Большая энциклопедия нефти и газа. Реакция преципитации

Реакция преципитации (РП)– это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе . В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Компоненты реакции преципитации.

1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.

2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Получение преципитиногена .

Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.

Примеры преципитиногенов : лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор , в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.

Получение преципитирующих сывороток.

Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.

Примеры преципитирующих сывороток : преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.

Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.

Способы постановки РП.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии : один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата ;

б) метод двойной иммунодиффузии : и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации .

Примером РП в геле являетсяреакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации .

Заключающаяся во взаимодействии растворимого антигена с антителом с последующим выпадением мелкозернистого осадка (преципитата).

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация идет хуже в отсутствие солей. Оптимум преципитации находится в диапазоне рН=7,0-7,4.

Механизм преципитации близок к механизму агглютинации. Под влиянием иммунной , прореагировавшей с антигеном, уменьшается степень его дисперсности. Необходимо, чтобы сыворотка и антиген были совершенно прозрачны. При постановке преципитации можно к одному разведению сыворотки добавлять разные разведения антигена либо наоборот.

Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках диаметром 2,5-3,5 мм. Для определения числа антигенов в исследуемом материале или разных антител в сыворотке пользуются реакцией преципитации в агаре: 1% осветленный агар разливают в или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации. Реакция преципитации широко используется при диагностике (см. Асколи реакция).

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.

В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.

Преципитация - реакция осаждения комплекса антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина). Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител (см.) в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных. При использовании стандартных сывороток реакция преципитации может быть применена для титрования различных по происхождению растворимых антигенов (см.).

При наиболее простой форме постановки реакции преципитации к ряду пробирок с постоянным количеством антигена добавляют подслаиванием исследуемую сыворотку в серии кратных разведений. После 30-60 мин. инкубации при комнатной температуре на границе двух жидкостей образуется кольцо помутнения - кольцепреципитация. Минимальное количество сыворотки, которое дает реакцию преципитации, принимают за титр антисыворотки. При обратной постановке реакции со стандартной антисывороткой удается оценить относительную концентрацию антигена в различных биологических жидкостях.

Результаты титрования антител и антигенов на основании вышеуказанного метода не имеют абсолютного количественного выражения. С целью количественной оценки содержания антител Гейдельбергер, Кабат (М. Heidelberger, Е. Kabat) и др. разработали количественный метод реакции преципитации, в основе которого лежит обнаружение так называемые зоны эквивалентности. При смешивании возрастных количеств антигена с постоянными объемами антисыворотки количество образующегося преципитата первоначально возрастает, а затем вновь снижается из-за увеличения растворимости комплекса антиген - антитело в избытке антигена. Если определить во всех пробирках содержание антител в надосадочной жидкости, то окажется, что в средних пробирках ряда или даже в единственной пробирке антител в надосадочной жидкости нет; вместе с тем здесь же образуется наибольший по величине преципитат. Поскольку в зоне эквивалентности в преципитат вовлекается также весь антиген, введенный в смесь реагирующих веществ, после вычитания из количества белка преципитата белка антигена получают точную величину содержания антител в данном объеме испытуемой сыворотки. Содержание белка преципитата после тщательного промывания охлажденным физиологическим раствором определяют по азоту или каким-либо колориметрическим методом.

При оценке значения реакции преципитации как диагностического метода необходимо учитывать, что в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела, не обладающие свойствами преципитинов и, следовательно, не образующие преципитата при взаимодействии с антигеном. К их числу относятся прежде всего неполные антитела, а также некоторые другие антитела, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов.

Способность антисыворотки преципитировать антиген может быть нарушена нагреванием до 65-70°, обработкой органическими растворителями, восстановлением в кислой среде [Изликер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципитации с антисывороткой, заведомо содержащей преципитины, возможен лишь при определенной температуре, концентрации солей и водородных ионов. Быстрее всего реакция преципитации протекает при 25-37°. Непременное условие образования преципитата - присутствие в изотонических концентрациях хлорида натрия (0,85% раствора NaCl). При увеличении концентрации NaCl до 15% преципитаты, образованные антигеном полисахаридной природы, частично растворяются, чем можно воспользоваться для извлечения чистых антител. Реакция преципитации с антигенами белковой природы протекает с одинаковой скоростью и полнотой как в 0,85%, так и в 15% растворах NaCl. Оптимальная для образования преципитата концентрация водородных ионов соответствует значениям рН от 5,0 до 9,0.

