування рівних частин 10% суспензії відмитих еритроцитів і розчину таніну на ФБР і рН 7,2 у розведенні 1:30000. Суміш ретельно перемішують і витримують при 370 °C протягом 15 хв, після чого еритроцити ретельно відмивають від таніну двічі у ФБР з рН 7,2 і тричі ізотонічним розчином хлориду натрію з рН 7,2-7,4.

Оптимальним терміном, що гарантує отримання якісних еритроцитарних діагностикумів, є їх сенсибілізація протягом 24-48 годин після їх обробки таніном.

У процесі виготовлення діагностикумів як розчинник і консервант використовують 0,3%-ний фенолізований ізотонічний розчин натрію хлориду з 0,1%-ною нормальною кролячою або кінською сироваткою, попередньо інактивованою при 56°С протягом 30 хв і адсорбованої нормальними еритро 37°С протягом 30 хв.

Сенсибілізацію танізованих еритроцитів слід здійснювати гіперімунною сироваткою відповідно проти рота- і коронавірусів великої рогатої худоби (яка виробляється у Всеросійському НДІ експериментальної ветеринарії ім. Я.Р. Коваленко). При цьому сенсибілізуюча доза (концентрація білка) антиротавірусної імунної сироватки становить 280 мкг/мл, а до коронавірусу імунної сироватки -260 мкг/мл.

Сенсибілізацію проводять, змішуючи рівні обсяги танізованих еритроцитів і попередньо прогрітої протягом 30 хв при 560С імунної сироватки оптимальної концентрації. Крім того, вносять 3 частини ізотонічного розчину хлориду натрію з рН 7,2 і 5 частин 0,1%-ного розчину хлориду хрому. Суміш періодично помішуючи, витримують при кімнатній температурі протягом 5 хв. Після закінчення зазначеного часу суміш ретельно відмивають з використанням ФБР з рН 7,2, а потім приготовлені еритроцитарні діагностикуми ресуспендують у консерванті до 1% концентрації. Приготовлений діагностикум зберігає свої основні якості протягом 8 міс., За умови зберігання його при 4°С.

На всіх етапах виготовлення діагностикумів здійснюють контроль на самоаглютинацію. Специфічність приготовлених діагностикумів визначають шляхом постановки РНГА, де як антигени використовували стандартні діагностикуми вірусів ІРТ, ПГ - 3, аденовірусів, вірусної діареї, а також антигенів рота-і коронавірусів.

При постановці РНГА готують послідовні подвійні розведення досліджуваного віруссодержащего матеріалу (20-50% суспензія проб фекалій), а потім в кожну лунку вносять рівний обсяг еритроцитарного діагностикуму. Плашки слід ретельно струсити кілька разів, залишити при кімнатній температурі до осідання еритроцитів у контролі. Показник позитивної реакції - аглютинація еритроцитарного діагностикуму з інтенсивністю аглютинації на 2+ титрі 1:4 і вище.

Реакція непрямої чи пасивної гемаглютинації (РПГА)

Ця реакція за чутливістю перевищує реакцію аглютинації та її використовують при діагностиці інфекцій, спричинених бактеріями, рикетсіями, найпростішими та іншими мікроорганізмами.

РПГА дозволяє виявити невелику концентрацію антитіл.

У цій реакції беруть участь таннізовані баранячі еритроцити або еритроцити людини з кров'ю I групи, сенсибілізовані антигенами або антитілами.

Якщо в сироватці, що досліджується, визначаються антитіла, то використовуються еритроцити, сенсибілізовані антигенами (еритроцитарний діагностикум).

У деяких випадках, при необхідності визначення різних антигенів у досліджуваному матеріалі використовують еритроцити, сенсибілізовані імунними глобулінами.

Результати РПГА враховують характером осаду еритроцитів.

Позитивним вважають результат реакції, у якому еритроцити поступово покривають все дно пробірки (перевернутий парасольку).

При негативної реакції еритроцити як маленького диска (гудзик) розташовуються у центрі дна пробірки.

Реакція аглютинації (РА)

Завдяки своїй специфічності, простоті постановки та демонстративності, реакція аглютинації набула широкого поширення в мікробіологічній практиці для діагностики багатьох інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів (реакція Відаля), висипного тифу (реакція Вейгля) та ін.

Реакція аглютинації заснована на специфічності взаємодії антитіл (аглютинінів) з цілими мікробними або іншими клітинами (аглютиногенами). Внаслідок такої взаємодії утворюються частинки - агломерати, що випадають в осад (аглютинат).

У реакції аглютинації можуть брати участь як живі, так і вбиті бактерії, спірохети, гриби, найпростіші, рикетсії, а також еритроцити та інші клітини.

Реакція протікає дві фази: перша (невидима) - специфічна, з'єднання антигену і антитіл, друга (видима) - неспецифічна, склеювання антигенів, тобто. утворення аглютинату.

Аглютинат утворюється при з'єднанні одного активного центру двовалентного антитіла з групою детермінантної антигену.

Реакція аглютинації, як будь-яка серологічна реакція, протікає у присутності електролітів.

Зовнішній прояв позитивної реакції аглютинації має двоякий характер. У безжгутикових мікробів, що мають лише соматичний О-антиген, відбувається склеювання безпосередньо самих мікробних клітин. Така аглютинація називається дрібнозернистою. Він відбувається протягом 18 – 22 годин.

У джгутикових мікробів є два антигени - соматичний О-антиген і джгутиковий Н-антиген. Якщо клітини склеюються джгутиками, утворюються великі пухкі пластівці і така реакція аглютинації називається крупнозернистою. Вона настає протягом 2 – 4 годин.

Реакцію аглютинації можна ставити як з метою якісного та кількісного визначення специфічних антитіл у сироватці крові хворого, так і з метою визначення видової приналежності виділеного збудника. гемаглютинація мікробіологічний інфекційний

Реакцію аглютинації можна ставити як у розгорнутому варіанті, що дозволяє працювати з сироваткою, розведеної до діагностичного титру, так і у варіанті постановки орієнтовної реакції, що дозволяє в принципі виявити специфічні антитіла або визначити видову приналежність збудника.

Реакцію проводять виявлення антигенів збудників у досліджуваному матеріалі, додаючи у ньому імунну сироватку. За наявності гомологічного антигену відбувається зв'язування антитіл, тому після додавання сенсибілізованих антигеном еритроцитів їх аглютинації не відбувається, що оцінюється як позитивний результат. Для більшої чутливості реакції специфічну імунну сироватку додають до досліджуваного матеріалу в мінімальній кількості (2 гемагглютинуючі одиниці). Титр імунної сироватки визначають попередньо за допомогою РНГА. За одну гемагглютинуючу одиницю приймають граничне розведення сироватки, яке викликає склеювання еритроцитів.

Методика. У лунки полістиролових пластин або аглютинаційні пробірки вносять по 0,025 мл 1% розчину нормальної сироватки кролика і роблять 2-разові серійні розведення досліджуваного матеріалу. Потім у всі лунки додають по 0,025 мл імунної сироватки, пластинку струшують і залишають на 30 хв при температурі 37 С або на 1 год при кімнатній температурі. Далі у всі лунки додають по 0,025 мл антигенного діагностикуму, струшують і залишають на 2 години, після чого враховують результати.

При проведенні цієї реакції до контролю для РНГА додають контроль специфічності імунної сироватки, що складається зі специфічного антигену, імунної сироватки (2, 1, 0,5 гемагглютинуючої одиниці) та суспензії сенсибілізованих еритроцитів.

РТНГА застосовують також для виявлення специфічних антитіл (повних та блокуючих), для чого до досліджуваної сироватці додають дозовану кількість антигену. Якщо в ній містяться антитіла, відбувається зв'язування їх антигеном, тому після додавання еритроцитів, сенсибілізованих антитілами (2-й етап РТНГА), склеювання еритроцитів не відбувається.