В лабораторной практике находят применение различные модификации реакции преципитации. В частности, реакцию термопреципитации применяют для обнаружения антигенов бактерий сибирской язвы, ботулизма и др., не подвергающихся термической денатурации (коктоантигены). Эта реакция отличается от реакции кольцепреципитации только тем, что в качестве антигена используют фильтрат прокипяченного исследуемого материала (см. А сколи реакция).

При анализе с помощью реакции преципитации сложной смеси антигенов невозможно охарактеризовать свойства отдельных компонентов смеси. Для решения этой задачи прибегают к методам преципитации в агаре и к иммуноэлектрофорезу. Метод преципитации в агаре в наиболее распространенной модификации Оухтерлоню (О. Ouchterlony) основал на том, что антиген и антисыворотка, диффундируя навстречу друг другу в тонком слое агара, образуют при встрече линии преципитации. По числу таких линий можно судить о количестве компонентов, содержащихся в данной смеси антигенов. Метод Оухгерлоню позволяет сравнивать различные антигенные смеси и определять степень родства присутствующих в них компонентов. При анализе сложной антигенной смеси, содержащей вещества с одинаковыми скоростями диффузии в агаре, большую помощь может принести метод иммуноэлектрофореза. Смесь антигенов предварительно разделяют в электрическом поле в пластинке агара, после чего проявляют отдельные компоненты антисывороткой. Антисыворотку вносят в ровик, проделанный в агаре параллельно линии, вдоль которой перемещались при электрофорезе антигены. Каждый из антигенов дает с антисывороткой индивидуальную дугу преципитации. Иммуноэлектрофорез широко применяют для анализа патологических отклонений в белках сывороток, а также при иммунологическом анализе тканевых и бактериальных антигенов.

Преципитация в судебно-медицинском отношении . Преципитация применяется в судебной медицине для установления видовой принадлежности крови, частей органов и тканей. В ряде следственных дел требуется установить видовую принадлежность крови, обнаруженной на орудиях совершения преступления, одежде преступника или жертвы и др. Для реакции преципитации применяют преципитирующие сыворотки, получаемые иммунизацией кроликов, петухов, коз белками разных животных. Обычно изготовляют сыворотки, преципитирующие белок человека, лошади, кошки, курицы, свиньи, собаки, рогатого скота. Они должны обладать титром не ниже 1:10 000 и быть достаточно специфичными. Из исследуемого пятна или корочки крови готовят вытяжки на физиологическом растворе, которые затем испытывают преципитирующими сыворотками. Вид белка считается установленным, если одна из преципитирующих сывороток образует преципитат с вытяжкой из исследуемой крови при соответствующей контрольной реакции. Реакцией преципитации можно установить также вид белка тканей и органов человека или животных. Обычно реакцию преципитации производят в пробирках с конусообразным концом. При получении мутных вытяжек реакцию преципитации производят в агаре по Оухтерлоню.

Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.

Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.

Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.

Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.

РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Механизм

Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата - помутнение.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.

Такие реакции используются для так называемых высокодисперсных антигенов, представляющих собой отдельные молекулы. Основные отличия их от реакций агглютинации заключаются в более медленном (как правило) образовании осадка (преципитата), меньшей его плотности и способности со временем диссоциировать.

Наиболее быстрый вариант (экспресс-метод) преципитации - это реакция кольцепреципитации. Для ее постановки используют специальные узкие пробирки, обычно называемые преципитационными. Небольшой диаметр таких пробирок должен препятствовать смешиванию двух растворов, содержащих соответственно антиген и антитела. Необходимо, чтобы оба раствора были прозрачны и не содержали видимых взвешенных частиц. Сначала в пробирку до половины объема наливают один из растворов, а затем медленно по стенке, не допуская перемешивания с уже налитым раствором, приливают второй в таком же объеме. В результате диффузии молекул антигена и антител будут создаваться меняющиеся соотношения концентраций, и, когда они окажутся эквивалентными, образуется располагающийся на границе двух растворов осадок, обычно имеющий форму кольца, что и дало название реакции. Обычно кольцо образуется в течение 5-15 мин, но затем из-за продолжающейся диффузии концентрации выйдут из зоны эквивалентности, комплексы антиген- антитело начнут диссоциировать и кольцо осадка может исчезнуть. Поэтому учитывать результат такой реакции следует не позже, чем через час после ее постановки, что в целом считается одним из ее недостатков.