Завдяки використанню мінімальної кількості антигену (2 нейтралізуючі дози) реакція високочутлива. Кількість нейтралізуючих доз антигенного препарату визначають за допомогою РНГА, при цьому роблять серійні 2-кратні розведення антигену в 1% розчині нормальної сироватки кролика і в лунки вносять антильний еритроцитарний діагностикум. Нейтралізуючу дозу антигену вважають його максимальне розведення, що дає повне склеювання сенсибілізованих еритроцитів.

Перед проведенням реакції випробувані сироватки розводять 1:5-1:10 та інактивують при температурі 56°С протягом 30 хв. Для адсорбції гемагглютинінів до сироваток додають 50% завись формалінізованих або свіжих відмитих еритроцитів барана з розрахунку 0,1 мл суспензії на 1 мл розведеної сироватки. Суміш струшують та інкубують 30 хв при температурі 37ºС або 1 год при кімнатній температурі, після чого еритроцити беруть в облогу центрифугуванням. Можна для осадження еритроцитів залишити сироватки у холодильнику до наступного дня.

При проведенні досліду матеріал, що досліджується, розводять в 1% розчині нормальної сироватки кролика в обсязі 0,025 мл в лунках панелі мікротитратора. Потім у кожну лунку додають по 2 нейтралізуючі дози антигену в об'ємі 0,025 мл. Пластини струшують і залишають на 30 хв при температурі 37 ° С або 1 год при кімнатній температурі. Потім у всі лунки вносять по 0,025 мл антитільного еритроцитарного діагностикуму. Пластини струшують та інкубують 1,5-2 години при кімнатній температурі, після чого враховують результати реакції. Облік можна проводити також наступного дня. Титром досліджуваної сироватки вважають максимальне її розведення, в якому не відбувається склеювання еритроцитів.

Досвід супроводжують такими видами контролю:

1) стабільності сенсибілізованих еритроцитів (еритроцити +1% розчин нормальної сироватки кролика);

2) повноти виснаження гемагглютинінів у кожній випробуваній сироватці (випробувана сироватка в найменшому розведенні + формалінізовані еритроцити);

3) правильності визначення мінімальної нейтралізуючої дози антигену (2, 1 та 0,5 нейтралізуючої дози антигену + антильний еритроцитарний діагностикум).

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації (ронга) застосовується для індикації бактеріальних та вірусних антигенів у досліджуваних матеріалах, а також експрес-діагностики ряду інфекцій.

На відміну від РНГА, при даній реакції еритроцити сенсибілізують не антигеном, а антитілами, аглютинація яких відбувається при додаванні антигену.

Еритроцити попередньо фіксують формаліном або глютаральдегідом, а потім пов'язують їх з гамма-глобуліном, який виділяють з імунних сироваток і очищають від інших сироваткових білків. Зв'язування гамма-глобуліну з поверхнею еритроцитів відбувається за допомогою хлориду хрому. Для цього до 8 об'ємів дистильованої води додають 1 об'єм імуноглобулінів, виділених з імунної сироватки, 1 об'єм 50 % суспензії формалінізованих еритроцитів та 1 об'єм 0,1-0,2 % розчину хлориду хрому. Суміш залишають на 10-15 хв при кімнатній температурі, потім обробляють еритроцити як реакції пасивної гемаглютинації.

Специфічність антитільного діагностикуму перевіряють у реакції гальмування пасивної гемаглютиції гомологічним антигеном. Реакція повинна гальмуватися гомологічним антигеном не менше ніж у 16 ​​разів і не гальмуватись гетерологічним. Використовується контроль на відсутність спонтанної гемаглютинації.

За допомогою цієї реакції проводять індикацію збудників у матеріалі, взятому з органів загиблих людей та тварин, наприклад, з мозку, селезінки, печінки легень. Готують 10% суспензію зазначених органів на ізотонічному розчині натрію хлориду, центрифугують їх протягом 30-60 хв при 10000 об/хв і використовують надосадову рідину як антиген.