С целью избежать диссоциации образующихся осадков были разработаны варианты реакций преципитации в гелях, получившие название реакций иммунодиффузии. Используемые для таких реакций гели чаще всего готовят из агара или агарозы в концентрациях от 1 % до 2 % на веронал-ацетатном буфере с рН 6,8 и ионной силой 0,1. Нагретый гелеобразующий раствор наносят слоем равной толщины на прозрачную стеклянную или пластиковую пластинку или дно чашки Петри и после застывания в геле изготавливают лунки равной глубины и диаметра. В зависимости от варианта реакции в лунки будут вноситься растворы антигенов или антител, при диффузии которых в геле будут создаваться эквивалентные концентрации. Хотя такая диффузия будет происходить медленнее, чем в жидкостях, что удлиняет время протекания реакций, образующиеся в геле осадки сохраняются гораздо большее время. Кроме того, можно улучшить визуализацию результатов проведенной реакции путем обработки гелей раствором связывающихся с белками красителей (например, Кумасси синего).

Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций является двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, расположенные на расстояниях 4-10 мм друг от друга, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и антитела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммунодиффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу. Результаты учитывают каждые 24 часа в течение 6-7 суток. Время образования преципитатов варьирует в зависимости от температуры инкубирования гелей (реакцию можно проводить при +4°С, +18-20°С или +37°С) и от молекулярной массы антигенов.

Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным.

Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини (ил. 48). Для постановки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое образуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими второй компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компонент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в силу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «радиальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки. При этом площадь занятой преципитатом ок

ружности, определяемая по формуле Б = пё , пропорциональна количеству диффундирующего компонента. Измеряя диаметр образованных преципитатом окружностей вокруг каждой из лунок и соотнося полученные величины с построенным заранее по результатам специально проведенного эксперимента графиком соотношения квадрата диаметра и известных концентраций одного из компонентов реакции (калибровочным графиком), можно точно определить концентрацию его в анализируемом растворе. Следует помнить, что условия проведения опытных реакций и реакций, дающих данные для построения калибровочного графика, должны быть полностью идентичными. Только в этом случае полученные в опыте данные можно считать достоверными. Наиболее часто используемыми температурами для проведения такой иммунодиффузии являются +4°С или +18-20°С, время учета результатов - 40-48 часов.

Определенными недостатками преципитации в гелях являются длительность проведения реакций и нечеткость результатов при невысоких концентрациях антигенов. С целью преодолеть эти недостатки во второй половине ХХ века были разработаны методы, сочетающие белковый электрофорез и иммунопреципитацию, которые получили общее название иммуноэлектрофорез (ил. 49). Помимо выигрыша во времени и повышения разрешающей способности такие методы дают возможность более четко отличить белковые антигены, имеющие одинаковые антигенные детерминанты, но отличающиеся по молекулярной массе. Для этого достаточно так называемого обычного иммуноэлектрофореза. Для его постановки изготавливают гель, в котором помимо обычных стартовых лунок готовят также желобок для сыворотки. Желобок располагают между дорожками в направлении от электрода к электроду, т. е. вдоль фронта движения белков. Гель из желобка не удаляют, чтобы не нарушать прохождение электрического тока во время фореза. Сначала в соответствующем буферном растворе проводят электрофорез образцов, анализируемых на присутствие искомого антигена. После снятия электрического поля пластинку геля переносят во влажную камеру, из желобка удаляют гель и вместо него вносят сыворотку или суспензию моноклональных антител. Результаты учитывают после инкубирования геля во влажной камере в течение 12-24 часов. В случае соответствия антигенов и антител в зоне между желобком и дорожками образуются преципитаты в виде дуг, вогнутой стороной направленных в сторону места расположения антигена. Для лучшей визуализации гель прокрашивают красителем, связывающимся с белком. Фактически такой метод является вариантом двойной иммунодиффузии, но имеет большую разрешающую способность и дает существенный выигрыш во времени.