Методика.Готують 2-кратні розведення досліджуваного матеріалу (антигена) на розчині, що стабілізує. Вносять по 1 краплі кожного розведення антигену в 3 сусідні лунки мікропанелі (реакція займає 3 паралельні ряди лунок). У кожну лунку першого ряду додають по 1 краплі стабілізуючого розчину, лунки другого ряду - по 1 краплі гомологічної імунної сироватки в розведенні 1: 10, третього ряду - по 1 краплі гетерологічної імунної сироватки. Другий та третій ряди служать контролюми специфічності реакції. Суміш залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі.

У всі лунки додають по 1 краплі 1% суспензії сенсибілізованих еритроцитів (антильний еритроцитарний діагностикум) і ретельно струшують пластини. Результати реакції враховують за 30-40 хв. За наявності специфічного антигену гемаглютинація відзначається у першому та третьому ряду (з гетерологічною сироваткою) та відсутня у другому ряду, де антиген попередньо нейтралізований гомологічною сироваткою.

Реакцію супроводжують контролюми сенсибілізованих еритроцитів на спонтанну аглютинацію.

Реакція гальмування зворотної непрямої гемаглютинації (РТОНГА)дозволяє визначити наявність антитіл у сироватках людей та тварин.

Методика. Сироватки розводять в 10 разів ізотонічним розчином натрію хлориду, прогрівають 20 хв при температурі 65 °С для руйнування неспецифічних інгібіторів, а потім готують 2-кратні розведення сироваток на стабілізуючому розчині і робочу дозу антигену, що містить 4 аг. Вносять по 1 краплі кожного розведення сироватки в лунки мікропанелі та додають у них по 1 краплі антигену, розведення якого відповідає робочій дозі. Після контакту компонентів суміші протягом 20 хв при кімнатній температурі всі лунки вносять по 1 краплі еритроцитарного антитільного діагностикуму і ретельно струшують. Через 1,5-2 години інкубації при кімнатній температурі гемаглютинації враховують результати реакції. Титром сироватки є її найбільше розведення, яке повністю гальмує реакцію гемаглютинації з чотирма аглютинуючими одиницями антигену.

Реакцію супроводжують контролюми сенсибілізованих еритроцитів на спонтанну аглютинацію у присутності: а) стабілізуючого розчину; б) нормального антигену (з матеріалу, що не містить вірусу); в) досліджуваної сироватки. Перевага реакції полягає в її універсальності та можливості використання для виявлення різних антигенів.

Оцінка результатів гемаглютинації. Результати РНГА, РОНГА та РТОНГА враховують за рівнем аглютинації еритроцитів: (++++) – повна аглютинація; (+++) – менш повна аглютинація; (++) - часткова аглютинація; (+) – сліди аглютинації; (–) – відсутність аглютинації.

Реакція вважається позитивною, якщо повна аглютинація (++++) або майже повна (+++), діагностикум не дає спонтанної аглютинації в присутності кожного компонента реакції і контроль специфічності антигену або антитіла позитивний.

Ці реакціїназиваються непрямими (пасивними), так як при їх проведенні використовують Аг (або AT) штучно сорбовані на поверхні різних корпускулярних частинок.

Реакція непрямої, чи пасивної, гемаглютинації (РНДА, РПДА) - Одна з найбільш чутливих серологічних реакцій. Заснована на здатності AT взаємодіяти з Аг, фіксованими на різних еритроцитах, які при цьому аглютинують. Для більшої стабільності діагностикумів еритроцити формалінізують.

Зворотня РНДАзастосовується виявлення Аг в сироватці крові; при цьому на еритроцитах фіксуються не Аг, a AT. Реакції цього широко застосовують для діагностики інфекційних хвороб, встановлення вагітності, виявлення підвищеної чутливості до ліків тощо.

Реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА) - подальший розвиток РНДА; у певному сенсі контролює її специфічність. На відміну від РНДАвключає три компоненти; Аг, AT та Аг (AT), адсорбовані на еритроцитах. Спочатку Аг реагує з AT (стандартна антисироватка), потім суміш вносять еритроцити, сенсибілізовані аналогічним Аг (або AT). Якщо при взаємодії Аг із AT у системі не залишаються вільні AT (або Аг), то аглютинації еритроцитарного діагностикуму не спостерігають.