Для некоторых белковых антигенов возможно применить вариант иммуноэлектрофореза, еще в несколько раз ускоряющий процесс. Это так называемый встречный электофорез (электросинерез). Метод основан на том, что различающиеся по аминокислотному составу белки в щелочной среде могут приобретать противоположные заряды и мигрировать при электорофорезе навстречу друг другу. Для проведения такого фореза используют буфер с рН 8,0, а в геле готовят лунки у противоположных концов (у катода и анода соответственно). В одну из лунок вносят антитела, в другую - содержащий антиген раствор. Под действием электрического поля компоненты двигаются гораздо быстрее, чем при обычной диффузии, поэтому преципитаты в центральной части геля будут образовываться в течение 1-3часов. К тому же чувствительность электросинереза приблизительно в 10 раз выше, чем у метода Оухтерлони, т. е. можно обнаруживать антигены, присутствующие в небольших концентрациях. Недостаток метода в том, что он не может быть применим к любым антигенам.

Описанные выше варианты иммуноэлектрофореза позволяют выявить антиген, но не определить его количество. Количественным методом (фактически модификацией иммунодиффузии по Манчини) является так называемый ракетный иммуноэлектрофорез. Для его постановки в охлажденный до 50°С гелеобразующий раствор вносят подогретую до такой же температуры сыворотку с таким расчетом, чтобы она составляла 1-5 % геля, перемешивают и готовят пластинку геля. После внесения в лунки антигенов проводят электрофорез, условия которого подбирают так, чтобы максимально ограничить смещение молекул антител в электрическом поле (чаще всего используют барбиталовый буфер с рН 8,6 и низкое напряжение). Время электрофореза должно обеспечить выход всех молекул антигена из лунки в гель и вхождение их в состав преципитата, обычно это происходит в течение двух часов. Преципитаты в таких условиях образуются в зонах по ходу движения антигена, которые имеют форму вытянутого конуса (ракеты). Длина зоны образования преципитата пропорциональна концентрации антигена, что дает возможность, измерив длину «ракеты» и используя специально построенный калибровочный график, определить количество антигена в пробе.

Вариантом ракетного иммуноэлектрофореза является так называемый перекрестный электрофорез. Для его постановки готовят обычной гель и проводят обычный электрофорез анализируемой пробы. При этом используют одну пробу и лунку располагают у одного из краев пластинки. После проведения электрофореза часть пластинки (около 4/5 от исходного размера) отрезают и удаляют, оставляя только ту часть, в которой находится дорожка первого электрофореза. Затем в ту же камеру заливают гелеобразующий раствор с сывороткой так, чтобы оставшийся участок пластинки объединился с новым, содержащим сыворотку, гелем. Меняют положение пластинки (или электродов) так, чтобы направление движения антигенов было перпендикулярным тому, которое было при первом форезе, и проводят второй форез в условиях, как для ракетного. Учет результатов проводят, как описано выше. В таком варианте результаты могут оказаться более точными, в силу того, что при втором форезе анализируемыми образцами, фактически, оказываются чистые однородные белки.

Описанные выше реакции агглютинации и преципитации были введены в практику еще в конце XIX века и не утратили своего значения до сих пор, но уже в первые годы их применения стало понятно, что их разрешающая способность не всегда удовлетворяет исследователей. В частности, при малых концентрациях того или иного реагента образующиеся комплексы настолько невелики по размерам, что даже с применением микроскопии не могут быть фиксированы исследователем. Поэтому постоянно проводились попытки подобрать условия для более выраженной визуализации результатов взаимодействия антиген- антитело. Одной из успешных попыток стало применение эритроцитов крови в качестве носителей антигена.

В виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген . При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 7.50). Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Рис. 7.50.

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы (рис. 7.51). У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются, у неидентичных - пересекаются.

Рис. 7.51

Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген (Аг) в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена (рис. 7.52). Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Рис. 7.52.

Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации (рис. 7.53).

Рис. 7.53.

Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат. floccus - хлопья шерсти} - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин (рис. 7.54). Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Рис. 7.54.

Штаммы возбудителя дифтерии - С. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре (рис. 7.55).

Рис. 7.55